陳可可 李瑞 李彤彤 程立琴 顧天賜 葉金云 明建華

摘要 ? ?在青魚幼魚飼料中添加不同劑量的還原型谷胱甘肽（GSH），研究其對青魚生長、非特異性免疫與抗氧化能力以及腸道消化酶活性的影響。結(jié)果表明，與CK相比，在飼料中添加GSH，能顯著提高青魚增重率、特定生長率和成活率，以及血清中總蛋白、溶菌酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性水平，增加補體C3、補體C4的含量;在飼料中添加GSH對青魚肝臟中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶活性和GSH含量，以及腸道中胰蛋白酶、淀粉酶等活性水平有促進作用;在飼料中添加GSH對青魚幼魚肝體指數(shù)、臟體指數(shù)、肥滿度以及腸道脂肪酶活性無顯著影響;在飼料中添加GSH可顯著降低飼料系數(shù)和肝臟中丙二醛含量。由此可見，在飼料中添加適宜的GSH能促進青魚幼魚的生長，提高魚體非特異性免疫力和抗氧化能力，增強青魚幼魚腸道消化酶活性。經(jīng)過增重率的回歸分析，青魚幼魚飼料中GSH最適含量為431.5 mg/kg。

關(guān)鍵詞 ? ?青魚;谷胱甘肽;生長特性;非特異性免疫;抗氧化能力;酶活性

中圖分類號 ? ?S965.11 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）20-0182-04 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

谷胱甘肽（glutathione，GSH），通常是指還原型谷胱甘肽，其是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的三肽物質(zhì)[1]。谷胱甘肽能參與機體自由基清除、解毒、物質(zhì)吸收、細胞生長、細胞免疫及DNA生物合成等，對魚類的促生長、增強抗氧化應激能力以及解毒能力有著重要作用[2]。另外，GSH作為解毒酶—谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）的作用底物，參與機體的解毒作用，能夠與毒素結(jié)合形成一種新的可溶性物質(zhì)，使毒素的毒性大幅降低[3]。

青魚（Mylopharyngodon piceus Richardson），又名青鯇、黑鯇、螺螄青等，是我國傳統(tǒng)養(yǎng)殖的四大家魚之一。據(jù)《2017中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》報道，我國2017年青魚養(yǎng)殖產(chǎn)量為6.2×108萬t，作為一種優(yōu)質(zhì)淡水魚，青魚養(yǎng)殖產(chǎn)量還有逐年上升的趨勢[4]。本文采用含有不同劑量的還原型谷胱甘肽飼料飼喂青魚幼魚，探討還原型谷胱甘肽對青魚生長的影響，以期為青魚的配合飼料開發(fā)和綠色健康養(yǎng)殖提供參考。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

青魚幼魚，購自湖州吳興豐溢現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖場。谷胱甘肽（GSH），購自美國AMRESCO公司，純度≥98%。

1.2 ? ?基礎(chǔ)飼料配制

試驗以進口魚粉、豆粕、菜籽粕為主要蛋白源，面粉為主要糖源，豆油為主要脂肪源，配成基礎(chǔ)飼料，詳細日糧配方如表1所示。營養(yǎng)成分為89.91%干物質(zhì)、34.96%粗蛋白、5.78%粗脂肪、8.75%粗灰分，總能達17.34 MJ/kg。飼料原料經(jīng)過粉碎后過60目篩，采用逐級擴大的方法添加微量成分，將谷胱甘肽溶于水，混入各組分中，充分混勻后，使用小型飼料造粒機將飼料制成粒徑為2 mm的沉性顆粒飼料，40 ℃烘干后冷卻裝于密封袋中，于4 ℃冰柜中保存待用。

1.3 ? ?試驗方法

試驗共設(shè)6個處理，分別為在基礎(chǔ)飼料添加0、100、200、400、600和800 mg/kg的GSH，分別標記為 G0、G100、G200、G400、G600和G800，以在飼料中添加0 mg/kg的GSH為對照（CK）。飼料中GSH含量的實測值為 15.16、110.34、213.32、406.51、603.45、796.72 mg/kg。青魚幼魚正式試驗前先暫養(yǎng)7 d，選630尾體質(zhì)健壯、規(guī)格和體質(zhì)量基本一致的青魚幼魚，初體質(zhì)量為（12.55±0.42）g，隨機將青魚分成6組，每組設(shè)3個重復，分別飼養(yǎng)于浙江省湖州師范學院生命科學學院浙江省重點實驗室室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的18個養(yǎng)殖桶內(nèi)，每桶放養(yǎng)35尾魚。

1.4 ? ?飼養(yǎng)管理

試驗采用飽食投喂，每天投喂2次（8：00、16：00），并根據(jù)攝食和生長情況適當調(diào)整，以每次投飼后無殘餌為宜。水源為經(jīng)過曝氣的自來水，養(yǎng)殖桶每天換水1次，每次換水1/3，每天吸污1次，日夜連續(xù)充氣增氧。飼養(yǎng)試驗中，前期馴化7 d，后期正式養(yǎng)殖60 d。飼養(yǎng)期間水溫24～28 ℃、pH值6.9～7.8、氨氮<0.05 mg/L、溶氧>5 mg/L以及硫化氫<0.01mg/L。

1.5 ? ?樣品采集

青魚幼魚正式飼養(yǎng)60 d后進行采樣，采樣前禁食24 h。每桶魚計數(shù)，每桶隨機選3尾體質(zhì)量相近的青魚幼魚，快速深度麻醉使用濃度為100 mg/L的MS-222，經(jīng)稱重和測量體長后，使用一次性醫(yī)用注射器從幼魚尾靜脈采血。血樣在4 ℃冰箱中靜置1～2 h后，以4 ℃ 3 000 r/min離心10 min制備血清，在-80 ℃條件下凍存?zhèn)溆谩ｔ~體采血后立即剖開腹腔，剝離內(nèi)臟和肝胰臟并稱重，取適量肝臟和腸道用于檢測分析，并在-80 ℃條件下保存。

1.6 ? ?指標測定

1.6.1 ? ?生長與形體指標。增重率（WGR）、特定生長率（SGR）、餌料系數(shù)（FCR）、成活率（SR）、肝體指數(shù)（HSI）、臟體指數(shù)比（VSI）、肥滿度（CF）分別按以下公式計算：

增重率（%）=（Wt-W0）/W0×100;

特定生長率（%）=（lnWt-lnW0）/t×100;

飼料系數(shù)=FI/（Wt-W0）;

成活率（%）=Nt/N0×100;

肝體指數(shù)（%）=Wh/Wb×100;

內(nèi)臟比（%）=Wv/Wb×100;

肥滿度（%）=Wb/L3×100。

式中，Wt為魚末體質(zhì)量，g;W0為魚初體質(zhì)量，g;t 為飼喂天數(shù)，d;FI為每尾魚平均攝食飼料總量（風干樣重），g;N0為初魚尾數(shù);Nt為末魚尾數(shù);Wh為每尾魚末肝臟重，g;Wv為每尾魚末內(nèi)臟重，g;Wb為每尾魚末體質(zhì)量，g;L為每尾魚末體長，cm。

1.6.2 ? ?血清生化指標的測定。血清中溶菌酶（LSZ）、堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）、補體C3、補體C4、皮質(zhì)醇（COR）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和葡萄糖（GLU）等的水平按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行測定。

1.6.3 ? ?肝臟抗氧化相關(guān)指標的測定。肝臟中總蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、過氧化氫酶（CAT）、GSH和丙二醛（MDA）等的水平按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行測定。

1.6.4 ? ?腸道生化指標的測定。腸道中總蛋白、胰蛋白酶（Trypsin）、淀粉酶（Amylase）和脂肪酶（Lipase）的水平等按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行測定。

1.7 ? ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理的單因素方差分析和Tukey多重比較。試驗結(jié)果以平均值±標準差（Means±SD）表示。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?飼料中添加GSH對青魚生長性能的影響

從表2可以看出，當飼料中GSH添加量實測值為406.51 mg/kg時，與CK相比，青魚幼魚的增重率、特定生長率和成活率均顯著提高（P<0.05）;其他處理飼料系數(shù)較CK顯著下降（P<0.05）。各處理的青魚肝體指數(shù)、臟體指數(shù)和肥滿度與CK差異不顯著（P>0.05）。通過回歸分析，得到青魚增重率與飼料中GSH含量的關(guān)系為y=-0.000 4x2+0.345 2x+271.25，R2=0.970 4（y表示增重率，x表示飼料GSH含量），其擬合曲線圖1所示。當飼料中GSH含量實測值為431.5 mg/kg時，青魚將獲得最大的增重率。

2.2 ? ?飼料中添加GSH對青魚血清非特異性免疫指標的影響

從表3可以看出，飼料中添加GSH對青魚血清非特異性指標均產(chǎn)生影響。當飼料中GSH含量實測值為406.51 mg/kg時，青魚幼魚血清中堿性磷酸酶、總蛋白、超氧化物歧化酶、溶菌酶、補體C3、補體C4的含量等均較CK顯著提高（P<0.05）;當飼料中GSH含量實測值為796.72 mg/kg時，總蛋白、堿性磷酸酶、補體C3、補體C4與CK差異不顯著（P>0.05）。

2.3 ? ?飼料中添加GSH對青魚肝臟抗氧化指標的影響

從表4可以看出，當飼料中GSH含量實測值為406.51 mg/kg時，青魚肝臟中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶和GSH含量均較CK顯著升高（P<0.05），丙二醛含量較CK顯著降低（P<0.05）;當飼料中GSH含量實測值為796.72 mg/kg時，各處理中的上述指標變化差異不顯著。

2.4 ? ?飼料中添加GSH對青魚腸道消化酶活性的影響

從表5可以看出，當飼料中GSH含量實測值為406.51 mg/kg時，青魚腸道中胰蛋白酶活性、淀粉酶活性均顯著高于CK（P<0.05）;當飼料中GSH含量實測值為796.72 mg/kg時，青魚的上述指標變化與CK差異不顯著。各處理青魚幼魚腸道脂肪酶活性與CK差異均不顯著（P>0.05）。

3 ? ?結(jié)論與討論

3.1 ? ?飼料中添加GSH對青魚生長的影響

本試驗結(jié)果表明，飼料中添加一定量的還原型谷胱甘肽能顯著提高青魚的特定生長率、增重率和成活率，顯著降低飼料系數(shù)，從而改善青魚的生長性能。以增重率為指標，青魚飼料中GSH最適添加量實測值為431.5 mg/kg。本結(jié)果與部分學者對牙鲆、花鱸、黃顙魚、凡納濱對蝦的研究結(jié)果相似[3，5-7]。當青魚飼料中GSH添加量實測值為406.51 mg/kg時，青魚的生長狀況最好?，F(xiàn)有研究表明，還原型谷胱甘肽能夠增強肝臟中IGF-1的分泌和肌肉組織的IGF-1 mRNA表達，提高了血中IGF-1水平，從而改善了雞只的生長性能[8]，而關(guān)于水產(chǎn)動物的研究非常有限。本試驗結(jié)果認為，青魚飼料中GSH的水平應該控制在一定范圍內(nèi)，含量過低則效果不顯著;而過高的GSH水平，則會產(chǎn)生一定的抑制性，這也在劉曉華等[7]關(guān)于凡納濱對蝦的研究中得到了證實。

3.2 ? ?飼料中添加GSH對青魚血清非特異性免疫指標的影響

現(xiàn)有報道表示，GSH可用于提高機體免疫性能[9]。魚類血液指標可反映其生活環(huán)境、營養(yǎng)和健康狀態(tài)[10]。溶菌酶是一種宿主防御外源微生物的重要物質(zhì)[11]，在魚體中有重要作用。磷酸酶、超氧化物歧化酶和補體系統(tǒng)主要起著免疫防御的作用[12-14]，超氧化物歧化酶水平升高，魚體的免疫力也相應提高;磷酸酶活性可作為檢測肝臟和骨骼代謝狀況的指標[15]，因而磷酸酶的水平可間接反映其生長狀況。

在飼料中添加適量的GSH對青魚生長有一定的促進作用，提高了青魚的非特異性免疫能力，這與周艷玲等[6]在黃顙魚上的研究結(jié)果一致。研究表明，草魚魚體對蛋白質(zhì)的吸收分解程度能利用總蛋白水平表示，提高血清總蛋白水平，有利于提高有機體免疫能力[16]。本試驗中，在飼料中添加實測值為406.51 mg/kg GSH處理的青魚總蛋白水平與添加15.16 mg/kg GSH處理有顯著差異，而飼料中添加實測值為796.72 mg/kg GSH處理的青魚總蛋白水平與添加15.16 mg/kg GSH處理差異不大，這表明過量的GSH添加量對魚體吸收分解蛋白質(zhì)有抑制作用。李曉美等[17]研究結(jié)果表示，在日糧中添加一定的GSH，能夠提高大菱鲆非特異性免疫。本試驗結(jié)果與李曉美等[17]的研究結(jié)果相似。

3.3 ? ?飼料中添加GSH對青魚腸道消化酶活性的影響

消化酶能夠催化有機體內(nèi)各種化學變化，為生物體提供能量和營養(yǎng)[18]。淀粉在動物腸道內(nèi)的消化率比人們預期的低[19]，因而淀粉酶水平的升高，可以增加對淀粉的吸收，從而轉(zhuǎn)化成能量，滿足動物體生長需求。在肉雞中，脂肪酶可以促進脂肪釋放出脂肪酸，抑制有害微生物的生長，促進有益菌的生長[20]，而在水產(chǎn)動物上的研究較少。本試驗中，在飼料中添加實測值為406.51 mg/kg GSH處理的青魚淀粉酶水平顯著高于添加 15.16 mg/kg GSH處理，說明一定的GSH能夠促進淀粉、脂肪和蛋白質(zhì)的消化利用;而在飼料中添加實測值為796.72 mg/kg GSH處理的青魚與添加15.16 mg/kg處理差異不顯著，可知GSH的含量并不是越多越好。

3.4 ? ?飼料中添加GSH對青魚抗氧化能力的影響

動物體內(nèi)存在著許多與谷胱甘肽相關(guān)的抗氧化物酶，如谷胱甘肽還原酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等，這些酶可以清除機體內(nèi)多余的自由基，同時這些酶有助于緩解饑餓產(chǎn)生的氧化反應、多不飽和脂肪酸氧化等[5]。本試驗中隨著飼料GSH水平升高，飼料中添加實測值為406.51 mg/kg GSH處理的青魚肝臟中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶活性與添加15.16 mg/kg GSH處理有顯著差異，說明一定程度下GSH能夠促進魚體的抗氧化能力。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼料中添加GSH可顯著降低青魚肝臟丙二醛含量，鑒于以上結(jié)果，可以推斷缺乏GSH，青魚肝臟抗氧化能力降低，肝臟中丙二醛含量升高，脂質(zhì)過氧化，降低抗氧化相關(guān)酶活性或基因的表達;若GSH過高，則帶來促氧化作用，破壞青魚體內(nèi)的氧化-抗氧化動態(tài)平衡，自由基增多，產(chǎn)生氧化損傷，抑制了抗氧化酶的表達。GSH添加量實測值在431.5 mg/kg左右時青魚幼魚的抗氧化能力較強，具體范圍還需進一步研究。

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