高雪峰，賈淵

內蒙古師范大學生命科學與技術學院，內蒙古 呼和浩特 010020

根系分泌物是植物根系在生命活動過程中向外界環(huán)境中釋放化學物質的總稱。由于其組成復雜，種類繁多，因而具有多種生態(tài)功能（吳林坤等，2015）。根系分泌物不僅可以影響根際微生物群落結構，還可改變土壤的理化性狀，并促進或抑制鄰近其他植物的生長（林文雄等，2006；王樹起等，2007）。根系分泌物中不同組分特別是特異性組分對植物本身以及根際土壤生態(tài)環(huán)境均產生著重要的影響（Kateryna et al.，2018）。土壤微生物又是土壤生態(tài)環(huán)境中最為重要且對環(huán)境變化極其敏感的生物活性因子。它們以其所具有的生物化學活性，積極參與土壤中物質的轉化過程，為植物提高有效養(yǎng)分，同時也是土壤中各種生物化學和生理學過程動態(tài)平衡的重要調節(jié)者（Buckley et al.，2001；Sun et al.，2004）?？墒牵捎诟捣置谖锪可?、成分復雜，其組分的準確鑒定以及有效組分的確定對于根系分泌物功能的實際應用是最為重要且最為缺乏的關鍵環(huán)節(jié)（Hu et al.，2018）。

根系分泌物中的有機酸在植物養(yǎng)分活化與吸收過程中有著重要的作用。最常見的有機酸分泌物有檸檬酸、阿魏酸、蘋果酸、油酸、鄰苯二甲酸、棕櫚酸和琥珀酸等，它們一方面可可引起根際周邊的Eh和pH改變，促進土壤中難溶性磷化合物溶解。另一方面可與鈣、鋁、鐵等金屬元素形成螯合物，使根際土壤中難溶性的磷釋放出來，從而顯著提高根際土壤有效磷的濃度，達到自身調節(jié)和改善營養(yǎng)狀況的目的（Zhong et al.，2019）。另外，還能與土壤中的重金屬離子發(fā)生反應，形成毒性較小的化合物，減輕毒害離子對植物根系的毒害作用（Chen et al.，2016）。因而，根系分泌物中有機酸組分的研究對于根系分泌物功能的認識有著重要現實意義。

內蒙古短花針茅荒漠草原生態(tài)系統(tǒng)，植物群落中個體在競爭中通過相互作用、相互適應、相互選擇形成了與環(huán)境資源相適應的地帶性植被。植被草層低矮、稀疏，種類組成貧乏，由20多種植物種組成。群落建群種為短花針茅（Stipa breviflora），優(yōu)勢種為無芒隱子草（Cleistogenes songorica）和冷蒿（Artemisia frigida），主要伴生種有阿氏旋花（Convolvulus ammannii）、阿爾泰狗娃花（Hetropappus altaicus）和木地膚（Kochia scoparia）等（李勤奮，2001）。目前，有關短花針茅荒漠草原生態(tài)系統(tǒng)的研究主要集中在地上部分，而地下部分制約草原生態(tài)系統(tǒng)研究的理論有待拓展。較少的研究也只是局限于土壤最為基本的理化性質方面（Akiyama et al.，2007），而植物根系分泌物的相關研究更為缺乏。本研究以內蒙古四子王旗荒漠草原群落不同生態(tài)位的5種主要植物為研究對象，采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜法（UPLC-QTof/MS）分析其根分泌物中的有機酸組分，并采用化學模擬的方法研究了4種有機酸組分對荒漠草原原位土壤中微生物數量及土壤主要養(yǎng)分的影響，以了解荒漠草原植物根分泌物組分的生態(tài)學功能。

1 實驗材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究樣地位于內蒙古農業(yè)科學院四子王旗實驗基地，地處 41°47′18″N，111°53′45″E。該區(qū)常年多風、少雨雪，晝夜溫差大，年均降水 280—300 mm，年均氣溫約3.4 ℃，無霜期90—120 d。實驗地屬典型的荒漠草原，草地植被低矮，植被覆蓋率不足30%，植物物種組成簡單貧乏。草地建群種為短花針茅（Stipa breviflora），優(yōu)勢種為無芒隱子草（Cleistogenes songorica）和冷蒿（Artemisia frigida），主要伴生種有銀灰旋花（Convolvulus ammannii）、阿爾泰狗娃花(Heteropappus altaicus）、櫛葉蒿（Neopallasia Pectinata）、野韭（Allium ramosim）等。土壤類型為淡栗鈣土，pH值為8.4—8.8，土層厚度約1 m，砂粒所占比例最大，粉粒和粘粒次之，土壤具有缺氮、少磷、富鉀、肥力低等特點（王忠武，2009）。

1.2 植物根系及土壤樣品的采集

于2018年8月在實驗地的圍封區(qū)內，挖取長勢良好的短花針茅、冷蒿、無芒隱子草、阿爾泰狗娃花和銀灰旋花各10叢，同時在草原空地用土鉆鉆取0—20 cm草地原位土壤。將植株連同土壤（盡可能保持植物根系完整）一起帶回實驗室將植物根系小心清洗干凈。土壤樣品風干后過 1 mm土壤篩，用于回接根分泌物組分模擬物的室內培養(yǎng)實驗。

1.3 根系分泌物的水培提取

將洗凈的5種植物定植于霍氏（Hoagland）營養(yǎng)液復性5 d，每天更換營養(yǎng)液一次，同時用增氧泵通氣。復性后的根系放入1% NaClO浸泡20 min，用無菌水沖洗干凈后定植于500 mL燒杯中，加無菌水至植物根部全部被浸沒。燒杯遮光處理，于室溫（25—28 ℃）條件下分別培養(yǎng)12 h后將根系取出，燒杯內液體即為收集12 h的根分泌物收集液。然后加等量水，將根系同上再放入燒杯中，培養(yǎng)24 h和48 h后，分別收集24 h和48 h的根分泌物原液。將上述收集液過濾后，用旋轉蒸發(fā)儀（HB-10）濃縮10倍。取1 mL濃縮液加3 mL甲醇混勻、離心，取上清液 1 mL過 0.22 μm 濾膜后待檢（Staniforth et al.，1999；高雪峰等，2019）。

1.4 根分泌物組分的鑒定

采用美國 Watres公司的 ACQUITY UPLCClass超高效液相色譜儀分析各樣品中的根分泌物有機酸組分。色譜條件為：ACQUITY UPLC C18BEN色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。流動相：0.1%甲酸水 (A)—0.1%甲酸乙腈（B）；梯度洗脫（0—1 min，95% A；1.1—5 min，80%—25% A；5—12 min，25%—8% A；12—12.1 min，8% A；12.1—17 min，0% A；17.1—21 min，95%A）。樣品室溫度：10 ℃；柱溫：40 ℃。體積流量：0.4 mL·min-1；進樣量1 μL。質譜條件：ESI負離子檢測方法；干燥氣溫度400 ℃，體積流量100 L·h-1；毛細管電壓2.5 kV；碎裂電壓80 V；錐孔電壓40 V。掃描方式：MS全掃描。質量范圍：100—1500 Da。

1.5 土壤處理

以植物根系分泌物中常見的7種有機酸組分檸檬酸、阿魏酸、蘋果酸、油酸、鄰苯二甲酸、棕櫚酸和琥珀酸為標準樣品。經UPLC-QTof/MS法分析表明，在波長210 nm檢測時，標準樣品中的7種有機酸分離效果均較好。依據5種植物根分泌物的UPLC檢測結果，購置了4種有機酸棕櫚酸、油酸、鄰苯二甲酸和琥珀酸（Sigma公司，分析純）。將固態(tài)的棕櫚酸和琥珀酸溶于甲醇溶液配制成飽和溶液原液，分別取4種有機酸原液0、0.5、1、1.5 mL于1000 mL的玻璃瓶，各玻璃瓶加無菌水5 mL并搖晃使其分散，然后加風干土100 g，用玻璃棒攪勻后加蓋密封。實驗共設13個處理，分別為棕櫚酸 3 種質量濃度處理 LZ（5 μL·g-1）、MZ（10 μL·g-1）和 HZ（15 μL·g-1），油酸 3種質量濃度處理 LO（5 μL·g-1）、MO（10 μL·g-1）和 HO（15 μL·g-1），鄰苯二甲酸 3種質量濃度處理 LP（5 μL·g-1）、MP（10 μL·g-1）和 HP（15 μL·g-1）與琥珀酸 3 種質量濃度處理 LS（5 μL·g-1）、MS（10 μL·g-1）和 HS（15 μL·g-1）。對照 CK 質量濃度為 0 μL·g-1。每一處理設3重復，共39個處理。將玻璃瓶置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3周。濃度的設置依據根系分泌物的實際濃度并參考了曲曉華等（2015）的方法確定。

1.6 土壤微生物及養(yǎng)分分析

細菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌采用馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，放線菌采用高氏Ⅰ號培養(yǎng)基（周德慶等，2013）。土壤有機碳（SOC）采用重鉻酸鉀容量法測定，速效氮（AN）采用堿解擴散法測定，速效磷（AP）采用0.5 mol·L-1NaHCO3法測定，含水量采用烘干法測定，土壤 pH值采用酸度計（FE28-Standard）測定（鮑士旦，2013）。各處理均設3重復。

1.7 數據處理與分析

采用 SPSS 18.0單因素方差分析（One-way ANOVA）法對各處理土樣中的微生物數量及土壤性狀進行差異顯著性分析，利用Canoco 4.5軟件對微生物數量與土壤養(yǎng)分間的相關性進行冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）分析并制圖（李婷婷等，2015）。

2 結果與分析

2.1 5種植物根分泌物中有機酸組分分析

內蒙古荒漠草原建群種短花針茅，優(yōu)勢種冷蒿和無芒隱子草以及伴生種銀灰旋花和阿爾泰狗娃花根分泌物中有機酸組分的 UPLC-QTof/MS檢測結果見表1。

由表1可知，5種植物共檢測到棕櫚酸、油酸、鄰苯二甲酸和琥珀酸4種有機酸分泌物。其中，短花針茅根分泌物中檢出目標有機酸為棕櫚酸和油酸2種，收集12、24、48 h 3個時間段的棕櫚酸相對含量均高于油酸。無芒隱子草根分泌物中檢出棕櫚酸、油酸和鄰苯二甲酸3種有機酸。3個不同時間段均為棕櫚酸相對含量最高，油酸次之，鄰苯二甲酸最低。冷蒿根分泌物中只有收集12 h的樣品中檢測到鄰苯二甲酸，而且相對含量極低，僅有0.001%。銀灰旋花根分泌物中共檢到棕櫚酸、油酸、鄰苯二甲酸和琥珀酸4種有機酸，3個不同時間段4種有機酸的相對含量排序為棕櫚酸＞油酸＞鄰苯二甲酸＞琥珀酸。阿爾泰狗娃花根分泌物中共檢測到棕櫚酸和油酸2種有機酸，3個不同時間段的棕櫚酸相對含量均高于油酸。總體來看，5種植物根分泌物中有機酸含較低，有機酸組成相似但不完全相同。除冷蒿外，其余4種植物根分泌物中均含有棕櫚酸和油酸，而且均為棕櫚酸的含量（0.490%—0.671%）高于油酸含量（0.047%—0.069%）。冷蒿、無芒隱子草和銀灰旋花根分泌物中均含有鄰苯二甲酸，但含量很低，僅為 0.001%—0.007%。銀灰旋花根系分泌物中的有機酸種類最多，除棕櫚酸、油酸、鄰苯二甲酸外，還有琥珀酸（0.002%）。

2.2 有機酸分泌物組分對草原土壤微生物的影響

不同濃度的棕櫚酸（LZ、MZ、HZ）、油酸（LO、MO、HO）、鄰苯二甲酸（LP、MP、HP）和琥珀酸（LS、MS、HS）對土壤中細菌、真菌、放線菌和微生物總數的影響分析結果見表2。

由表2可看出，對照CK土壤中，三大類群可培養(yǎng)的微生物中，細菌數量最多，放線菌次之，真菌含量最低。細菌數量是放線菌的2倍左右，是真菌數量的近50倍?？梢?，細菌仍然是內蒙古荒漠草原土壤中微生物的主體。表2表明，不同濃度的4種有機酸分泌物組分對土壤微生物的影響不完全相同。其中，與CK相比，不同濃度的棕櫚酸和油酸均可使土壤中的細菌、真菌和放線菌三大類群微生物數以及微生物總數顯著增加（P＜0.05），而且濃度越大，增加越顯著。不同質量濃度的鄰苯二甲酸對放線菌無顯著影響，低質量濃度（5 μL·g-1）時對細菌、真菌以及微生物總數也無顯著影響，而在中（10 μL·g-1）、高質量濃度（15 μL·g-1）時，對細菌有抑制作用，而對真菌有促進作用。琥珀酸在質量濃度為5—15 μL·g-1范圍內，低濃度時對細菌和真菌有顯著促進作用，對放線菌和微生物總數無顯著影響，中濃度時對細菌和微生物總量無顯著影響，卻可以顯著地促進真菌和放線菌的增加，高濃度時對細菌無顯著影響，可以使土壤真菌數量顯著增加，放線菌數量顯著降低，使微生物總數顯著降低。

表1 根分泌物中有機酸及其含量Table 1 Relative content of organic acids in root exudates

表2 不同濃度的4種有機酸處理后土壤中微生物的數量Table 2 The number of microorganisms in soil after treatment with four organic acids at different concentrations cfu·g-1

2.3 有機酸分泌物組分對草原土壤養(yǎng)分的影響

不同質量濃度的 4種有機酸對土壤有機碳（SOC）、速效氮（AN）、速效磷（AP）、土壤pH值和土壤含水量（SM）的影響見表3。

由表3可知，與CK相比，3種不同質量濃度的棕櫚酸、油酸和琥珀酸的加入均可使土壤中的有機碳、速效氮和速效磷的含量顯著增加（P＜0.05），而且均表現為濃度越大增加越顯著。而鄰苯二甲酸的加入可使土壤有效磷顯著增加，卻使土壤有機碳和速效氮顯著降低。不同濃度的4種有機酸均可使土壤的pH值顯著降低，而且有機酸的濃度越大，pH值降低越顯著，但對土壤含水量均無顯著影響。除鄰苯二甲酸外，不同濃度的棕櫚酸、油酸和琥珀酸的加入均使土壤有機碳含量顯著增加。表明外源加入的有機酸物質在培養(yǎng)時間內均沒有完全被土壤微生物轉化利用而導致土壤有機碳含量較CK增加。而只有鄰苯二甲酸的加入使土壤中有機碳含量顯著降低，而且濃度越高降低越顯著，原因可能是鄰苯二甲酸的加入激發(fā)了土壤中原有有機碳的分解或者是鄰苯二甲酸容易被微生物利用分解。對土壤速效氮而言，4種有機酸中，棕櫚酸對土壤速效氮的促進作用最大，而鄰苯二甲酸的加入導致土壤速效氮顯著降低。4種有機酸都可顯著提高土壤速效磷含量，而且效果相近。4種有機酸均可使土壤pH值下降，而且棕櫚酸的效果最好。因此，相比較而言，棕櫚酸使土壤中的有機碳、速效氮、速效磷的增加最為顯著，而且使原本偏堿性的荒漠草原土壤pH值下降幅度也最大，是4種有機酸中對土壤的肥力狀況改善效果最好的。

表3 不同質量濃度的4種有機酸處理后的土壤養(yǎng)分Table 3 The soil nutrients treated with four organic acids at different concentrations

2.4 微生物與土壤環(huán)境因子間的冗余分析

13個樣本中土壤微生物與土壤理化因子之間的冗余（RDA）分析結果如圖1所示。

圖1 土壤微生物與環(huán)境因子的RDA分析Fig. 1 Redundancy analyses between soil microorganisms and physicochemical properties

由圖1可知，第1軸和第2軸的累計貢獻率為96.55%。第一軸能夠解釋所有變量的 90.80%，且與土壤有機碳、速效氮和pH值有顯著的相關性。表明了有機碳、速效氮和pH值在水平方向影響了土壤微生物種群的分布。第二軸能解釋所有變量的5.75%，速效磷與第二軸存在顯著的相關性，表明土壤速效磷影響了垂直方向上土壤微生物群落的分異，并將不同樣本區(qū)分開。總體上，土壤有機碳、速效氮、速效磷和pH值對土壤微生物數量影響均較大，而且這些因素對排序結果的貢獻率相似（箭頭長度相近）。在13個樣本中，與對照CK距離較近的樣本有LZ、LO、MO和LS，較遠的樣本包括 HZ、HP、MS和HS，表明了低濃度（5 μL·g-1）的棕櫚酸、琥珀酸、油酸以及中濃度（10 μL·g-1）的油酸對土壤微生物的影響很難小，而高濃度（15 μL·g-1）的棕櫚酸、鄰苯二甲酸、琥珀酸以及中濃度（10 μL·g-1）的琥珀酸對土壤微生物的影響較大。進一步表明4種有機酸均隨濃度增加對土壤三大類群微生物的影響越大。同時可看出，環(huán)境因子與土壤微生物間的關系為，土壤細菌、真菌放線菌和微生物總數與速效氮和有機碳均呈正相關關系，而與pH值呈負相關關系。

3 討論

根分泌物的組成較為復雜，通常情況下，同種植物的根系分泌物組成有較高的相似性，不同植物的根系分泌物種類差別較大（何海斌等，2005；Paterson et al.，2007）。有機酸作為分泌物中起關鍵作用的一類物質，其組成和數量也與植物種類以有密切關系。如油菜根系分泌物中的有機酸主要組分為檸檬酸和蘋果酸，而蘿卜根系分泌物中的有機酸主要為酒石酸、丁二酸和蘋果酸（涂書新等，2010）。小麥根分泌物的有機酸主要組分為棕櫚酸（Pan et al.，2013；Xu et al.，2013）。不同種煙草根分泌物中的有機酸組分和含量不同，但含有共同組分甲酸，且甲酸含量顯著高于其他有機酸（余浩等，2018）；蓖麻根分泌物中含有草酸、乙酸、丙酸、蘋果酸、檸檬酸和乳酸6種有機酸（高媛媛等，2018）。傘莎草根分泌物在高濃度磷脅迫下含有鄰苯二甲酸和間苯二羧酸（張建聰等，2019）。本研究采用 UPLC-QTof/MS對荒漠草原建群種短花針茅、優(yōu)勢種無芒隱子草和冷蒿以及主要伴生種銀灰旋花和阿爾泰狗娃花的3個不同收集時間段的根分泌物分析結果表明，5種不同植物根分泌物中的有機酸組成及其含量雖然不完全相同，但也有一定的相似性。其中4種植物（冷蒿除外）根分泌物中均含有棕櫚酸和油酸2種共同組分，而且棕櫚酸是該4種植物的主要有機酸組分。同時，每種植物的 3個收集時間段（12、24、48 h）分泌物組分和含量差異均不大。暗示了在相同生長環(huán)境中的不同類群植物的根分泌物有一定程度的相似性，這些共有的分泌物極可能有利于他們適應其生存環(huán)境。正如目前研究認為，根系分泌物的產生是植物根部長期進化的結果，是植物體適應環(huán)境的一種體現，不是一個完全被動的過程。因為植物的任何代謝功能都會直接或間接地消耗碳源和能量（吳林坤等，2015；Kateryna et al.，2018）。

根系分泌物作為植物與根際微生物相互作用的媒介，其不僅為根際微生物提供碳源和能源，而且不同植物根系分泌物的種類和數量也影響根際微生物群落的組成、數量及活性（吳彩霞等，2009；王明霞等，2012）。棉花根系分泌物對棉田土壤微生物影響的研究表明,中、高濃度棉花根系分泌物能顯著增加土壤中細菌的數量，而不同濃度處理的土壤對放線菌數量的影響不顯著（周慧杰，2013）。一定濃度的花生根系分泌物能夠明顯改變土壤微生物學特性及群落功能多樣性（黃玉茜等，2015）。入侵植物假高粱根系分泌物對入侵地土壤微生物種群的影響具有選擇性，對部分細菌類群有顯著促進作用，而對部分細菌類群則顯示抑制作用（劉純等，2013）。本研究中荒漠草原植物的4種有機酸分泌物組分對土壤中三大類群微生物數量的影響分析顯示，棕櫚酸和油酸均可使細菌、真菌、放線菌以及微生物總數均能顯著增加。鄰苯二甲酸對細菌和微生物總數有抑制作用，而對真菌有促進作用。琥珀酸對細菌和真菌有促進作用，對放線菌的影響表現為低促高抑的濃度效應。表明了根系分泌物不同組分對根際土壤微生物的影響并不完全相同，而根系分泌的主要組分（棕櫚酸和油酸）對三大類微生物都有促進作用，可提高荒漠草原植物根際土壤微生物的活性。揭示了植物根系在分泌過程中具有主動調控分泌物組分能力，是植物適應其生存環(huán)境的一種生理調節(jié)機制。

根系分泌物不僅影響根際土壤中微生物群落組成，而且還可以改變根際土壤的理化特性（趙小亮等，2009）。根系分泌物可通過改變根際土壤pH值、氧化還原條件或通過螯合作用增加某些養(yǎng)分的溶解度和移動性，進而促進植物對養(yǎng)分的吸收（徐文靜等，2014）。根系分泌物組分模擬物對土壤鉀素活化效果顯著（何冰等，2015）。本研究中4種有機酸組分的3種濃度處理均可降低荒漠草原土壤的pH值，同時提高了土壤速效氮和速效磷的含量，對土壤理化性狀有改善作用，而且棕櫚酸的效果最好。有研究表明，外源添加棕櫚酸能促進黃瓜、番茄和西瓜的生長（Liu et al.，2008；Chu et al.，2014），外源添加鄰苯二甲酸對胡蘿卜種子萌發(fā)、幼苗葉片滲透的影響表現為低促高抑的濃度效應（楊延杰等，2013）。表明了植物根分泌物中的有機酸組分可以改善根際土壤微環(huán)境，進而促進植物的生長。另外，結合RDA分析表明，植物有機酸分泌物組分進入土壤后，首先降低了根際土壤的pH值，進而導致土壤中微生物類群的變化，在微生物組成及活性的變化與pH值變化的綜合作用下，改變了土壤中的物質轉化與循環(huán)，促進了土壤速效養(yǎng)分的活化，有利于植物對養(yǎng)分的吸收與利用，進而促進了植物的生長。

4 結論

內蒙古短花針茅荒漠草原的短花針茅和阿爾泰狗娃花根分泌物均檢測到棕櫚酸和油酸。無芒隱子草根分泌物共檢測到棕櫚酸、油酸和鄰苯二甲酸3種有機酸組分。冷蒿根分泌物中只檢測到鄰苯二甲酸1種有機酸組分。銀灰旋花根分泌物中共檢測到棕櫚酸、油酸、鄰苯二甲酸和琥珀酸4種有機酸組分。4種有機酸分泌物組分均對根際土壤細菌、真菌、放線菌以及土壤pH值及有效養(yǎng)分有顯著的影響，特別是分泌物中含量較高的棕櫚酸和油酸，能夠顯著提高土壤微生物活性和活化土壤速效養(yǎng)分，能夠改善荒漠草原植物根際土壤微環(huán)境。