張 欣，王英杰，豆昕桐，王華忠，岳潔瑜

（天津師范大學(xué) 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

金屬鎘（Cd）是農(nóng)業(yè)土壤中毒性最大、分布最廣泛的污染物之一.Cd在土壤中的移動(dòng)性較強(qiáng)，且半衰期長(zhǎng)，易被植物吸收積累[1].植物過(guò)量吸收Cd易造成植株矮化、葉片褪綠、根長(zhǎng)變短、生物量降低[2-3].Cd在植物體內(nèi)累積會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)的膜系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)被破壞[4]，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，陽(yáng)離子（如鈣、鉀等）發(fā)生置換，進(jìn)而影響金屬離子的穩(wěn)態(tài)[5].Cd脅迫還會(huì)抑制高等植物的光合作用[6].近年來(lái)，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)作為植物光合作用的探針，是研究植物逆境脅迫表型的有力工具之一.測(cè)定植物的葉綠素?zé)晒鈪?shù)能夠?qū)χ参镯憫?yīng)生物與非生物脅迫進(jìn)行有效分析，加快作物耐性的鑒定與篩選[7].Cd對(duì)植物的光系統(tǒng)I（PSI）和光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）均有影響，對(duì)PSⅡ的抑制更為顯著[8].植物遭受Cd脅迫時(shí)，葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化可以反映出Cd對(duì)光合作用的毒性效應(yīng)[9].

Ca2+是一種胞內(nèi)信號(hào)分子，在細(xì)胞內(nèi)以結(jié)合態(tài)或游離態(tài)存在，主要分布于細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、質(zhì)膜及胞質(zhì)中.逆境脅迫會(huì)使細(xì)胞中的活性氧過(guò)度積累，研究發(fā)現(xiàn)活性氧可以調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)膜Ca2+通道的活性或開放程度，表明活性氧對(duì)Ca2+信號(hào)水平能起到調(diào)節(jié)作用[10].在植物細(xì)胞程序性死亡（PCD）過(guò)程中，特別是在細(xì)胞凋亡早期，Ca2+往往表現(xiàn)出急劇增加，由此認(rèn)為Ca2+可能是啟動(dòng)PCD的早期信號(hào)[11].

小麥屬于抗Cd能力較強(qiáng)和Cd積累型作物，幼苗階段是其生活周期的起始階段，對(duì)Cd脅迫較敏感.盡管已有學(xué)者從不同角度研究了Cd脅迫對(duì)小麥生理方面的影響，但不同小麥品種對(duì)Cd脅迫的吸收和耐性存在很大差異[2-3].合適的Cd濃度能夠使各品種小麥幼苗的指標(biāo)變異幅度和變異系數(shù)變大，可獲得較好的鑒定分析效果[12].本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的Cd對(duì)13個(gè)小麥品種幼苗階段的影響不盡相同，濃度為100 μmol/L的Cd能把13個(gè)小麥品種對(duì)Cd的耐性強(qiáng)弱區(qū)分開[13].因此，本研究以100μmol/L的Cd濃度為基準(zhǔn)，設(shè)置 4 個(gè) Cd 濃度（10、50、100、300 μmol/L），通過(guò)水培實(shí)驗(yàn)分別處理2個(gè)Cd適應(yīng)性不同的小麥品種，研究幼苗階段二者對(duì)不同濃度Cd脅迫響應(yīng)的生理變化規(guī)律.研究一方面有助于加深理解作物對(duì)Cd脅迫的適應(yīng)性；另一方面，可以為找到減少小麥Cd損傷的有效措施和提高Cd耐性水平的方法提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)

小麥品種河農(nóng)6425（Henong 6425，Cd敏感型）和92R137（耐Cd型），種子均由天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供.

取大小均勻一致、飽滿、健康無(wú)損傷的小麥種子，清洗后放置于鋪有2層濕潤(rùn)紗布的培養(yǎng)盆中，室溫下蒸餾水培養(yǎng)，間隔12 h換1次水.小麥生長(zhǎng)至一葉期時(shí)將蒸餾水替換成1/10 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).待小麥幼苗長(zhǎng)至一葉一心時(shí)，從中篩選出生長(zhǎng)一致的麥苗，平均分成5組，分別移至Cd濃度為0（對(duì)照組）、10、50、100 和 300 μmol/L 的 1/10 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)，每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液.

1.2 生長(zhǎng)形態(tài)的觀察及生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

在Cd處理小麥幼苗期間，每天觀察幼苗生長(zhǎng)狀況，每隔2 d測(cè)量1次生理指標(biāo).對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組每次均取15株幼苗測(cè)量株高、葉長(zhǎng)以及最長(zhǎng)根長(zhǎng).

1.3 幼苗中Cd含量的測(cè)定

Cd脅迫處理小麥幼苗14 d后，分別收獲對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組幼苗的地上和地下部分.先后用自來(lái)水、蒸餾水和去離子水沖洗干凈，晾干表面水分，分別稱鮮重.108℃下殺青15 min后85℃烘干至恒重，分別稱量干重后，研磨成粉末用于消化分析.消化前分別稱取粉末0.2 g，濃硝酸消化后，用電感耦合等離子發(fā)射光譜法（ICP-AES）（Leeman Labs INC，New Hampshire，USA）測(cè)定Cd在幼苗地上和地下部分器官中的積累量.每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)3次.

1.4 葉綠素?zé)晒馓匦缘臏y(cè)定

利用雙通道調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x（Dual-PAM-100，上海澤泉科技股份有限公司）測(cè)量小麥葉片PSI和PSⅡ的活性變化，葉片暗適應(yīng)20 min后測(cè)量相關(guān)熒光參數(shù)，包括Fv/Fm、YⅡ、qP 和Fv/F0.

1.5 Fluo-8AM檢測(cè)小麥根細(xì)胞中Ca2+的分布

Fluo-8AM熒光指示劑能特異性地與細(xì)胞內(nèi)的Ca2+結(jié)合，被一定波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生熒光，從而檢測(cè)出細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的變化.

具體操作：用100 mmol/L的Cd處理小麥幼苗.分別切取對(duì)照組和Cd處理組的小麥根尖1~2 cm，每個(gè)樣本至少取5株幼苗，放入配置好的Fluo-8AM染色液中，4℃條件下避光孵育2 h.染色完成后，用0.2 mmol/L的CaCl2溶液漂洗3次，25℃條件下避光放置2 h.染色結(jié)束后，用正置熒光顯微鏡（Leica DM50003）在避光條件下進(jìn)行觀察并拍照.

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析方法

采用Excel 2007和IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Cd脅迫對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響

用不同濃度的Cd溶液處理92R137和河農(nóng)6425的小麥幼苗，每2 d測(cè)量1次小麥的生長(zhǎng)指標(biāo)，0～8 d內(nèi)2個(gè)小麥品種株高、葉長(zhǎng)和最長(zhǎng)根長(zhǎng)生長(zhǎng)情況分別如表1、表2和表3所示，Cd處理14 d后小麥幼苗生長(zhǎng)情況及變異系數(shù)如表4所示.

表1 不同濃度Cd處理下2個(gè)小麥品種幼苗的株高Tab.1 Seedling height of two wheat cultivars treated with different concentrations of Cd cm

表2 不同濃度Cd處理下2個(gè)小麥品種幼苗的葉長(zhǎng)Tab.2 Leaf length of two wheat cultivars treated with different concentrations of Cd cm

表3 不同濃度Cd處理下2個(gè)品種小麥幼苗的最長(zhǎng)根長(zhǎng)Tab.3 The longest root length of two wheat cultivars treated with different concentrations of Cd cm

表4 不同濃度Cd處理14 d后小麥幼苗的生長(zhǎng)情況及變異系數(shù)Tab.4 Growth of two wheat cultivars and coefficient of variation treated with different concentrations of Cd after 14 days

由表1、表2和表3可以看出，與對(duì)照組相比，不同濃度的Cd處理均會(huì)抑制小麥的株高、葉長(zhǎng)和最長(zhǎng)根長(zhǎng)的生長(zhǎng)，Cd毒性效應(yīng)明顯.隨著Cd處理濃度的增加，2個(gè)小麥品種幼苗的株高、葉長(zhǎng)和最長(zhǎng)根長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)，且培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)下降幅度越大.2個(gè)小麥品種在10 μmol/L Cd處理下，前期長(zhǎng)勢(shì)良好，Cd處理6 d后生長(zhǎng)緩慢；Cd濃度高于50 μmol/L時(shí)，處理4 d后生長(zhǎng)緩慢.比較2個(gè)小麥品種，同一Cd處理濃度下同一時(shí)刻92R137的長(zhǎng)勢(shì)好于河農(nóng)6425.

本研究用變異系數(shù)衡量一個(gè)性狀能否作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)篩選相應(yīng)指標(biāo)，變異系數(shù)越大，該指標(biāo)越靈敏.在10 μmol/L Cd處理下，與對(duì)照組相比，92R137和河農(nóng)6425株高的變異系數(shù)分別下降了7.26%和8.69%，葉長(zhǎng)變異系數(shù)分別下降了5.97%和8.42%，最長(zhǎng)根長(zhǎng)變異系數(shù)分別下降了11.7%和12.57%.在50 μmol/L Cd處理下，2個(gè)品種小麥生長(zhǎng)被抑制，生長(zhǎng)緩慢，與對(duì)照組小麥相比，92R137和河農(nóng)6425株高變異系數(shù)分別下降了12.75%和19.61%，葉長(zhǎng)變異系數(shù)分別下降了10.26%和18.47%，最長(zhǎng)根長(zhǎng)變異系數(shù)分別下降了25.5%和26.72%.在100 μmol/L Cd處理下，與對(duì)照組小麥相比，92R137和河農(nóng)6425株高變異系數(shù)分別下降了15.72%和23.63%，葉長(zhǎng)變異系數(shù)分別下降了12.89%和22.63%，最長(zhǎng)根長(zhǎng)變異系數(shù)分別下降了26.73%和27.56%.在300 μmol/L Cd處理下，與對(duì)照組小麥相比，92R137和河農(nóng)6425株高變異系數(shù)分別下降了17.7%和24.07%，葉長(zhǎng)變異系數(shù)分別下降了14.02%和23.54%，最長(zhǎng)根長(zhǎng)變異系數(shù)分別下降了28.53%和28.33%.這說(shuō)明最長(zhǎng)根長(zhǎng)最適宜作為不同小麥品種耐Cd能力的篩選指標(biāo).

使用Duncan多重比較法對(duì)比2個(gè)小麥品種在Cd處理14 d后的生長(zhǎng)變化.各個(gè)濃度Cd處理組中的2個(gè)小麥品種與對(duì)照組小麥間均有顯著差異（P＜0.05）.92R137小麥的最長(zhǎng)根長(zhǎng)在Cd濃度為100 μmol/L和300 μmol/L時(shí)無(wú)顯著差異（P＞0.05）；河農(nóng) 6425小麥的最長(zhǎng)根長(zhǎng)在Cd濃度為50、100和300μmol/L時(shí)均無(wú)顯著差異（P＞0.05）.

2.2 不同濃度Cd脅迫對(duì)小麥幼苗含水量的影響

植株含水量能在一定程度上反映植物對(duì)Cd的耐受性[16].2個(gè)小麥品種幼苗在不同濃度的Cd處理14 d后，地上和地下部分的含水量如圖1所示.由圖1可以看出，隨著Cd濃度的增加，2個(gè)小麥品種幼苗的地上和地下部分含水量均逐漸降低，河農(nóng)6425地上和地下部分的含水量均低于92R137相應(yīng)部位的數(shù)值.

圖1 不同濃度Cd脅迫14 d后小麥幼苗不同部位的含水量Fig.1 Water content in different part of wheat seedlings treated with various concentrations of Cd after 14 days

2.3 不同濃度Cd脅迫下小麥幼苗的Cd含量與轉(zhuǎn)移系數(shù)

不同濃度Cd處理14 d后，小麥幼苗不同部位的Cd含量如圖2所示.由圖2可以看出，92R137小麥植株在各處理濃度中的Cd含量均高于河農(nóng)6425.在小麥根部，2個(gè)小麥品種均在10 μmol/L Cd處理濃度下就達(dá)到了較高的吸收量，Cd處理濃度為50 μmol/L時(shí)，根部Cd吸收量顯著降低，隨著Cd處理濃度的進(jìn)一步增加，根部的Cd吸收量又呈增加趨勢(shì).在地上部分，2個(gè)小麥品種的Cd吸收量均隨著Cd處理濃度的增加呈上升趨勢(shì).

圖2 不同濃度Cd脅迫14 d后小麥幼苗不同部位的Cd含量Fig.2 Cd content in different part of wheat seedlings treated with different concentrations of Cd after 14 days

2個(gè)小麥品種對(duì)Cd的轉(zhuǎn)移系數(shù)有明顯差異，如圖3所示.

圖3 不同濃度Cd脅迫14 d后小麥幼苗的Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)Fig.3 Cd transfer coefficient of wheat seedlings treated with different concentrations of Cd after 14 days

由圖3可以看出，92R137的Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)在各個(gè)Cd處理濃度下均高于河農(nóng)6425小麥的數(shù)值.Cd處理濃度為10 μmol/L時(shí)2個(gè)品種的轉(zhuǎn)移系數(shù)差異不顯著，隨著Cd處理濃度的增加，差異逐漸增大.92R137小麥的轉(zhuǎn)移系數(shù)隨Cd處理濃度的增加一直呈增加趨勢(shì)，而河農(nóng)6425小麥的轉(zhuǎn)移系數(shù)在高濃度Cd處理下有所降低.

2.4 不同濃度Cd脅迫對(duì)小麥葉片光合特性的影響

不同濃度Cd處理下，2個(gè)小麥品種幼苗的葉綠素?zé)晒鈪?shù)如圖4所示.

圖4 不同濃度Cd處理下2個(gè)小麥品種的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fig.4 Chlorophyll fluorescence parameters of two wheat cultivars treated with different concentrations of Cd

由圖4可以看出，Cd處理濃度≤10 μmol/L時(shí)，2個(gè)小麥品種的Fv/Fm和Fv/F0均相近，且不會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生明顯變化，YⅡ和qP在培養(yǎng)后期則顯著下降.Cd處理濃度為50 μmol/L時(shí)，2個(gè)小麥品種的Fv/Fm和Fv/F0均不會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生劇烈變化，YⅡ和qP則隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)急劇下降.Cd處理濃度＞50 μmol/L 時(shí)，F(xiàn)v/Fm和Fv/F0在培養(yǎng)6 d后出現(xiàn)下降，YⅡ和qP則在培養(yǎng)2 d后就顯著下降.總的來(lái)看，低濃度Cd處理時(shí)2個(gè)小麥品種的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化幅度較小，高濃度Cd處理時(shí)YⅡ和qP隨著處理濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)急劇下降，且河農(nóng)6425的變化幅度高于92R137的變化幅度.

2.5 Cd脅迫下小麥根細(xì)胞Ca2+分布的檢測(cè)

用濃度為100 μmol/L的Cd處理2個(gè)小麥品種幼苗，根尖中的Ca2+分布情況如圖5所示.

圖5 Cd處理下2個(gè)小麥品種根尖中Ca2+的分布（標(biāo)尺為1cm）Fig.5 Ca2+distribution of root tips in two wheat varieties treated with Cd(scale is 1 cm）

由圖5可以看出，正常小麥根尖有少量的Ca2+均勻分布，Cd處理后小麥根尖Ca2+隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，積累于分生區(qū).92R137小麥根尖的熒光亮度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，即Ca2+水平逐漸上升；河農(nóng)6425小麥根尖Ca2+積累的速率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸加快，Cd處理20 min時(shí)Ca2+水平明顯高于92R137的水平.這說(shuō)明Ca2+作為信號(hào)分子參與了小麥響應(yīng)Cd脅迫的過(guò)程.

3 討論與結(jié)論

本研究以Cd敏感型小麥品種河農(nóng)6425和耐Cd型品種92R137為實(shí)驗(yàn)材料，比較分析了2個(gè)小麥品種在遭遇Cd脅迫時(shí)做出的生長(zhǎng)和生理響應(yīng).孟桂元等[17]認(rèn)為，植物的發(fā)芽期和苗期由于防御系統(tǒng)尚未完全建立，是對(duì)Cd脅迫比較敏感的時(shí)期，因此本研究選用幼苗期小麥進(jìn)行Cd脅迫實(shí)驗(yàn).植物生長(zhǎng)在受到Cd脅迫后，生長(zhǎng)指標(biāo)最先發(fā)生變化，如根、莖、葉等組織的生物量都會(huì)受到影響[17].本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組小麥相比，Cd脅迫處理組中小麥幼苗的株高、葉長(zhǎng)、最長(zhǎng)根長(zhǎng)等均有不同程度的下降.Cd處理濃度越大小麥?zhǔn)蹸d脅迫的抑制效應(yīng)越明顯.從表型性狀受抑制的程度和植株含水量來(lái)看，92R137對(duì)Cd脅迫的適應(yīng)性強(qiáng)于河農(nóng)6425.由變異系數(shù)的對(duì)比結(jié)果可知，各生長(zhǎng)指標(biāo)的變異系數(shù)差異顯著，其中最長(zhǎng)根長(zhǎng)的變化幅度最大，說(shuō)明最長(zhǎng)根長(zhǎng)最適合作為不同小麥品種耐Cd能力的篩選指標(biāo).

Cd脅迫下，小麥根和葉中的Cd含量均隨著處理濃度的增加而上升，且根中的含量大于葉片中的含量，說(shuō)明根部是小麥積累重金屬Cd的主要器官，這與張大眾等[3]的研究結(jié)果一致.不同基因型小麥富集和轉(zhuǎn)移Cd的能力也不盡相同，基因型92R137耐Cd能力較強(qiáng)，且地上部積累的Cd離子濃度較高，表明92R137小麥能有效吸收培養(yǎng)液中的Cd離子并轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部.這與劉翔宇等[18]研究不同基因型狗牙根耐Cd及Cd富集特性的結(jié)果一致.當(dāng)不同濃度Cd處理小麥幼苗14 d時(shí)，92R137的轉(zhuǎn)移系數(shù)高于河農(nóng)6425，轉(zhuǎn)移系數(shù)高表明植物在重金屬Cd脅迫下可能存在較好的運(yùn)輸和解毒機(jī)制，可利用自身的解毒機(jī)制減少Cd產(chǎn)生的危害，這與顧翠花等[14]的研究結(jié)論一致.

Cd脅迫會(huì)抑制植物碳同化和電子傳遞，導(dǎo)致植物的光合能力下降.光合作用中光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）是逆境下敏感脆弱的部位之一.利用葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)方法可以快速、靈敏、無(wú)損傷地研究和探測(cè)各種逆境對(duì)PSⅡ的影響.本研究結(jié)果表明，Cd濃度低于50 μmol/L時(shí)，F(xiàn)v/Fm、Fv/F0、YⅡ、qP 均無(wú)顯著變化，表明低濃度 Cd 脅迫下小麥光反應(yīng)是正常的.Cd濃度高于50 μmol/L時(shí)，這些參數(shù)均隨著Cd脅迫濃度的增大和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低.王瑞波[7]的研究也表明Cd脅迫會(huì)抑制小麥PSⅡ的光化學(xué)活性.比較2個(gè)小麥品種，92R137葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化幅度低于河農(nóng)6425，表明92R137在Cd脅迫下耗散過(guò)剩光能的能力和光保護(hù)能力均較強(qiáng).

Ca2+對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及外界信號(hào)響應(yīng)具有重要調(diào)控作用[19].Cd脅迫能夠誘導(dǎo)Ca2+水平在30 min內(nèi)迅速升高，這與楊振[20]在擬南芥中的研究結(jié)論相同.趙鳳命等[21]的研究證明，Ca2+含量的升高參與了凋亡早期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡的執(zhí)行階段.因此，Cd脅迫誘導(dǎo)Ca2+水平變化可能在細(xì)胞程序性死亡早期活性氧的產(chǎn)生中起重要作用，使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡.Cd脅迫能夠誘導(dǎo)2個(gè)小麥品種根尖的Ca2+水平在短期內(nèi)迅速升高，92R137小麥根尖Ca2+水平隨時(shí)間勻速增加，熒光亮度逐漸增強(qiáng)，河農(nóng)6425小麥根尖Ca2+積累速率逐漸加快，Cd處理20 min時(shí)Ca2+水平明顯高于92R137中Ca2+的水平.

總的來(lái)看，Cd脅迫顯著抑制了小麥的生長(zhǎng).Cd適應(yīng)性強(qiáng)的品種92R137小麥幼苗的Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)高，葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm、Fv/F0、YⅡ、qP）高于 Cd 適應(yīng)性差的品種河農(nóng)6425.由于小麥對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)還涉及到小麥吸收和累積Cd、抗氧化酶保護(hù)、基因調(diào)控等過(guò)程，因此本課題組后續(xù)將進(jìn)一步研究小麥整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期以及土壤環(huán)境下小麥的耐Cd脅迫反應(yīng)機(jī)制.