周怡雯，于清峰

(1 江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2 中國(guó)藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京 211198)

復(fù)方老鸛草膠囊制劑是由老鸛草、筋骨草、伸筋草三種中藥材組成，臨床上可用于祛風(fēng)濕，治療風(fēng)濕麻痹、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。老鸛草是常用中藥，為牻牛兒苗科植物牻牛兒苗ErodiumstephanianumWilld.、老鸛草G.wilfordii或野老鸛草GeraniumcarolinianumL.的干燥地上部分[1]，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)脈、止瀉痢、抗氧化、抗菌抗病毒的作用[2-3]，其所含主要化學(xué)成分包括黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)、揮發(fā)油和有機(jī)酸等，多年的臨床醫(yī)療實(shí)踐證實(shí)了其在風(fēng)濕性疾病上的良好功效[4]。筋骨草的主要有效成分為環(huán)烯醚萜類(lèi)，而哈巴苷與乙酰哈巴苷是其中研究較多且有明顯抗病毒、抗腫瘤活性的成分之一，其具有抗氧化、抗瘧、抗菌、抗炎、抗腫瘤、降血糖、收縮血管等藥理活性[5-7]。伸筋草是石松科植物石子藤的全草[8]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抑制乙酰膽堿酯酶活性、有效減少體內(nèi)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生等作用，臨床常用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、頸椎病和急慢性軟組織損傷等疾病[9]。

本文是利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)復(fù)方老鸛草膠囊的最佳提取工藝進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)中主要研究了乙醇濃度、溶媒用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)這四個(gè)因素對(duì)復(fù)方老鸛草膠囊提取工藝的影響。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是為尋求最優(yōu)化水平組合的一種高效的多因素多水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方的提取工藝優(yōu)化篩選等方面[10]。本實(shí)驗(yàn)首先考察了乙醇濃度的單因素考察，然后進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)得到的浸膏產(chǎn)率和乙酰哈巴苷含量的綜合評(píng)分，最后找出并驗(yàn)證了得到的最佳提取工藝。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；島津高效液相色譜儀，日本島津公司；ZK-82B真空干燥箱，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司；RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；AL204電子分析天平，梅特勒-多利多儀器(上海)有限公司；DT-100電子天平，美國(guó)雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司。

老鸛草，伸筋草，筋骨草，本地藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定老鸛草為牻牛兒苗科植物牻牛兒苗的干燥地上部分，伸筋草為石松科石松屬植物石松(LycopodiumjaponicumThunb.)的干燥全草，筋骨草經(jīng)鑒定為唇形科植物金瘡小草(AjugadecumbensThunb.)；乙酰哈巴苷對(duì)照品(純度>99.9%，批號(hào)111925-201801)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純)，藥用乙醇(95%)，南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

乙酰哈巴苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精確稱(chēng)取干燥恒重的乙酰哈巴苷標(biāo)準(zhǔn)品20 mg置于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶液適量溶解稀釋至刻度線并搖勻，即得乙酰哈巴苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2 mg/mL)。

1.3 提取工藝

稱(chēng)取老鸛草、伸筋草、筋骨草各10 g，置于圓底燒瓶中，加入不同濃度的乙醇回流，過(guò)濾，濾液旋蒸除去大量溶媒，將剩余溶液倒入已稱(chēng)重的蒸發(fā)皿中，水浴除去水分。經(jīng)過(guò)真空干燥、冷卻至室溫，稱(chēng)重，計(jì)算浸膏得率。取干浸膏適量，加甲醇超聲處理30 min，使其溶解于甲醇，定容至一定體積，搖勻，微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液經(jīng)HPLC-UV測(cè)定乙酰哈巴苷含量。

1.4 液相色譜條件

色譜條件為：Phenomenex Luna C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈-水(13:87，V/V)，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為207 nm。

1.5 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)考察了乙醇濃度、溶媒用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)四個(gè)因素，先后通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)以及L9(34)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以提取液中測(cè)得的乙酰哈巴苷含量以及浸膏得率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，研究各因素對(duì)提取工藝的影響程度及找出提取復(fù)方老鸛草膠囊的最佳工藝，實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 乙酰哈巴苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

分別精確量取乙酰哈巴苷標(biāo)準(zhǔn)溶液50、100、200、300、400 μL加甲醇至500 μL，搖勻，靜置，以制備0.02、0.04、0.08、0.12、0.16 mg/mL的乙酰哈巴苷溶液。分別用HPLC-UV檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=5146.65C+21.48，R2=0.9991。

圖1 乙酰哈巴苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 供試品溶液的制備及陰性對(duì)照

筋骨草所含有效成分為環(huán)烯醚萜類(lèi)，其中乙酰哈巴苷的含量最高。分別稱(chēng)取老鸛草、伸筋草、筋骨草各10 g，置于圓底燒瓶中，用200 mL，50%的乙醇回流2 h，提取一次，經(jīng)過(guò)濾、旋蒸、水浴揮干、真空干燥、研磨、超聲溶解30 min后，經(jīng)HPLC-UV測(cè)定得到相應(yīng)譜圖2(a)。同樣稱(chēng)取老鸛草、伸筋草各10 g，經(jīng)相同方法處理后通過(guò)HPLC-UV測(cè)定得到譜圖2(b)。由圖2(a)可知，乙酰哈巴苷在8.1 min出峰，而圖2(b)在8.1 min處并無(wú)乙酰哈巴苷的峰，說(shuō)明陰性對(duì)照溶液對(duì)乙酰哈巴苷測(cè)定無(wú)干擾，方法專(zhuān)屬性較好。

圖2 老鸛草、伸筋草、筋骨草醇提物(a)；老鸛草、伸筋草醇提物(b)液相色譜圖

2.3 醇濃度的單因素條件考察

筋骨草中含有較高含量的乙酰哈巴苷，所以以乙酰哈巴苷的含量和浸膏得率作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，用于提取工藝條件的優(yōu)選。本實(shí)驗(yàn)中采用溶媒用量為1:10，提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)為1次，考察不同乙醇濃度(40%、50%、60%、70%)對(duì)乙酰哈巴苷總含量和浸膏得率的影響，通過(guò)用HPLC-UV測(cè)定總乙酰哈巴苷的提取量，選用乙酰哈巴苷提取量最多的乙醇濃度為提取溶劑的濃度[11]。

結(jié)果表明(表3)，乙醇濃度在50%的條件下乙酰哈巴苷的含量和浸膏得率都最高，該濃度條件最好，因此正交實(shí)驗(yàn)中以50%為中心，選取40%、50%、60%三個(gè)濃度進(jìn)行最佳提取工藝考察。

表3 醇濃度單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.1 正交實(shí)驗(yàn)

取老鸛草、筋骨草、伸筋草各10 g，共九份，按表1的因素水平和L9(34)正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定所得的浸膏率和乙酰哈巴苷含量。

2.4.2 正交結(jié)果分析

考慮到浸膏得率和乙酰哈巴苷含量可能互相影響，因此用浸膏率及乙酰哈巴苷得率的綜合評(píng)分尋找最佳工藝，將浸膏率的權(quán)重定為0.5，乙酰哈巴苷得率權(quán)重定為0.5，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 正交設(shè)計(jì)表L9(34)

方差分析見(jiàn)表5。

表5 方差分析表

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，表5表明各因素影響大小順序?yàn)樘崛〈螖?shù)(D)>溶媒用量(B)>乙醇濃度(A)>提取時(shí)間(C)，優(yōu)選的最佳工藝為A1B3C1D2，即采用40%乙醇，12倍溶媒用量，提取2次，每次1 h。

圖3 正交因素對(duì)綜合評(píng)分的影響

2.5 優(yōu)選條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)中由綜合評(píng)分法篩選出最佳工藝A1B3C1D2，即40%乙醇，12倍量，提取2次，每次1 h。稱(chēng)取與正交實(shí)驗(yàn)同等量的藥材，按照最佳工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，平行2次，測(cè)得浸膏率、乙酰哈巴苷得率，檢驗(yàn)此工藝是否穩(wěn)定可行。

表6中驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)A1B3C1D2醇提條件與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，故將A1B3C1D2即40%乙醇，12倍量，提取2次，每次1 h，確定為最佳提取工藝條件。

表6 驗(yàn)證結(jié)果

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)、正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得出老鸛草醇提的最佳工藝條件為A1B3C1D2即乙醇濃度為40%，溶媒用量為12倍量，提取2次，每次1 h。老鸛草提取結(jié)果影響最大的是提取次數(shù)，其次是溶媒用量，乙醇濃度和提取時(shí)間，經(jīng)過(guò)工藝驗(yàn)證證明此工藝的穩(wěn)定可行性。

本實(shí)驗(yàn)為復(fù)方老鸛草膠囊的提取研究提供了一定的依據(jù)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的理論依據(jù)。