王寧

（遼寧省建平縣動物疫病預防控制中心 122400）

血凝試驗 （HA） 是根據(jù)禽流感病毒的血凝素能與雞紅細胞發(fā)生凝集現(xiàn)象的特點而建立，而這種紅細胞凝集現(xiàn)象可被特異性免疫血清所抑制，即紅細胞凝集抑制試驗 （HI）。

1 操作要點

1.1 血清處理與保存

采血樣一般以靜脈血為主，采集后要及時分離血清，保證血清清透無溶血。血清樣品要盡早檢測或置4℃冰箱保存5d，超過一周需置—20℃冷凍保存，切忌反復凍融[1]。

1.2 稀釋液配制

HA-HI 試驗緩沖液為 0.01mol/L，pH＝7.2 的 PBS，PBS 盡量現(xiàn)用現(xiàn)配，高壓滅菌后使用，一經(jīng)使用保存期不要超過3周。pH 要在高壓后調節(jié)，若在高壓前調到7.2，高壓后會有所改變。

1.3 1%紅細胞懸液制備

1%紅細胞懸液要現(xiàn)用現(xiàn)配，采血雞要求至少3 只SPF 成年公雞。

洗滌雞紅細胞離心轉速為1000～2000rpm，離心10min （檢測禽流感抗體時1000rpm，檢測雞新城疫抗體時2000rpm）。

洗脫好的紅細胞原液4℃保存?zhèn)溆?，配制紅細胞懸液時應吸取試管底部的紅細胞進行稀釋，若吸取上層紅細胞可能會導致懸液濃度偏低。使用前一定要搖勻，防止紅細胞下沉，保證每一孔中加入的濃度準確一致。

1.4 試劑的使用與保存

凍干的病毒抗原應按照說明書要求溶解并保存，可以無菌操作將其分裝成小包裝，以避免反復凍融，并有效減少細菌污染。

1.5 HA 試驗

HA 試驗測定抗原效價，做 3 個重復即可。室溫 （20～25℃） 靜置 40min 后觀察結果。判定時，可將反應板傾斜[2]，觀察紅細胞有無淚滴狀流淌。能使紅細胞完全凝集的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價，此效價為1 個血凝單位 （HAU）。注意：對照孔應呈現(xiàn)完全不凝集，否則試驗不成立。

HA 試驗是對抗原效價的一個初步判定，最終要經(jīng)過4HAU 抗原回滴對抗原進行最終校正。根據(jù)HA 試驗結果配制4 個血凝單位 （4HAU） 的病毒抗原。例如血凝的終點滴度為1：256，則 4HAU 抗原的稀釋倍數(shù)應是 1：64。

4HAU 抗原回滴同樣做 3 個重復，稀釋至第 4 列，第 5 列為紅細胞對照。

若HA 效價判定準確，4HAU 抗原回滴時第1、2 孔發(fā)生凝集，第 3、4 孔流淌。

若HA 效價判定不準確，4HAU 抗原回滴出現(xiàn)以下兩種情況。

（1） HA 效價判高，4HAU 抗原濃度會偏低，第 2 孔流淌，需添加抗原；

（2） HA 效價判低，4HAU 抗原濃度會偏高，第 3 孔發(fā)生凝集，需補加PBS。

1.6 HI 試驗

HI 試驗應同時設立陰、陽性對照，添加抗原后須室溫靜置30min 后再添加1%紅細胞懸液。注意：滴加抗原和紅細胞時要從后往前加，即從低濃度向高濃度加，滴頭要懸空，不要接觸到孔里的液體；加紅細胞時要經(jīng)常晃動混勻，防止紅細胞下沉[3]。

結果判讀以完全抑制4 個HAU 抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI 滴度。滴度是指產(chǎn)生完全不凝集 （紅細胞完全流淌) 的最高稀釋度。

判定時需要與紅細胞對照孔進行對照，與紅細胞對照孔紅細胞流淌速度一致，淚滴大小一致的稀釋倍數(shù)最大孔為檢測樣品的最終效價。

2 結果判定

病毒對照孔：完全凝集

RBC 對照孔：無凝集

只有陰性對照孔血清滴度不大于2log2，陽性對照孔血清誤差不超過1 個滴度的試驗結果才有效。

測定孔：RBC 沉于孔底中心，呈紐扣狀，將板傾斜呈淚滴狀流淌。

血凝抑制試驗效價：呈完全血凝抑制的最高血清稀釋度。禽流感HI 價小于或等于3log2 判定試驗陰性，HI 價等于4log2 為可疑，需重復實驗，HI 價大于或等于5log2 為陽性。

3 反應條件

3.1 溫度

試驗要求室溫 (20～25℃) 下操作，若環(huán)境溫度難以控制，可將反應板置于室溫溫箱內。

3.2 時間

孵育時間要掌握好，不論HA 還是HI 試驗，加入紅細胞后孵育時間均為40min。但在一些病毒株中可見紅細胞從病毒中解脫，若有此情況發(fā)生，可提前判定 （25～30min） 或 4℃下孵育?？傊?，紅細胞對照完全凝集時即可進行判讀。

4 小結

為了試驗的準確性，移液器要選擇合適的量程；加樣、稀釋時要注意力集中，避免漏加、復加；血清在稀釋前要充分混勻；加抗原和紅細胞時滴頭要懸空，從后往前加，以免交叉污染；嚴格控制溫度和時間；必須要進行4HAU 抗原回滴，以避免最終結果出現(xiàn)偏差?？傊?，只有認真對待每一步的操作，才能有效降低誤差，得到較為準確的試驗結果。