李 雙，湯嘉玉，王自豪，黃光云，滕少花，曹艷紅，雷初朝，孫俊麗*

(1.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所,廣西家畜遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530001；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

家養(yǎng)水牛是熱帶亞熱帶地區(qū)的重要家畜，可以為人類提供奶、肉、皮等。根據(jù)形態(tài)特征、行為習(xí)性、染色體核型等可以將家養(yǎng)水牛分為沼澤型(2n= 48)和江河型水牛(2n=50)兩個類型[1-2]。沼澤型水牛多為役用，主要分布在中國南方、東南亞等地區(qū)，而江河型水牛多為乳用，主要分布在南亞、地中海和南歐等地區(qū)[2-3]。尼里-拉菲水牛是世界上優(yōu)良的江河型水牛品種之一，原產(chǎn)于巴基斯坦旁遮普省中部，于1974年引入我國[4]。摩拉水牛是世界著名的江河型乳用水牛品種，原產(chǎn)于印度，于1957年引入我國[4]。

線粒體是真核生物細胞中極其重要的細胞器，同時也是重要的遺傳信息載體。哺乳動物的線粒體DNA(mtDNA)是一個雙鏈閉合的環(huán)狀DNA分子，約16.5 kb，無組織特異性，具有遵循母系遺傳、結(jié)構(gòu)簡單穩(wěn)定、無重組、進化速度快等特點，在母系遺傳多樣性、系統(tǒng)進化、群體遺傳學(xué)等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[5]。線粒體DNA的進化速率比單拷貝核DNA高5～10倍，且線粒體DNA D-loop區(qū)的進化速率又比其他區(qū)域高5～10倍。和其他哺乳動物一樣，水牛的mtDNA是由37個蛋白編碼基因和一段910 bp的D-loop區(qū)組成[6]。近年來，采用mtDNA序列已開展了一些水牛品種的遺傳特征和群體遺傳變異研究，結(jié)果表明沼澤型水牛與江河型水牛是獨立馴化而來，其中，沼澤型水牛mtDNA分為兩個主要支系(SA與SB)及3個稀有支系(SC、SD、SE)，而江河型水牛mtDNA分為3個支系：R1、R2、R3[7-11]。

本研究主要對引入廣西南寧的尼里-拉菲水牛和摩拉水牛mtDNA D-loop區(qū)序列進行PCR擴增與測序，以分析廣西南寧的尼里-拉菲水牛和摩拉水牛的遺傳多樣性及其與沼澤型水牛的雜交情況。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從廣西南寧采集52個江河型水牛血樣(尼里-拉菲水牛25個，摩拉水牛27個)。從GenBank下載20條尼里-拉菲水牛D-loop序列(其登錄號為：KR008567-KR008586)和23

條摩拉水牛D-loop序列(其登錄號為：AF197209-AF197211、AF197213、AF197215-AF197217、AF475204-AF475210、AF475212-AF475218、AY195591-AY195592)。

1.2 水?；蚪MDNA提取及PCR擴增測序

采用酚-氯仿法提取基因組DNA。采用雷初朝等[12]設(shè)計的水牛引物擴增線粒體DNA D-loop全序列,正鏈引物和反鏈引物分別為：F:5’-TAGTGCTAATACCAACGGCC-3’；R:5’-AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3’。PCR反應(yīng)體系總體積為12.5 μL，擴增程序為：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將符合測序要求的PCR產(chǎn)物送至西安擎科澤西生物科技有限責任公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析方法

利用DNASTAR軟件包中的SeqMan程序?qū)π蛄羞M行人工校對，以確保所測序列的準確性；用DNASP5.0計算單倍型多樣度、核苷酸多樣度等；用分子進化遺傳分析軟件MEGA5.0構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性

本研究分析的95頭江河型水牛(尼里-拉菲水牛45頭，摩拉水牛50頭)mtDNA D-loop全序列長度在910～918 bp之間，這種長度變化主要是由于存在插入缺失而導(dǎo)致的。尼里-拉菲水牛和摩拉水牛mtDNA D-loop全序列由A、T、G、C四種堿基組成，其中A堿基含量最高(31.2%)，其次為T(28.5%)和C(25.5%)，G堿基含量最低，僅為14.8%。A+T的平均含量為59.7%，G+C的平均含量為40.3%，A+T的平均含量明顯高于G+C，表現(xiàn)出堿基的偏好性。

對這95頭水牛mtDNA D-loop全序列進行比對，共檢測到112個變異位點，包括105個轉(zhuǎn)換，7個顛換。這112個變異位點定義42種單倍型(圖1)，其中，有16個單倍型(共包含21個體)屬于沼澤型支系，有26個單倍型(包含74個體)屬于江河型支系。尼里-拉菲水牛單倍型多樣度(Hd±SD)為0.932±0.020，核苷酸多樣度(Pi±SD)為0.0258±0.0045，平均核苷酸差異(k)為23.377；摩拉水牛單倍型多樣度(Hd±SD)為0.958±0.016，核苷酸多樣度(Pi±SD)為0.0303±0.0041，平均核苷酸差異(k)為26.86。由于尼里-拉菲水牛、摩拉水牛均為典型的江河型水牛，因此，去掉這兩個水牛品種中檢測到的屬于沼澤型水牛個體，對其單倍型多樣度(Hd±SD)、核苷酸多樣度(Pi±SD)、平均核苷酸差異(k)進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，尼里-拉菲水牛單倍型多樣度(Hd±SD)為0.929±0.017，核苷酸多樣度(Pi± SD)為0.0084±0.0013，平均核苷酸差異(k)為7.67；摩拉水牛單倍型多樣度(Hd±SD)為0.934±0.027，核苷酸多樣度(Pi±SD)為0.0064±0.0009，平均核苷酸差異(k)為5.69。

圖1 尼里-拉菲水牛和摩拉水牛mtDNA D-loop單倍型的多態(tài)位點

2.2 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

利用MEGA5.0軟件對95頭尼里-拉菲水牛和摩拉水牛mtDNA D-loop序列組成的42個單倍型進行系統(tǒng)發(fā)育分析，以已發(fā)表的已知支系的水牛序列(R1、R2、R3、SA、SB)作為參考，以家牛序列作為外群，構(gòu)建水牛的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2可以看出，NJ系統(tǒng)發(fā)育樹將水牛分為江河型水牛和沼澤型水牛兩大支系。江河型水牛包含3個支系：R1、R2、R3，沼澤型水牛包含SA和SB 2個支系。

3 討論

本文共分析了45頭尼里-拉菲水牛和50頭摩拉水牛的mtDNA D-loop區(qū)全序列，其4種堿基的含量分別為：A(31.2%)、T(28.5%)、C(25.5%)、G(14.8%)，表現(xiàn)出堿基的偏好性，這是一般多細胞動物mtDNA的顯著特征[13]。A+T平均含量為59.7%，G+C的平均含量為40.3%，A+T的平均含量明顯高于G+C，在綿羊[14]、山羊[15]、牦牛[16]、豬[17]、雞[18]等的研究結(jié)果也表明，mtDNA D-loop區(qū)的A+T含量高于G+C含量，說明動物 mtDNA D-loop區(qū)的核苷酸含量在物種間有一定的相似性。

NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果顯示，水牛分為江河型水牛和沼澤型水牛兩大支系(圖2)。江河型水牛支系包含3個支系26個單倍型74個個體，占水牛樣本的77.9%(74/95)，其中，R1支系包括21個單倍型，代表64個個體，占67.37%；R2支系包括3個單倍型，代表3個個體，占3.16%；R3支系包括2個單倍型，代表7個個體，占7.37%。沼澤型水牛支系包含16個單倍型21個個體, 占水牛樣本的22.1%(21/95)，其中SA支系包括11個單倍型，共15個個體，占15.79%；SB支系包含5個單倍型，共6個個體，占6.32%。所有21個沼澤型水牛mtDNA均來自本研究所采集的52個水牛樣本，占所采集樣本的40.38%，說明在廣西南寧采集的52個尼里-拉菲水牛和摩拉水牛樣本中，從外貌上看，純種的尼里-拉菲水牛和摩拉水牛，與中國沼澤型水牛雜交后代已經(jīng)很難鑒定，引入廣西南寧的尼里-拉菲水牛和摩拉水牛與中國的沼澤型水牛存在廣泛的血緣混雜現(xiàn)象。

圖2 尼里-拉菲水牛和摩拉水牛 mtDNA D-loop單倍型的NJ樹

尼里-拉菲水牛和摩拉水牛是世界上優(yōu)良的江河型水牛品種，分別于1974、1957年引入我國，主要用于改善當?shù)卣訚尚退５漠a(chǎn)奶性能。而本研究在這兩個水牛品種中均檢測到沼澤型水牛的mtDNA支系，這是由于這兩種水牛引入我國后，與當?shù)氐恼訚尚退ｋs交導(dǎo)致的。單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)是衡量一個群體mtDNA 變異程度的重要指標[19]，單倍型多樣度和核苷酸多樣度的值越大，說明群體的遺傳多樣性越豐富，反之，則說明群體的遺傳多樣性越缺乏。去掉屬于沼澤型水牛支系的個體后，計算尼里-拉菲水牛和摩拉水牛的遺傳參數(shù)，結(jié)果表明摩拉水牛的遺傳多樣性(Hd: 0.934±0.027)與尼里-拉菲水牛的遺傳多樣性(Hd: 0.929±0.017)都很豐富，說明引入中國的尼里-拉菲水牛和摩拉水牛的遺傳來源比較廣泛。