陳開意 何文妮 邵波

摘要：二苯甲酮類紫外吸收劑是一類應(yīng)用較為廣泛的防曬劑，其優(yōu)點(diǎn)包括適用范圍廣，綜合性能較好， 價格低廉等，在化妝品中被廣泛地使用。但在人體和動植物體內(nèi)，紫外防曬劑存在干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響生殖發(fā)育系統(tǒng)等潛在危害。本實(shí)驗(yàn)的研究對象為典型的二苯甲酮類紫外吸收劑—二苯酮-4。利用熒光光譜法來探究BP-4作用于BSA時發(fā)生作用的熒光猝滅過程及結(jié)合點(diǎn)數(shù)、通過熱力學(xué)參數(shù)來探究相互作用的作用力類型、用同步熒光法來探究相互作用的作用位點(diǎn)。結(jié)果表明，BP-4作用于BSA時的猝滅作用主要是靜態(tài)猝滅過程，且與BSA有較強(qiáng)的結(jié)合能力，同時可以獲得在不同溫度下，猝滅過程的猝滅常數(shù)，計(jì)算了300k、305k、310k三個溫度條件下的熱力學(xué)參數(shù)ΔG、ΔH和ΔS，即獲悉兩者的作用過程是自發(fā)進(jìn)行的，BP-4與BSA之間相互結(jié)合的作用力類型是范德華力和氫鍵作用。結(jié)論BP-4能與牛血清白蛋白發(fā)生結(jié)合作用。

關(guān)鍵詞：牛血清白蛋白;二苯酮-4;熒光光譜

中圖分類號：X57 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-672X（2020）10-0-03

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2020.10.068

Abstract：Diphenylketone ultraviolet absorbent is a kind of widely used sunscreen， its advantages include wide range of application， better comprehensive performance， low price， etc.， it is widely used in cosmetics.However， in biological bodies，ultraviolet sunscreen has some toxicological problems such as disrupting the endocrine system.The research object of this experiment is a typical ultraviolet absorbent of diphenylketone， diphenylketone -4.Fluorescence spectroscopy was used to explore the fluorescence quenching process and binding points of bp-4 when it ACTS on BSA， the types of interaction forces were explored by thermodynamic parameters，and the interaction sites were explored by synchronous fluorescence method.Results show that the BP - 4 ACTS on the quenching effect of BSA was mainly a static quenching process，and have strong ability of combining with BSA at different temperature can be obtained at the same time， the quenching constants of quenching process， calculates the 300 k， 305 k， 310k， three thermodynamic parameters of temperature， Δ H and Δ Δ G S， is aware of the role of the process is a spontaneous， BP - 4 type is the power of the combination between BSA and van der Waals force and hydrogen bond action. Conclusion bp-4 can bind to bovine serum albumin.

Key words：Organic UV filters;Benzophenone-4;Bovine serum albumin

1 概述

1.1 研究的背景與意義

近年來，防曬化妝品的使用日益增長，這使得防曬劑中的主要成分有機(jī)紫外吸收劑逐漸成了一種新型環(huán)境污染物，其環(huán)境污染問題在各國普遍存在[1]。有健康研究表明，部分有機(jī)紫外防曬劑對內(nèi)分泌系統(tǒng)有干擾作用，并且會危害人體和生物體的生殖系統(tǒng)和遺傳系統(tǒng)，不利于胚胎的發(fā)育以及出生后的發(fā)育，非但如此還會對人類身體健康造成潛在危害和對周邊生態(tài)環(huán)境造成污染[2]。因此，有機(jī)紫外防曬劑被大家認(rèn)定為一種新的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)[3-4]。有機(jī)紫外線防曬劑是指能夠吸收長波紫外線和中波紫外線的一類有機(jī)化合物，這些紫外線會曬黑甚至?xí)駛覀兊钠つw[5]。紫外線吸收劑的分子都包含可以吸收波長小于400nm的紫外線的發(fā)色團(tuán)，發(fā)色團(tuán)為了實(shí)現(xiàn)紫外線屏蔽功能通過吸收紫外線并將其轉(zhuǎn)換為熱能，化學(xué)能或者其他非紫外線能。紫外線吸收劑的品種較多，在各種類型的有機(jī)紫外線防曬劑中，二苯甲酮類防曬劑擁有良好的性能，價格便宜和應(yīng)用范圍廣，在紫外線吸收劑中占據(jù)著重要的地位[6]。由于有機(jī)紫外線防曬劑被廣泛使用，因此，在使用過程中必須通過各種方式進(jìn)入環(huán)境。另外，大多數(shù)紫外線防曬劑都是可以溶解在非極性溶劑，殘留在環(huán)境中周期長，不易被降解。有機(jī)紫外線防曬劑有兩種方式進(jìn)入環(huán)境，分為直接方式和間接方式。其中直接方式包括通過廢水排放防曬劑，將有機(jī)紫外防曬劑帶入水生生態(tài)系統(tǒng)中，而間接方式包括通過每天洗滌，游泳，沐浴等途徑帶入水中。它們可以滲出皮膚或通過食物鏈進(jìn)入人類身體。Janjua[7]等經(jīng)過大量研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)紫外防曬劑二苯酮-3和4-甲基芐亞甲基樟腦可以通過皮膚進(jìn)入人體內(nèi)，并計(jì)算出了人體血漿中含有的最大濃度分別為238 ng·mL-1和18 ng·mL-1。通過對二苯酮-4作用于BSA時的作用機(jī)理的研究，可以了解在生物體內(nèi)血清蛋白與二苯酮-4之間的結(jié)合作用，而且對于現(xiàn)在的環(huán)境狀況來說，有機(jī)紫外吸收劑與血清蛋白之間的相互作用的結(jié)果可以為環(huán)境污染的治理提供參考?？偟膩碚f，這個實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)成為一個很有研究價值和意義的研究。

1.2 有機(jī)紫外防曬劑的毒性效應(yīng)

有研究表明，有機(jī)紫外防曬劑有較高毒性，而且有機(jī)紫外防曬劑通常都還有不飽和鏈和苯環(huán)導(dǎo)致其殘留在環(huán)境中難以降解，容易對環(huán)境造成持續(xù)影響。目前，有機(jī)紫外吸收劑存在于多種環(huán)境介質(zhì)中，例如：大氣生態(tài)系統(tǒng)，土壤生態(tài)系統(tǒng)，水生生態(tài)系統(tǒng)等等。Vila[8]等人經(jīng)過檢測得出BP-4 容易對藻類造成風(fēng)險(xiǎn)，而 BP-3 和 EHMC 則更容易對魚類造成危害。另外，人體內(nèi)也被不斷檢測出存在有機(jī)紫外防曬劑，證實(shí)了有機(jī)紫外防曬劑通過食物鏈的富集最終進(jìn)入人體和動植物體內(nèi)。已有報(bào)道指出，有機(jī)紫外防曬劑對人體和動物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)，生殖發(fā)育系統(tǒng)，遺傳系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等都有不同程度的不良影響。

1.3 二苯酮-4的性質(zhì)

二苯酮-4（Benzophenone-4，）是一種奶白色至黃色的粉末，無氣味。分子式是C14H12O6S，相對分子質(zhì)量是308.04，溶解度為0.65。下圖是其結(jié)構(gòu)式，是一種常見的有機(jī)紫外防曬劑，屬于水溶性化學(xué)防曬劑。

1.4 牛血清白蛋白的性質(zhì)

牛血清白蛋白（bovine serum albumin），是一種乳白色的片狀粉末。它的相對分子質(zhì)量為104，血清蛋白是血液的主要成分，其分子量是68000，血清蛋白包含581個氨基酸組成，其中帶有的17個二硫鍵是由35個半胱氨酸組成，而游離巰基組成第34個肽鏈，血清白蛋白能夠和多種陰、陽離子以及小分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)結(jié)合在一起[9]。血液中的白蛋白主要有以下幾種作用，維持滲透壓、緩沖pH、承擔(dān)載體和營養(yǎng)作用。在動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)中，添加白蛋白可起到載體作用和生理和機(jī)械保護(hù)作用。

1.5 有機(jī)紫外吸收劑對生物大分子的研究

牛血清白蛋白是一種常用的載體蛋白，它在人體內(nèi)的血液循環(huán)系統(tǒng)中起到貯存和運(yùn)輸物質(zhì)的重要作用。將牛血清蛋白作為研究對象，探究其與內(nèi)源或外源性物質(zhì)相互聯(lián)結(jié)而發(fā)生作用后的影響機(jī)理已成為生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的重要方向，血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白，它具備廣泛的結(jié)合能力，同時具有很強(qiáng)的內(nèi)源性熒光。外源性化合物與蛋白質(zhì)份子相互感化會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度下降，這就說明其發(fā)生熒光猝滅[10]。目前熒光光譜法已成為研究某些物質(zhì)作用于血清蛋白時的分子機(jī)理和作用程度的有效方法。敖俊杰[11]等人研究了三種常見的有機(jī)紫外防曬劑與牛血清白蛋白的相互作用的作機(jī)理通過熒光分光光度法。

本實(shí)驗(yàn)通過研究二苯酮-4與牛血清白蛋白相互作用來間接驗(yàn)證其對人體的影響。本文利用熒光分光光度法來探求二苯酮-4與BSA相互作用的機(jī)理，了解兩者相互作用的猝滅機(jī)理;根據(jù)測定的數(shù)據(jù)來繪制熒光光譜圖，分析結(jié)果可知二苯酮-4與牛血清蛋白相互作用的熒光猝滅規(guī)律以及相對應(yīng)的猝滅常數(shù)，二苯酮-4與牛血清蛋白互相作用的作用力類型可以通過計(jì)算分析熱力學(xué)參數(shù)來確定。這有利于讓我們了解其在人體的分布情況和運(yùn)輸過程，對于我們認(rèn)識紫外防曬劑的毒性有著非常重大的意義，同時這也有助于推動關(guān)于有機(jī)紫外防曬劑的生態(tài)毒性的研究進(jìn)展。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

熒光分光光度計(jì)：Rf-5301pc熒光分光光度計(jì)（日本日立）。

電子分析天平：al-204型（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

冰箱：bcd-216zdjJ型的冰箱（青島海爾有限公司）。

電熱恒溫水槽：Dk-8D型數(shù)控超級恒溫槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

純水機(jī)：paoifio-t-2-20型。

pH計(jì)：phsj-4F型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（上海儀電科學(xué)有限公司）。

常見玻璃儀器：玻璃棒，100mL，250mL容量瓶，1mL，5mL移液管

100mL燒杯。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

牛血清蛋白：購于上海如吉生物科技有限公司。

二苯酮-4：購于上海榕柏生物技術(shù)有限公司（100g，純度>99%）。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 溶液配置方法

1×10-5mol/L BSA標(biāo)準(zhǔn)儲備液體：用電子天平稱取0.068g的牛血清白蛋白，用超純水溶解在燒杯中，移入100m的容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻，放置于4℃冰箱中進(jìn)行保存。

1×10-4mol/L 二苯酮-4標(biāo)準(zhǔn)溶液：用電子天平準(zhǔn)確稱取0.0031g的二苯酮-4，溶于少量超純水中，移入100mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度并搖勻，放置于4℃冰箱中進(jìn)行保存。

0.2mol/L Tris-HCl緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取24.228g的Tris藥品倒入1L的大燒杯中，溶于超純水中，將超純水加至約700mL，用濃HCl調(diào)節(jié)pH至7.40±0.05，然后移入容量瓶中，用1 000mL超純水定容稀釋，搖勻，放置于室溫下進(jìn)行保存。

2.2.2 熒光猝滅實(shí)驗(yàn)

在10 mL比色管中分別加入2mL Tris-HCl 緩沖液、5mL的BSA溶液以及適量的二苯酮-4溶液，用超純水定容并搖勻，使藥物的最終濃度分別為0、0.9×10-6mol/L、1.8×10-6mol/L、2.7×10-6mol/L、3.6×10-6mol/L、4.5×10-6mol/L、6.3×10-6mol/L、7.2×10-6mol/L、8.1×10-6mol/L。將上述溶液置于恒溫水槽中，水溫分別調(diào)節(jié)為300、305、310K，在恒溫條件下作用30min至平衡后測定其熒光光譜。將熒光分光光度計(jì)中發(fā)射波長參數(shù)設(shè)置為375nm，固定激發(fā)波長設(shè)置為285nm，狹縫寬度設(shè)置為10nm，然后測定在250～500nm這一范圍區(qū)間內(nèi)的發(fā)射光譜，將熒光強(qiáng)度最大時對應(yīng)的發(fā)射波長記錄下來[12]。

3 結(jié)果與討論

3.1 二苯酮-4與BSA的相互作用的熒光光譜

3.1.1 二苯酮-4與BSA相互作用的猝滅機(jī)理

由于蛋白質(zhì)大分子具有酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）等小分子結(jié)構(gòu)，所以可以產(chǎn)生較強(qiáng)的內(nèi)源性熒光。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子與外源性化合物互相作用時可能會降低蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度。如下圖所示，二苯酮-4（BP-4）于BSA相互作用產(chǎn)生的熒光光譜圖。其中從B到J的藥物濃度分別為0、0.9×10 -6、1.8×10-6 、2.7×10-6、3.6×10 -6 、5.4×10 -6 、7.2×10-6 、8.1×10-6、9.0×10 -6 mol/L，BSA的濃度始終為1×10-5 mol/L。由圖1可見，向BSA 中加入 BP-4后，BSA在340nm 附近出現(xiàn)熒光峰值并且激發(fā)峰與發(fā)射峰的位置與形狀幾乎相同，這說明二苯酮-4作用于牛血清白蛋白時有熒光猝滅作用，引起此處內(nèi)源性熒光有規(guī)律的猝滅，隨著二苯酮-4濃度的不斷升高，BSA的熒光強(qiáng)度有規(guī)律得降低。

在普遍情況下，我們將熒光猝滅的過程包括動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種類型[13]。在動態(tài)猝滅過程中的作用機(jī)理是對quencher對激發(fā)態(tài)作用，通過能量轉(zhuǎn)移或電荷移動使其喪失激發(fā)能，蛋白質(zhì)自身的活性和結(jié)構(gòu)并不受影響。而靜態(tài)猝滅從實(shí)質(zhì)上來說是因?yàn)槭菬晒怏w和quencher通過結(jié)合形成了基態(tài)復(fù)合物，這在微觀層面上影響蛋白質(zhì)的二級構(gòu)造，從宏觀層面上影響其生理活性。另一種判斷方法是通過雙分子猝滅常數(shù)Kq來進(jìn)行判斷，溫度會影響猝滅作用以及吸收光譜的變化。溫度對熒光猝滅作用的影響以及熒光光譜的變化進(jìn)行分辨。隨著溫度的不斷上升，由于有效碰撞的離子數(shù)不斷增加引起電子遷移的過程加劇屬于動態(tài)猝滅;反之如果猝滅常數(shù)隨溫度的不斷升高而下降，則屬于靜態(tài)猝滅。這是由于復(fù)合物的穩(wěn)定性隨著溫度的變化而變化。為了更加深入地證實(shí)此猝滅過程的種類，我們把它當(dāng)作動態(tài)猝滅來處理，借助斯特恩-沃爾默方程進(jìn)行計(jì)算[14]：

其中，F(xiàn)0和F分別是不存在二苯酮-4時的熒光強(qiáng)度和存在不同濃度二苯酮-4后的熒光強(qiáng)度;Kq是靜態(tài)過程中猝滅反應(yīng)速率常數(shù);τ0是不存在猝滅劑時熒光分子平均壽命，通常生物大分子的熒光壽命為10-8s;[Q]為二苯酮-4的濃度;Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)。根據(jù)上式所得的結(jié)果，以[Q]為橫坐標(biāo)，F(xiàn)0/F為縱坐標(biāo)作Stern-Volmer圖。以 F0/F 對[Q]進(jìn)行建模，可以得到線性回歸方程，我們就可以計(jì)算出猝滅速率常數(shù)，結(jié)果如下表1所示。

根據(jù)表1數(shù)據(jù)可知，猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而減少，且Kq的數(shù)量級大大超過了生物大分子在水溶液中的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)1個數(shù)量級，這表明二苯酮-4與牛血清白蛋白相互作用產(chǎn)生了不具有熒光性的配合物，該過程屬于靜態(tài)猝滅。

3.1.2 二苯酮-4在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)合模式分析

結(jié)果表明，二苯酮-4對BSA的猝滅機(jī)理屬于靜態(tài)猝滅，因此二苯酮-4的濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系就符合Lineweaver-Burk雙導(dǎo)數(shù)方程[15]，見下公式（2）：

式中：F0為沒有加入猝滅劑時的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入猝滅劑后的熒光強(qiáng)度;n是結(jié)合位點(diǎn)數(shù);Ka是結(jié)合常數(shù);[Q]是猝滅劑二苯酮-4的濃度。

通過lg（[ F0-F]/F）對lg[Q]進(jìn)行擬合，得到線性回歸方程，由此可以分別計(jì)算出在不同溫度下二苯酮-4與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。見表2。

由表2數(shù)據(jù)可見，二苯酮-4與BSA二者結(jié)合緊密。證明了二者之間劇烈的聯(lián)結(jié)作用，且二苯酮-4與BSA之間的聯(lián)結(jié)位點(diǎn)數(shù)基本為1，則表明二苯酮-4與BSA之間形成一個結(jié)合位點(diǎn)。

3.1.3 二苯酮-4與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)與結(jié)合力

一般來說，有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用時的作用力主要包括Van der Walls力，疏水作用力，氫鍵結(jié)合力等[16-17]。當(dāng)溫度變化范圍不大時，可近似把焓變熵變當(dāng)作常數(shù)，根據(jù)范霍夫方程來計(jì)算反應(yīng)的焓變和熵變：

式中K為不同溫度條件下的聯(lián)結(jié)常數(shù)，R為標(biāo)準(zhǔn)氣體常數(shù)，△H為反應(yīng)焓變，△S為反應(yīng)熵變，再可由公式ΔG=ΔH-TΔS來計(jì)算反應(yīng)的自由能變。之后以結(jié)合常數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)，溫度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，根據(jù)方程的截距和斜率分別計(jì)算得△H、△S及△G值。

從熱力學(xué)基本關(guān)系式來看，在溫度和壓力一定的情況下，體系中的ΔG決定了小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用能否自發(fā)進(jìn)行，當(dāng)ΔG<0時，該反應(yīng)可以自發(fā)進(jìn)行。Ross等人[18]研究并總結(jié)出的判斷生物大分子自身相互作用力性質(zhì)以及生物大分子與小分子物質(zhì)之間相互作用力的規(guī)律通過比較反應(yīng)發(fā)生前后熱力學(xué)焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小，如果是典型的疏水作用力則ΔH>0，ΔS>0;如果是氫鍵和范德華力則ΔH<0，ΔS<0;如果是靜電引力ΔH<0，ΔS>0。

所得數(shù)據(jù)表明，BP-4的 ΔG<0，表明它可與BSA自發(fā)反應(yīng);根據(jù)ΔH和ΔS判斷，BP-4主要通過氫鍵和范德華力與BSA結(jié)合。

4 結(jié)論

根據(jù)分析上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以得出以下結(jié)論：（1）二苯酮-4與BSA相互作用使得其自身的熒光發(fā)生明顯猝滅現(xiàn)象，且這種猝滅作用隨二苯酮-4的濃度升高而增強(qiáng)，可得出該過程屬于靜態(tài)猝滅。（2）二苯酮-4（BP-4）與BSA之間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1左右，表明兩者之間存在一種類型的結(jié)合位點(diǎn)。（3）經(jīng)過計(jì)算二苯酮-4與BSA互相作用的熱力學(xué)參數(shù)，可以知道兩者的作用過程是自發(fā)進(jìn)行的，并且BP-4與BSA之間的相互作用力屬于氫鍵和范德華力[19]。

目前我國的有機(jī)紫外防曬劑的污染問題日益嚴(yán)峻，人們也越來越重視對其毒理性質(zhì)的研究。本實(shí)驗(yàn)提醒二苯酮-4能在人體中通過血清白蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)和儲蓄。目前有有機(jī)紫外吸收劑對水生動物魚類的內(nèi)分泌干擾的相關(guān)研究[20-21]。但是對于人體組織細(xì)胞的影響研究還很少，需要進(jìn)一步深入探索，目前的研究進(jìn)展尚不能解釋有機(jī)紫外防曬劑和內(nèi)分泌系統(tǒng)之間的干擾效應(yīng)，所以，在未來的研究內(nèi)容中，我們應(yīng)該更加進(jìn)一步去研究有機(jī)紫外防曬劑產(chǎn)生的不同內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的機(jī)理。這樣才能讓我們更加完整科學(xué)得認(rèn)識有機(jī)紫外防曬劑對不同生物包括人體健康的各種危害。這不僅讓我們進(jìn)一步了解在平時日常生活中如何正確運(yùn)用防曬劑這類個人護(hù)理用品，與此同時，也可以為相關(guān)部門提供數(shù)據(jù)，方便科學(xué)決策。

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收稿日期：2020-08-01