卜華虎，王曉清，任志強(qiáng)，肖建紅，張 寧，楊慧珍

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

WRKY 是一類存在于高等植物中的重要調(diào)控因子。1994 年ISHIGURE 等[1]從甘薯中發(fā)現(xiàn)第1 個WRKY 基因家族成員SPF1，并發(fā)現(xiàn)其受蔗糖和PGA 誘導(dǎo)表達(dá)。隨著研究的深入，已經(jīng)在多種植物基因組中克隆和鑒定出WRKY 類基因，其中，擬南芥74 個[2]、水稻109 個[3]、大豆182 個[4]、楊樹104 個[5]、短柄草86 個[6]、黃瓜55 個[7]、玉米136 個[8]。諸多研究表明，WRKY 基因參與植物生長發(fā)育進(jìn)程以及植物對逆境脅迫的響應(yīng)。

植物在長期進(jìn)化過程中形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)，轉(zhuǎn)錄因子家族在該過程中起到重要作用。目前，擬南芥和水稻基因組含有超過2 000 個轉(zhuǎn)錄因子家族。其中，WRKY基因家族在參與植物抗逆響應(yīng)中起到重要作用，參與植物對干旱、鹽害、高溫冷害、缺素、病蟲害等多種環(huán)境脅迫的響應(yīng)[9]。

1 植物WRKY 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族成員均含有60 個氨基酸殘基序列組成的高度保守結(jié)構(gòu)域，稱為WRKY 結(jié)構(gòu)域，其N-端含WRKYGQK 保守序列[10]，與DNA結(jié)合活性相關(guān)[11]；其C-端具有一個典型的鋅指結(jié)構(gòu)，一般由CX4-7CX22-23HXH/C 組成，參與蛋白質(zhì)互作和輔助DNA 結(jié)合的作用。WRKY 蛋白還含有細(xì)胞核定位信號肽（NLS），參與對靶基因的調(diào)控作用；某些WRKY 蛋白還具有亮氨酸拉鏈（leucine zipper）結(jié)構(gòu)域，能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)基因啟動子中W-box 的結(jié)合能力，在調(diào)控靶蛋白轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用[12-13]。

研究表明，WRKY 能夠與啟動子中W-box 轉(zhuǎn)錄元件特異結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。W-box 是WRKY 轉(zhuǎn)錄因子與DNA 結(jié)合所必需的最短序列，W-box 具有高度保守的C/TTGACT/C 氨基酸殘基，其中，TGAC 為核心保守區(qū)[2]，任何一個核苷酸發(fā)生突變，都會影響與WRKY 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的能力[14]，通過磷酸化反應(yīng)也參與WRKY 與W-box 結(jié)合反應(yīng)，磷酸化過程需要Zn2+參與[15-16]。

2 植物WRKY 轉(zhuǎn)錄因子分類

植物WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族普遍具有保守的WRKY 結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域，根據(jù)結(jié)構(gòu)域數(shù)量和結(jié)構(gòu)域差異可分為3 類：第Ⅰ類具有2 個保守WRKY結(jié)構(gòu)域和一個C2H2（CX4-5CX22-23HXH）型鋅指結(jié)構(gòu)，主要由C-端的WRKY 結(jié)構(gòu)域參與DNA 結(jié)合反應(yīng)，而N-段WRKY 結(jié)構(gòu)域的功能和作用還未得到證實；第Ⅱ類只含一個WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)也是C2H2 型，根據(jù)氨基酸序列差異可進(jìn)一步將其分為IIa、IIb、IIc、IId 和IIe 5 個亞類[13]；第Ⅲ類WRKY 轉(zhuǎn)錄因子只含有一個WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC（CX7CX23HXC）型，這類轉(zhuǎn)錄因子僅在高等植物中發(fā)現(xiàn)[10，12-13]。

3 植物WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的功能研究

3.1 參與生物逆境響應(yīng)

植物抗病反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是依靠抗病調(diào)控基因NPR1 以及抗病相關(guān)基因PR 建立起來的。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可以通過與NPR1 和PR 啟動子中的W-box 元件結(jié)合，調(diào)節(jié)或啟動基因的表達(dá)，進(jìn)而激活植物防御反應(yīng)[17-21]。DONG 等[22-23]通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)擬南芥NPRI 的表達(dá)受WRKY 基因調(diào)控。Northern 雜交實驗表明，擬南芥74 個WRKY 轉(zhuǎn)錄因子中有49 個受SA 或病原菌誘導(dǎo)表達(dá)，參與植物抗病反應(yīng)[24]。水稻W(wǎng)RKY45-1 和WRKY45-2 基因?qū)Φ疚敛】剐远计鹫{(diào)控作用[25]。CHENG 等[26]通過過表達(dá)和RNAi 技術(shù)研究表明，WRKY13、WRKY42、WRKY45-2 參與水稻對稻瘟病的抗性響應(yīng)，其中，WRKY42 通過抑制JA 信號相關(guān)基因表達(dá)負(fù)調(diào)控對稻瘟病菌抗性。

JING 等[27]研究揭示了擬南芥WRKY70 能夠連接水楊酸和茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，WRKY70 受到水楊酸激活而受茉莉酸抑制。過表達(dá)和基因敲除試驗結(jié)果表明，WRKY70 基因能夠激活SA 信號通路基因，同時，能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因株系對白粉病菌（Erysiphe cichoracerum）的抗性，而對黑斑病菌（Alternaria brassicicola）的侵染則呈現(xiàn)敏感癥狀；揭示W(wǎng)RKY70基因在水楊酸和茉莉酸介導(dǎo)的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中都起到重要作用。

HAK-SEUNG 等[28]對水稻OsWRKY103 過表達(dá)植株中抗病相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，PR 等下游基因的表達(dá)都被上調(diào)。YODA 等[29]從煙草中克隆和鑒定出WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族TIZZ基因，并揭示了TIZZ 基因參與植物抗病不依賴水楊酸信號傳導(dǎo)；水稻OsWRKY71 在水楊酸、茉莉酸、機(jī)械損傷以及病原菌侵染等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中都起作用，過表達(dá)OsWRKY71 基因能夠增強(qiáng)植株對水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae）的抗性[30]。

有些WRKY 轉(zhuǎn)錄因子則對植物抗病反應(yīng)起負(fù)調(diào)控因子作用。KANG-CHANG 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，AtWRKY7 為轉(zhuǎn)錄抑制因子，AtWRKY7 突變體植株和RNAi 干涉植株都提高了對丁香假單胞細(xì)菌（Pseudomonas syringae）的抗性，同時，PR1 蛋白表達(dá)量上升，而過表達(dá)AtWRKY7 轉(zhuǎn)基因株系則對丁香假單胞細(xì)菌敏感，同時PRl 蛋白表達(dá)下降、水楊酸含量上升。

WRKY 在植物對昆蟲取食及其造成的機(jī)械損傷等脅迫的應(yīng)答過程中也起著一定作用。MELANIE等[32]通過過表達(dá)和基因沉默試驗揭示了WRKY3 和WRKY6 基因參與植物對昆蟲取食傷害的應(yīng)答，煙草WRKY3 的表達(dá)能夠受昆蟲取食造成的機(jī)械損傷誘導(dǎo)，WRKY6 則能受到煙草天蛾（Manduca sexta）幼蟲口內(nèi)分泌的脂肪酸-氨基酸混合物（FACs）誘導(dǎo)表達(dá)。水稻W(wǎng)RKY 轉(zhuǎn)錄因子基因OsWRKY70 通過正向調(diào)控茉莉酸途徑來調(diào)節(jié)植物對昆蟲的抵抗，該基因可被赤霉素二化螟（Chilo suppressalis）取食強(qiáng)烈誘導(dǎo)，正向調(diào)控茉莉酸的合成并增強(qiáng)水稻植株對二化螟的抗性，另外，該基因還能反向調(diào)控赤霉素的合成，抑制水稻對褐飛虱（Nilaparvata lugens Stal）的抗性[33]。

3.2 參與非生物逆境響應(yīng)

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族還參與對非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。植物在傷害、鹽害、干旱、熱激、營養(yǎng)缺失、光照不足、植物激素和冷凍等非生物逆境環(huán)境下，體內(nèi)一些WRKY 基因被誘導(dǎo)表達(dá)。通過基因芯片和Northern 實驗分析擬南芥和水稻在低溫、高溫、干旱和鹽害等非生物逆境脅迫中WRKY 基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明，擬南芥中有40 個，水稻中有13 個表達(dá)明顯上調(diào)，顯示W(wǎng)RKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境脅迫反應(yīng)中起到重要調(diào)控作用[34-35]。

蔡榮號[36]2013 年克隆獲得玉米ZmWRKY58，并通過表達(dá)和RNAi 獲得轉(zhuǎn)基因水稻株系，對該株系的干旱處理及鹽處理試驗結(jié)果揭示，ZmWRKY58基因通過降低相對電導(dǎo)率、丙二醛含量提高了水稻的抗旱抗鹽能力；李小明[37]2015 年研究發(fā)現(xiàn)，玉米ZmWRKY102 基因?qū)Ω珊?、高鹽、ABA 等處理都有不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)該基因擬南芥植株耐干旱性能顯著提高，但對高鹽脅迫敏感性增強(qiáng)，表明ZmWRKY102 參與植物的抗旱耐鹽響應(yīng)。蔡榮號[9]2016 年對玉米WRKYIId 亞家族基因進(jìn)行克隆和功能研究，結(jié)果顯示，ZmWRKY6 等7 個基因受干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo)，ZmWRKY114 則受高鹽脅迫抑制表達(dá)；QIU 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，水稻中OsWRKY8 等10 個基因受高鹽、PEG、低溫及高溫脅迫誘導(dǎo)；QIU等[38]研究也揭示了OsWRKY45 能夠提高擬南芥對鹽害和干旱的抗性，并增強(qiáng)植株的抗病能力；轉(zhuǎn)遏藍(lán)菜基因TcWRKY53 降低了轉(zhuǎn)基因煙草的滲透脅迫耐受性[39]；MARè 等[40]發(fā)現(xiàn)，大麥HvWRKY38 基因參與了植物的冷脅迫及干旱脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

此外，還發(fā)現(xiàn)部分WRKY 基因受熱激、冷害等溫度相關(guān)脅迫誘導(dǎo)[41-44]。AtWRKY46 在脅迫應(yīng)答及光依賴的氣孔運動中發(fā)揮了重要的作用：一方面調(diào)控干旱和鹽脅迫條件下植物細(xì)胞的滲透保護(hù)和降低氧化脅迫；另一方面通過調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞中淀粉的代謝來調(diào)節(jié)氣孔的打開[45]。擬南芥中過量表達(dá)玉米ZmWRKY33 基因也可以在一定程度上提高轉(zhuǎn)基因植株抵抗鹽脅迫的能力[46]。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子參與氧化脅迫和ROS 途徑活性分子的代謝途徑。在臭氧處理條件下，發(fā)現(xiàn)擬南芥中AtWRKY30、AtWRKY75 等6 個WRKY 家族基因的表達(dá)量均上調(diào)5 倍[47]。用甲基紫精（methyl viologen）誘導(dǎo)抗氧化煙草的過程中發(fā)現(xiàn)，NtWRKY11在處理后期表達(dá)顯著上升，這表明NtWRKY11 是有可能參與植物氧化過程調(diào)節(jié)的候選基因[48]。YAN等[49]發(fā)現(xiàn)，棉花WRKY17 的表達(dá)不僅受非生物脅迫因子和機(jī)械損傷的誘導(dǎo)，還受ABA 和H2O2等誘導(dǎo)調(diào)節(jié)。過表達(dá)GhWRKY17 株系葉片中大量積累ROS，降低對干旱和鹽害的抗性；活性氧代謝相關(guān)酶的活性和脯氨酸含量降低，表明GhWRKY17 通過影響ABA 信號通路提高體內(nèi)ROS 水平，參與植物干旱和高鹽脅迫反應(yīng)。

WRKY 基因還參與機(jī)械損傷誘導(dǎo)表達(dá)，如煙草WIZZ 基因在受損傷時，10 min 后損傷誘導(dǎo)信號能在煙草葉片中快速傳遞，30 min 后達(dá)到最高峰，隨后逐漸降至正常水平，表明WIZZ 基因響應(yīng)煙草早期階段的傷害[50]。擬南芥WRKY11、WRKY15、WRKY22、WRKY33、WRKY40、WRKY53、WRKY60和WRKY6 也受到傷害誘導(dǎo)[51-52]。

3.3 參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子參與ABA、SA 以及JA 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]，AtWRKY70 蛋白是SA 與JA 介導(dǎo)抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中調(diào)控交叉點[27，53-56]。擬南芥WRKY18，WRKY40 和WRKY60 通過調(diào)控ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中ABI4 和ABI5 基因轉(zhuǎn)錄來調(diào)控下游基因表達(dá)[57]。LtWRKY21 能夠與HVA22 的啟動子結(jié)合，并與VP1 和ABI5 相互作用激活該基因的轉(zhuǎn)錄，參與ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[58]。FAN 等[59]研究菊花CmWRKY1 基因的功能時發(fā)現(xiàn)，其能抑制PP2C、ABI1 和ABI2 基因的表達(dá)，能激活PYL2、SnRK2.2等基因的表達(dá)，參與植物的ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，過表達(dá)CmWRKY1 能夠提高植株的抗旱性。

對水稻進(jìn)行SA 和JA 處理，觀察水稻中15 個被稻瘟病所誘導(dǎo)的WRKY 基因的表達(dá)情況，其中，4 個WRKY 基因被SA 所誘導(dǎo)，5 個WRKY 基因受JA 誘導(dǎo)[28]。擬南芥WRKY70 基因能夠被水楊酸誘導(dǎo)表達(dá)，而茉莉酸則能明顯抑制WRKY70 基因的表達(dá)，過量表達(dá)WRKY70 基因能夠激活SA 誘導(dǎo)基因[27]。過表達(dá)AtWRKY39 能夠增加SA 途徑相關(guān)基因PR1 和MNF1c 的表達(dá)，同時，AtWRKY39 的表達(dá)能夠被SA 和茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)，參與SA 和JA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)植物耐高溫反應(yīng)[60]。AtWRKY38和AtWRKY62 能被NPR1 基因以及丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）誘導(dǎo)表達(dá)，過表達(dá)AtWRKY38和AtWRKY62 則能抑制防御基因AtPR1 的表達(dá)，揭示了AtWRKY38 和AtWRKY62 是NPR1 的下游基因，通過SA 途徑參與植物的抗病性[61]。JIANG等[62]研究顯示，AtWRKY57 在茉莉酸和生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中也起到一定的作用。

3.4 參與植物的生長發(fā)育

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子還參與種子休眠[63-64]、植物生長發(fā)育[65]以及衰老進(jìn)程[52，66]。藥用植物石斛（Retama raetam）的WRKY 基因除了參與植物抗旱途徑外，還與種子休眠的過程相關(guān)[67]。擬南芥AtWRKY75 基因則能受缺磷脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，參與擬南芥缺磷響應(yīng)[68]。

4 展望

近年來，隨著人口增長和國民經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，農(nóng)產(chǎn)品的供需矛盾日益突出。農(nóng)作物的產(chǎn)量受到多種不利氣候條件及病蟲害的影響，因此，育種工作者的育種目標(biāo)逐漸由單一抗性轉(zhuǎn)向多抗性品種培育。轉(zhuǎn)錄因子作為植物體內(nèi)重要的調(diào)控因子，在植物的整個生長發(fā)育過程中都起著重要作用。目前，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在參與植物抗逆響應(yīng)中的功能研究越來越受重視，WRKY 家族不僅成員眾多，參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也十分復(fù)雜，目前人們對某些該家族基因的上游調(diào)控基因以及下游影響基因已經(jīng)有了一定的了解，但許多調(diào)控節(jié)點及調(diào)控方式仍舊是空白。隨著研究的進(jìn)一步深入，人們將會掌握不同植物中該基因家族的更多信息，更好地為使用基因工程手段改良作物抗逆性提供基因資源和改良思路。