任偉鈺，馬天翔，包靖靖，鄭宜鋆，王亞麗，3，劉東玲，3*，顧志榮*

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院 藥劑科，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

鴉膽子為苦木科鴉膽子屬植物Bruceajavanica(L.)Merr.的干燥成熟果實(shí)，又名老鴉膽、苦參子、小苦楝等，味苦，性寒，有小毒，具有清熱解毒、燥濕殺蟲(chóng)、止痢截瘧的功效。目前從鴉膽子中分離鑒定了苦木內(nèi)酯及其苷類(lèi)、類(lèi)苦木素類(lèi)、生物堿類(lèi)、黃酮苷類(lèi)等成分，這些成分具有抗炎、抗菌、抗瘧、抗腫瘤等廣泛的藥理作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇對(duì)黑色素瘤B-16、白血病L-1210及P-388等細(xì)胞有明顯的抑制效果，鴉膽子苦苷A、B和鴉膽子素E、F均具有明顯的抗腹水腫瘤及Walker氏癌肉瘤256瘤株的活性，鴉膽因D還具有抗炎、抗瘧的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，大約30%的人類(lèi)腫瘤存在ras基因突變，且多種腫瘤均檢測(cè)到p21ras過(guò)表達(dá)，表明ras基因突變和p21ras過(guò)表達(dá)確與惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)[3]。因此，開(kāi)發(fā)能抑制人類(lèi)腫瘤中ras基因突變的藥物是眾多研究人員廣泛關(guān)注的問(wèn)題。

有研究表明，苦木內(nèi)酯類(lèi)化合物鴉膽苦醇、鴉膽因D、鴉膽因A、鴉膽丁醇有抗腫瘤作用[4]，但鴉膽子化學(xué)成分種類(lèi)較多，活性成分極為豐富，因此按不同極性或提取部位進(jìn)行研究，對(duì)于全面深入闡釋鴉膽子抗腫瘤活性及其物質(zhì)基礎(chǔ)具有積極意義。因此，本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法，采用不同有機(jī)溶劑提取鴉膽子，得到不同極性部位，探究不同部位提取物抑制ras突變腫瘤活性的譜效關(guān)系，為闡釋其抗腫瘤作用及物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考[1，5]。

1 材料

1.1 線蟲(chóng)、菌株

1.2 試藥

鴉膽子購(gòu)于蘭州市黃河藥材市場(chǎng)，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院晉玲教授鑒定為苦木科鴉膽子B.jauanica(L.) Merr.的干燥成熟果實(shí)；對(duì)照品鴉膽子苦醇(批號(hào)：112586，純度：97%，上海同田生物技術(shù)股份有限公司)；二甲基亞砜(DMSO，上海中秦化學(xué)試劑有限公司)；石油醚(30～60 ℃)、三氯甲烷、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇，均為分析純(天津市百世化工有限公司)；甲醇為色譜純(天津市康科德科技有限公司)；水為二次蒸餾水；LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、NGM培養(yǎng)基、M9緩沖液、裂解液、S緩沖液、檸檬酸緩沖液均為實(shí)驗(yàn)室配制。

1.3 儀器

Agilent 1260型Infinity液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；DL-180型超聲波清洗器(浙江象山縣石蒲海天電子儀器廠)；AF10O4N型萬(wàn)分之一電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；GFL3033型氣浴恒溫?fù)u床(北京博勵(lì)行儀器公司)；B2型生物安全柜(美國(guó)Thermo Fisher公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；THZ-82型搖床(金壇市恒豐儀器廠)；GR60DR型滅菌鍋(廈門(mén)儀器廠)；浮游生物計(jì)數(shù)板(北京普利特儀器有限公司)；SQP型電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鴉膽子不同極性部位提取

2.1.1預(yù)處理 鴉膽子置于干燥箱中，于80 ℃恒溫干燥2 h至恒定質(zhì)量，待其冷卻，用粉碎機(jī)粉碎，得鴉膽子粉(過(guò)100目篩)。精密稱取藥粉500 g，按藥粉-石油醚1∶6浸泡2次，每次24 h，合并濾液，濾渣80 ℃烘干，冷卻，得脫脂鴉膽子粉，冷藏備用。

2.1.2不同極性部位提取 將脫脂鴉膽子粉加入至95%乙醇中，鴉膽子粉與乙醇為7∶1，60 ℃回流提取2次，每次2 h，得到苦味浸膏，依次用三氯甲烷及乙酸乙酯萃取，回收溶劑，干燥。分別得到三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位以及殘余部位，備用。

2.2 鴉膽子不同部位HPLC特征圖譜建立

2.2.1色譜條件 安捷倫z0RBAx ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相甲醇(A)-水(B)梯度洗脫(0～7 min，20%～60%A；7～18 min，60%～80%A；18～22 min，80%～20%A)，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm，體積流量1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL[6]。

2.2.2供試品溶液制備 精密稱取三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、殘余部位粉末0.051 1、0.050 2、0.051 4 g，分別置于25 mL量瓶中，加入甲醇，超聲輔助使完全溶解，定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣。

2.2.3方法學(xué)考察 按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版[7]方法考察穩(wěn)定性、重復(fù)性、精密度、加樣回收率，RSD均小于3.0%，符合要求。

2.2.4不同萃取部位HPLC特征圖譜建立 按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件，建立不同部位HPLC特征圖譜，見(jiàn)圖1。特征峰峰面積見(jiàn)表1。可知，不同部位的共有色譜峰有17個(gè)，其中三氯甲烷部位有12個(gè)，乙酸乙酯部位及殘余部位各有13個(gè)。經(jīng)對(duì)照品比對(duì)，確認(rèn)14號(hào)峰為鴉膽子苦醇。對(duì)比不同極性部位色譜圖，發(fā)現(xiàn)各部分化學(xué)成分及含量存在較大差異。

新興的近代慈善事業(yè)實(shí)際上是近代城市慈善事業(yè)，是“以近代城市的興起為依托、為載體的”[1]55。慈善義演作為近代慈善事業(yè)的重要活動(dòng)形式之一，與近代都市文化的發(fā)展具有密不可分的聯(lián)系，它產(chǎn)生于都市，并發(fā)展于社會(huì)近代化和城市化過(guò)程之中，而并非鄉(xiāng)村地區(qū)，這是慈善義演作為近代慈善事業(yè)的表現(xiàn)形式的重要標(biāo)志。從慈善義演的形式看，它是通過(guò)藝人演出的方式籌集資金來(lái)進(jìn)行慈善救助的行為，而這種演出的形式，則是多種多樣，但是從根本上說(shuō)，藝術(shù)演出這種行為本身，便是要滿足具有近代意義的都市社會(huì)的娛樂(lè)需要。首先，作為一種常規(guī)的籌募方式，一種普遍存在的慈善救助形式，它的發(fā)起要具備三個(gè)基本條件：

表1 不同部位HPLC特征峰峰面積

注：1～17表示特征峰；A.三氯甲烷部位；B.乙酸乙酯部位；C.殘余部位。圖1 三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和殘余部位色譜圖

2.3 鴉膽子不同部位對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的急性毒性實(shí)驗(yàn)

2.3.1培養(yǎng)基及溶液配制 LB液體培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基中加入蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g，并用1 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)pH至7.0，121 ℃溫度下滅菌20 min；LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基高壓滅菌前加入細(xì)菌瓊脂粉15 g·L-1，121 ℃，滅菌15 min；NGM培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基中加入NaCl 3 g、蛋白胨2.5 g、瓊脂17 g、1 mol·L-1K2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH=6.0) 25 mL、蒸餾水975 mL，滅菌后加入濾過(guò)除菌的5 mg·mL-1膽固醇溶液、1 mol·L-1MgSO4溶液、1 mol·L-1CaCl2溶液各1 mL；M9緩沖液：1 L緩沖液中含Na2HPO4·12H2O 15 g、KH2PO43 g、NaCl 5 g、Mg2SO4·7H2O 0.25 g；裂解液：6.4% NaClO溶液和1 mol·L-1NaOH溶液按1∶1混合；S緩沖液：1 L蒸餾水中加入NaCl 5.85 g、K2HPO41 g、KH2PO46 g，混勻，滅菌，制成S基礎(chǔ)液，1 L S基礎(chǔ)液加入檸檬酸緩沖液10 mL、Trace液10 mL、5 mg·mL-1膽固醇1 mL、1 mol·L-1MgSO43 mL、1 mol·L-1CaCl2溶液3 mL，混勻；檸檬酸緩沖液：檸檬酸20 g、檸檬酸鉀293.5 g、蒸餾水1000 mL，混合均勻。

2.3.2大腸桿菌OP50培養(yǎng) 從-80 ℃冰箱中取出凍存的大腸桿菌OP50菌液，于LB固體培養(yǎng)基上用接種環(huán)劃線，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，取單克隆菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床上，37 ℃，培養(yǎng)10～12 h，備用，可根據(jù)要求稀釋處理。

2.3.3線蟲(chóng)培養(yǎng) 在已制備好的NGM培養(yǎng)皿上用涂棒每板涂400 μL的大腸桿菌OP50菌液，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，冷卻后將凍存在-80 ℃冰箱內(nèi)的秀麗隱桿線蟲(chóng)MT2124取出，迅速解凍，鋪于培養(yǎng)基上，在21 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至成蟲(chóng)。

2.3.4線蟲(chóng)同步化 將在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)了5～6 d的線蟲(chóng)用M9緩沖液沖洗到5 mL離心管中，靜置，棄去上清后，剩下液體少許，加入裂解液，在渦旋儀上震蕩約7 min，使線蟲(chóng)充分裂解，3000 r·min-1(離心半徑9 cm)，離心3 min后，棄去上清液，用M9緩沖液沖洗2次，棄去沖洗液，得到線蟲(chóng)蟲(chóng)卵。加M9緩沖液至1 mL，在培養(yǎng)箱中放置48 h后，線蟲(chóng)發(fā)育達(dá)到Ll期。收集Ll期幼蟲(chóng)備用。

2.3.5藥液制備 精密稱定三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位及殘余部位粉末各0.5 g，用DMSO配制成質(zhì)量濃度為250 mg·mL-1的藥液，超聲輔助溶解，精密吸取200 μL，以蒸餾水稀釋并超聲，得到質(zhì)量濃度為25 mg·mL-1的混懸狀母液，然后按一定濃度梯度稀釋備用。

2.3.6分組與給藥 在96孔板上精密加入M9緩沖液80 μL、線蟲(chóng)液20 μL及按一定濃度梯度稀釋的藥液100 μL，使其終質(zhì)量濃度為0、0.156 25、0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mg·mL-1，混合均勻，并設(shè)置相應(yīng)空白對(duì)照和陰性對(duì)照組，空白對(duì)照組為不加藥液線蟲(chóng)組，陰性對(duì)照組為溶媒對(duì)照組(包含M9緩沖液80 μL、線蟲(chóng)液20 μL及DMSO 100 μL)，以檢測(cè)DMSO是否對(duì)線蟲(chóng)有影響。

2.3.7鴉膽子不同部位急性毒性測(cè)定 加藥后24 h，顯微鏡下觀察線蟲(chóng)死亡情況，采用浮游生物計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并根據(jù)公式(1)計(jì)算線蟲(chóng)死亡率。

死亡率=加藥后線蟲(chóng)數(shù)量/加藥前線蟲(chóng)數(shù)量×100%

(1)

各萃取部位對(duì)線蟲(chóng)的半數(shù)致死量(LC50)結(jié)果見(jiàn)圖2。三氯甲烷部位毒性較大，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=10.195 04+20.304 74X，擬合度R2為0.951 73，r為 0.975 6，經(jīng)計(jì)算其LC50為1.96 mg·mL-1；乙酸乙酯部位與殘余部位毒性在一定范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度增大而增大，但并未達(dá)到半數(shù)致死，故各部位的急性毒性大小為三氯甲烷部位>乙酸乙酯部位>殘余部位。

圖2 鴉膽子不同萃取部位對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的急性毒性

2.4 鴉膽子各部位抗腫瘤作用

2.4.1大腸桿菌及線蟲(chóng)的培養(yǎng) 按照2.3.1項(xiàng)下條件培養(yǎng)大腸桿菌OP50，按照2.3.2項(xiàng)下條件大量培養(yǎng)線蟲(chóng)。

2.4.2藥液制備 將2.3.4項(xiàng)下制備的質(zhì)量濃度為25 mg·mL-1的藥液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，按一定濃度梯度稀釋備用。

2.4.3分組與給藥 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在96孔板上加入S基礎(chǔ)液140 μL、線蟲(chóng)液20 μL、大腸桿菌OP50菌液20 μL及一定濃度梯度的藥液20 μL，最終三氯甲烷部位的質(zhì)量濃度為2、10、50 μg·mL-1，乙酸乙酯部位的質(zhì)量濃度為20、100、500 μg·mL-1，殘余部位質(zhì)量濃度為20、100、500 μg·mL-1，混合均勻，并設(shè)置相應(yīng)空白對(duì)照和陰性對(duì)照。

2.4.4不同部位抗腫瘤作用 以野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)為藥物抗腫瘤作用評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同濃度、不同部位藥液抗腫瘤作用，按照公式(2)計(jì)算野生型線蟲(chóng)占比。野生型線蟲(chóng)占比越高，則提取物抗腫瘤效果越好。

野生型線蟲(chóng)占比=野生型線蟲(chóng)數(shù)/線蟲(chóng)總數(shù)×100%

(2)

結(jié)果見(jiàn)圖3。與對(duì)照組比較，隨著鴉膽子三氯甲烷部位質(zhì)量濃度增大，野生型線蟲(chóng)占比顯著增大(P<0.01)；乙酸乙酯萃取部位在100～500 μg·mL-1時(shí)呈一定抗腫瘤活性；殘余部位在500 μg·mL-1時(shí)有一定抗腫瘤活性。因此，各部位中，三氯甲烷萃取部位抑制ras突變的抗腫瘤活性最強(qiáng)，乙酸乙取部位次之，殘余部位基本無(wú)藥效。

圖3 鴉膽子各萃取部位抗腫瘤活性

2.5 譜效關(guān)系研究

三氯甲烷萃取部位抗腫瘤活性最強(qiáng)，其所有色譜峰所對(duì)應(yīng)化學(xué)成分均有進(jìn)一步研究的價(jià)值。為了明確其他萃取部位色譜峰與抗腫瘤作用之間的相關(guān)性，對(duì)乙酸乙酯部位與殘余部位色譜峰進(jìn)行偏最小二乘回歸(PLS)法分析，并與三氯甲烷部位相結(jié)合探討鴉膽子提取物抑制ras突變腫瘤活性的譜效關(guān)系。

以乙酸乙酯部位與殘余部位HPLC特征圖譜各峰面積作為自變量，野生型線蟲(chóng)占比作為因變量，將峰面積歸一化數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件中進(jìn)行分析，計(jì)算得到16個(gè)色譜峰與野生型蟲(chóng)體比例的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)和變量重要性投影(VIP)值(見(jiàn)圖4～5)。當(dāng)VIP>1時(shí)，說(shuō)明所對(duì)應(yīng)化合物對(duì)抑制ras突變的腫瘤活性有重要作用。由圖5可知，峰7、8、10～12的VIP均大于1。

圖4 乙酸乙酯部位與殘余部位各色譜峰PLS標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)

圖5 乙酸乙酯部位與殘余部位各色譜峰對(duì)藥效的VIP貢獻(xiàn)

3 討論

人類(lèi)生長(zhǎng)因子受體介導(dǎo)的Ras/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路是與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等密切相關(guān)的重要信號(hào)通路，該信號(hào)通路發(fā)生異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。秀麗隱桿線蟲(chóng)let-60編碼的ras蛋白與人類(lèi)的ras蛋白在前面164個(gè)氨基酸中相似度高達(dá)83%[9]。秀麗隱桿線蟲(chóng)中的Ras/MAPK信號(hào)通路是高度保守的，若let-60過(guò)度激活會(huì)使線蟲(chóng)陰門(mén)數(shù)量增多，形成多陰門(mén)表型(Muv)線蟲(chóng)，相反則會(huì)產(chǎn)生無(wú)陰門(mén)的線蟲(chóng)汀[10]。秀麗隱桿線蟲(chóng)可作為篩選靶向Ras/MAPK信號(hào)通路的藥物候選物的模型。本研究采用該模型篩選鴉膽子中抑制ras突變腫瘤活性的萃取部位以及不同提取物的毒性，野生型蟲(chóng)體比例越高，則說(shuō)明藥物抑制ras基因突變作用越強(qiáng)，藥效越好。

鴉膽子中的多種化學(xué)成分對(duì)多種腫瘤具有廣泛的抗癌作用。如鴉膽子油乳有明顯的抑制腫瘤作用，目前已被應(yīng)用于臨床[11]，可用于肺癌、直腸癌、骨轉(zhuǎn)移癌、宮頸癌等的治療[12-14]。然而，在提取鴉膽子油過(guò)程中，鴉膽子脫脂后產(chǎn)生的藥渣卻作為畜禽飼料添加劑，導(dǎo)致大量活性成分被浪費(fèi)[15]。本研究對(duì)鴉膽子脫脂后的不同萃取部位進(jìn)行抗腫瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)三氯甲烷部位抗腫瘤活性最強(qiáng)，其中14號(hào)峰(鴉膽子苦醇)為三氯甲烷部位的特有成分?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇可通過(guò)誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)及抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[16]；也可抑制人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路，激活線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白，加速癌細(xì)胞凋亡，從而抑制癌細(xì)胞增殖[17]；還可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)而對(duì)非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移能力有明顯的抑制作用[18]。

本研究結(jié)合數(shù)學(xué)模型與計(jì)算機(jī)技術(shù)分析了鴉膽子三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、殘余部位的HPLC圖譜與藥效學(xué)指標(biāo)之間的內(nèi)在相關(guān)性，能夠?yàn)楹Y選鴉膽子不同提取部位抑制ras突變腫瘤的活性成分提供有益參考。其中三氯甲烷萃取部位抗腫瘤活性最強(qiáng)，其所有色譜峰所對(duì)應(yīng)化學(xué)成分均有進(jìn)一步研究的價(jià)值。此外，除14號(hào)峰(鴉膽子苦醇)外，峰7、8、10～12所對(duì)應(yīng)的化合物對(duì)抑制ras突變的腫瘤活性也具有重要作用，目前本研究組正在基于LC-MS技術(shù)對(duì)這些化合物進(jìn)行定性定量分析。