夏 科, 吳巧芬, 趙志國, 蔣慶鴻, 仇 碩

(廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006)

石斛屬(DendrobiumSwartz)為蘭科(Orchidaceae)三大屬之一，其原種將近2 000種，我國約60多種[1]。石斛屬植物有白色、黃色、綠色、粉紅色、粉紫色、紫紅色、紅棕色和棕色等諸多花色，形態(tài)各異，具有很高的觀賞價值，是世界“四大觀賞洋蘭”之一，也被譽為“父親節(jié)之花”。石斛屬植物含有石斛堿、石斛銅堿、石斛胺等多種生物堿類中成藥成分，其中鐵皮石斛更被譽為“中華九大仙草”之首[2]。因而，石斛屬植物是一類兼具觀賞和藥用價值的重要植物，備受消費者鐘愛。

早期，國內對石斛屬植物的研究主要集中在資源調查與引種栽培[3]、分類鑒定[4]、雜交育種[5]、組織培養(yǎng)[6]、花期調控[7]等方面，并取得很多重要的研究成果。近年來，隨著生物學技術的不斷發(fā)展，已利用分子生物學技術開展石斛屬分類鑒定[8]、基因的克隆與分析[9]、遺傳轉化[10-11]等研究。成熟的組織培養(yǎng)體系是進行遺傳轉化研究的基礎，隨著組織培養(yǎng)技術在石斛屬植物中的廣泛應用, 其基因工程研究也取得了很大進展[12-14]。本文從石斛屬植物再生體系建立及遺傳轉化等方面進行概述，探討了目前遺傳轉化存在的問題并提出解決方案，分析了石斛屬植物的組織培養(yǎng)未來發(fā)展趨勢和商業(yè)化生產(chǎn)應用，以期為石斛屬植物分子生物學相關的研究以及基因工程培育新品種奠定基礎。

1 石斛屬植物組織培養(yǎng)及再生體系的建立

1.1 培養(yǎng)基質及植物生長調節(jié)劑

自1937年第1個植物組織培養(yǎng)基誕生以來，已衍生出上千種培養(yǎng)基[15]，但能滿足多數(shù)物種常用的培養(yǎng)基種類卻相對較少，主要有White、MS、B5、SH、N6、NN、DKW、WPM、H、Miller、Heller、ER、NT、LS等14種[16]。石斛屬植物組織培養(yǎng)以MS和1/2MS培養(yǎng)基為主，在培養(yǎng)基中加入適當?shù)奶烊惶崛∥?，如椰子汁[17]和香蕉泥[18]等，對石斛原球莖的形成及生長有較大的促進作用。石斛屬植物組織培養(yǎng)過程中常需要添加外源植物生長調節(jié)劑，如NAA、BA、KT等，其對外植體的誘導、增殖分化、生根、發(fā)芽均起到關鍵性的作用[19]。植物細胞分裂、誘導器官形成和次生產(chǎn)物的合成所需植物生長調節(jié)劑的種類、配比和濃度不同，因此不同的石斛品種應選擇合適的1種或多種植物生長調節(jié)劑進行誘導。此外，培養(yǎng)基中加入適量的生物胺，能促進鐵皮石斛的原球莖轉化為芽[20]。目前，石斛屬已有多種組培快繁的成功報道，如鐵皮石斛[21]、秋石斛[22]、翅萼石斛[23]和報春石斛[24]等。

1.2 外植體材料的選擇

目前，石斛屬組培苗大多通過誘導外植體形成原球莖(類原球莖)，然后分化培養(yǎng)產(chǎn)生芽或者叢生芽而獲得。陳齊明等[25]研究表明，石斛屬莖尖和側芽頂端分生區(qū)細胞的分裂能力強，容易誘導出原球莖；明興加等[26]認為，利用假鱗莖可誘導出腋芽。雖然莖尖、側芽和莖段都是高質量的外植體，但其來源有限，特別是對于珍稀石斛品種，很可能喪失母本。石斛種子可進行非共生萌發(fā)，目前已有多個物種通過無菌播種技術進行工廠化生產(chǎn)，如鐵皮石斛[27]、竹葉石斛[28]和兜唇石斛[29]等，但利用種子進行培養(yǎng)易產(chǎn)生性狀分離。此外，石斛屬植物的根、葉、莖段等部位也可以作為外植體進行誘導，但成功率較低或者難度較大。目前，已有利用根尖作外植體進行誘導的成功報道[30]，但根部因有大量的內生菌，較難脫毒，易污染。而以葉片和莖段作為外植體具有母本傷害小、數(shù)量大、取材不受季節(jié)影響等優(yōu)勢，但誘導率較低，葉片誘導率僅1.95 %～11.99 %，莖段僅1.02%～35.57%[31]。

外植體的選擇是能否成功誘導原球莖的關鍵，選取較幼嫩且生長旺盛的部位作為外植體是誘導原球莖形成的理想來源，如莖尖、側芽、莖切段和種子等。

1.3 離體培養(yǎng)條件

無論是在自然條件還是在離體培養(yǎng)條件下，植物的光和溫度信號都是互相聯(lián)系的[32]。不同的光照和溫度等培養(yǎng)條件對石斛屬原球莖增殖分化的影響不同[33]，可能是光照改變了激素水平從而影響原球莖增殖分化[34]。Lin et al[33]研究表明，藍光誘導鐵皮石斛原球莖的分化率最高。秦廷豪[35]研究發(fā)現(xiàn)，溫度對鐵皮石斛原球莖增殖有明顯影響，低溫有利于減少分生苗的數(shù)量，形成健壯高大的試管苗。Luo et al[36]發(fā)

現(xiàn)，低溫處理可以顯著提高霍山石斛原球莖的分化率。目前，石斛屬植物組培快繁過程中通常選擇的溫度為(25±1) ℃、光照強度1 600～2 000 lx、光照時間10～12 h。

1.4 移栽馴化

張玲菊等[37]研究表明，光照強度會影響不同種源鐵皮石斛的凈光合速率、光補償點和光飽和點。不同光源對石斛種苗的影響不同，如紅光有利于鐵皮石斛種苗根系與苗高生長，藍光有利于莖增粗與生物堿積累，而紅藍混光(紅光∶藍光=8∶2)則有利于提高葉綠素、多糖含量及酶活性[38]。光照強度對霍山石斛生長速度影響較大，僅早晚光強較低時有光合積累[39]；光照強度還會改變金釵石斛吸收和同化CO2的途徑，使其在CAM途徑與C3途徑間轉換[40]。溫度和濕度對石斛光合速率的變化也有顯著影響，在不同的溫度和濕度下，光照強度的變化對凈光合速率的影響有較大差異[41]，從而影響石斛屬植物的生長及多糖含量的積累[42-43]。此外，不同移栽基質和移栽季節(jié)對組培苗移栽成活率也有很大影響，石斛屬植物組培苗移栽馴化常用的栽培基質是樹皮和水苔，但需要根據(jù)具體種類或者栽培地的環(huán)境選擇不同配比[23-24]。

2 石斛屬植物遺傳轉化研究

2.1 遺傳轉化的受體

原球莖是蘭科等少數(shù)植物特有的一種生長狀態(tài)，易誘導，共培養(yǎng)后瞬時表達率非常高，通過誘導形成愈傷組織，可再生成類原球莖，進而再生植株，是最理想的轉化受體[44]。石斛屬植物遺傳轉化的受體大多采用原球莖或類原球莖，如鐵皮石斛[45]、流蘇石斛[46]、金釵石斛[47]等。此外，石斛的愈傷組織和花序頂端組織也可作為受體進行遺傳轉化研究，Tee et al[48]認為，轉化的愈傷組織細胞不需經(jīng)過愈傷化發(fā)育或胚發(fā)育階段，能有效避免嵌合體的產(chǎn)生，是較理想的轉化受體細胞，但其最佳轉化狀態(tài)難以控制。

2.2 遺傳轉化的方法

植物遺傳轉化主要有以載體為媒介的基因轉移和直接轉移2種方法[49]。其中，載體法需要借助農(nóng)桿菌侵染才能實現(xiàn)外源基因的導入；直接轉移法則是通過物理化學方法將目的基因直接導入受體細胞，主要包括：基因槍法、電擊法、超聲波法、花粉管通道法、多聚物介導法等[50]。每個物種受體的特征不一樣，應選擇最適的方法進行遺傳轉化。目前，石斛屬植物遺傳轉化應用最多的是農(nóng)桿菌介導法和基因槍法。

2.2.1 農(nóng)桿菌介導法 農(nóng)桿菌介導法是指將目的基因融合到農(nóng)桿菌細胞中含有Ti質?；騌i質粒的一段T-DNA(transferring DNA)，使目的基因整合到植物的染色體上[51]。雖然農(nóng)桿菌介導法插入的外源基因多數(shù)為單拷貝，且具有符合孟德爾遺傳規(guī)律和方法簡單等優(yōu)勢，但該方法存在物種選擇有限、易產(chǎn)生嵌合體、耗時、轉化效率低等缺陷。

農(nóng)桿菌介導法是目前石斛屬植物遺傳轉化使用最頻繁的方法之一。Uddain et al[44]研究表明，與大腸桿菌相比，農(nóng)桿菌對石斛屬植物原球莖的趨向性更積極。目前，用于石斛屬植物遺傳轉化的農(nóng)桿菌有：LBA4404[10]、EHA105[52]、AGL1[52]、GV3101[53]、C58[46]等，其中LBA4404和EHA105是使用最頻繁和侵染能力較強的2種菌株。張妙彬等[54]研究表明，相同條件下，EHA105比LBA4404對石斛蘭類原球莖的侵染能力更強。適合石斛屬植物表達的載體有：pCAMBIA1301[52，55]、pCAMBIA1303[56]、pCAMBIA1304[14,57]、pCAMBIA1305[58]、pCAMBIA3301[45]、pBI121[10]、pIG121[53]等，其中使用較頻繁的載體是pCAMBIA1301?？股卦谑鷮龠z傳轉化中十分重要，會直接影響轉化子的篩選。常用于石斛屬遺傳轉化篩選的抗生素有：氨芐青霉素、羧芐青霉素、頭孢噻肟、頭孢哌酮、潮霉素和卡那霉素。Cao et al[53]研究發(fā)現(xiàn)，美羅培南作為一種新型抗生素比其他常用抗生素具有更高效的抗農(nóng)桿菌特性。

目前，農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化研究在一些石斛雜交種[10]、金釵石斛[52]、春石斛[59-60]、密花石斛[61]、鐵皮石斛[62]和流蘇石斛[46]等石斛屬植物中已見報道。Yu et al[10]將反義DOH1序列導入石斛蘭并成功獲得轉基因植株，通過驗證發(fā)現(xiàn)植株出現(xiàn)多芽發(fā)育異常表型；李鳳華等[63]利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉化金釵石斛莖、葉片和葉柄，并成功誘導出石斛毛狀根，此結果將為石斛生物堿的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎；張振華[64]將建蘭的花葉病毒外殼蛋白基因(CyMV-CP)成功導入秋石斛的2個品種體內，開創(chuàng)了石斛屬抗花葉病毒的研究先河；崔波等[45]將ACC合成酶反義序列成功導入鐵皮石斛；黃超群[46]和楊翠芹[47]利用正交設計方案優(yōu)化石斛屬遺傳轉化體系，對研究石斛屬品種的遺傳轉化具有重要的參考價值。

2.2.2 基因槍法 基因槍法又稱粒子轟擊細胞法或微彈技術，是把粘有DNA的細微金粉打向細胞，整合到植物染色體上，完成基因轉移[65]。該方法具有不受受體類型限制、操作簡單省時、可控度高、瞬時轉化頻率相對較高等優(yōu)勢，但存在價格昂貴、后代遺傳不穩(wěn)定等缺陷。1992年，Kuehnle et al[66]最早采用基因槍法轉化石斛蘭并成功獲得轉化子，此后該方法被應用于多種石斛屬植物遺傳轉化。Chia et al[67]利用基因槍法將luc標記基因導入石斛蘭原球莖，并首次成功獲得轉化植株；密花石斛、金釵石斛和蝴蝶石斛也用該方法成功獲得轉基因植株[55,68]；楊雪飛[12]利用基因槍法將大麥抗旱耐鹽基因LEA3導入鐵皮石斛原球莖，成功獲得抗旱耐鹽新品種。

目前，農(nóng)桿菌介導法和基因槍法已應用于多種石斛屬植物遺傳轉化，但相對于雙子葉植物和被子植物，其轉化效率較低，一般瞬時轉化頻率不超過60%，而通過抗生素篩選后，獲得抗性植株的概率更低[55，59]。崔波等[45]研究表明，不同農(nóng)桿菌濃度和AS濃度對鐵皮石斛原球莖的GUS瞬時轉化率分別為0～22.22%和9.52%～58.82%；Yu et al[68]利用基因槍轉化Dendrobiumhybrid時發(fā)現(xiàn)，通過潮霉素篩選后，僅得到5%～10%的抗性植株；Men et al[55]研究蝴蝶石斛和金釵石斛遺傳轉化時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)潮霉素篩選后，分別得到12%和2%的抗性植株。因此，如何提高石斛屬植物的轉化效率仍是當前亟待解決的問題。

2.2.3 蘭科植物其他遺傳轉化方法 蘭科作為一個進化程度較高的大科，至今已開展很多遺傳轉化的研究，除利用上述兩種常見的遺傳轉化方法外，還有利用其他轉化方法的研究報道。Steinhart et al[69]應用PEG介導法轉化萬帶蘭花的原生質體，22 h后檢測到GUS的瞬時表達；Griesbach et al[70]使用電激發(fā)法，以蝦脊蘭為受體材料，導入GUS并獲得轉基因植株。但石斛屬植物利用其他轉化方法的報道較少，冼康華等[71]將攜帶GFP和GUS報告基因的載體通過花粉管通道成功轉化了鐵皮石斛。

3 石斛屬植物再生及遺傳轉化產(chǎn)業(yè)化應用

石斛屬植物多為名貴的觀賞和藥用植物，多數(shù)品種已建立成熟的再生體系。國外多年前已對觀賞類的石斛蘭進行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，日本20世紀60年代就設立了專門的蘭花研究機構，成立高度集約化生產(chǎn)的株式會社，效益顯著[72]；泰國于1967年開始進行石斛蘭切花產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，已成為世界上最大的蘭花出口國[73]。我國海南因其得天獨厚的地理優(yōu)勢成為發(fā)展石斛蘭(主要是觀賞類秋石斛)的主要基地，多通過科研院校聯(lián)合企業(yè)開發(fā)，規(guī)?；a(chǎn)不斷擴大，經(jīng)營多種石斛蘭[74]；云南省是我國藥用類石斛主產(chǎn)區(qū)，其產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的70%以上[75]，建立了鐵皮石斛、紫皮石斛、鼓槌石斛和流蘇石斛等成熟的組織快繁技術，并進行工廠化種苗生產(chǎn)[76]；安徽的霍山石斛通過“胚培養(yǎng)—原球莖—完整植株”的快繁模式實現(xiàn)了種苗的規(guī)?；焖俜敝砙77]；近年來，獨角石斛[78]和串珠石斛[79]等多個種的組培快繁技術體系也達到了規(guī)?；a(chǎn)的水平。然而，石斛組培快繁技術在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)應用上仍然存在培養(yǎng)周期較長，過程繁瑣，人力、物力成本較高等問題，今后應加強縮短種苗培養(yǎng)周期及提高生產(chǎn)效率等方面的研究。

石斛屬植物大部分種類遺傳轉化體系不成熟，仍存在轉化效率低以及轉基因植株難獲得等難題，使得石斛屬很多基因功能的研究只能轉向模式植物，如花器官發(fā)育相關基因功能研究，只能利用擬南芥進行轉

基因功能驗證[80-81]。目前僅有少數(shù)成功的轉基因報道，如利用基因槍法將LEA3導入鐵皮石斛并成功獲得抗性植株的研究[12]。石斛屬植物遺傳轉化體系不成熟的問題嚴重制約了很多基礎理論的研究以及基因工程的應用發(fā)展，今后應持續(xù)加大科研力度。

4 展望

成熟的組織培養(yǎng)再生體系及穩(wěn)定高效的遺傳轉化體系是獲得轉基因植株的關鍵。石斛屬植物多為名貴的觀賞和藥用植物，目前已建立成熟的再生體系，也開發(fā)了SSR等分子標記[82]，但其遺傳轉化體系還存在許多難以解決的問題，如多數(shù)種類遺傳轉化體系不穩(wěn)定，仍然存在轉化效率低以及很難獲得轉基因植株等問題。而諸如研究花發(fā)育、花色、花香、抗逆性等相關的基礎理論以及通過轉基因工程培育優(yōu)良品種等，均會利用遺傳轉化這一關鍵環(huán)節(jié)。因此，針對目前研究現(xiàn)狀，提出如下建議：

(1)完善農(nóng)桿菌介導轉化法。進一步研究農(nóng)桿菌介導轉化法的影響因素，包括受體處理方式、農(nóng)桿菌侵染時間、AS添加量、共培養(yǎng)時間、抗生素的選擇及用量、最佳培養(yǎng)方式等，以確定適合不同品種的最佳轉化條件。(2)將農(nóng)桿菌介導法與基因槍法相結合，提高轉化效率。建立一套新的遺傳轉化途徑，包括農(nóng)桿槍法[83]、基因槍轟擊/農(nóng)桿菌感染法[84]、以金粉或鎢粉包裹菌體作為微彈的轟擊法[85]等。(3)探索其他植物遺傳轉化方法。目前，有關植物遺傳轉化的方法還包括：花粉管通道法、真空滲入法、莖尖轉化法、超聲波輔助的農(nóng)桿菌轉化法、碳化硅纖維介導法、葉綠體轉化法以及藻酸鈣微珠介導法等[86]。同時，可以借鑒一種應用于擬南芥的新型遺傳轉化方法——蘸花法，該法能有效避開植物組培，具有轉化效率高、重復性好、省時省力等優(yōu)點[87-88]。探索新的遺傳轉化方法可以彌補農(nóng)桿菌介導法和基因槍法的缺點，使其更加適用于石斛屬植物的遺傳轉化，提高轉化效率。