孫 超，王翠香，梁 燕，李春明，張兆云，矯興杰，韓傳明*

（1.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東濟(jì)南250014；2.國家林業(yè)和草原局華東核桃工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南250014；3.海陽市森林資源監(jiān)測保護(hù)服務(wù)中心，山東海陽265100；4.煙臺(tái)市牟平山省級自然保護(hù)區(qū)管理中心，山東煙臺(tái)264100）

轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控是維持細(xì)胞基因調(diào)控完整性的基本步驟，它們在植物生長發(fā)育、抵御生物脅迫和非生物脅迫中起著至關(guān)重要的作用[1，2，3]。1994年，第一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子成員SPF1（Sweet-Potato-Factor-1）從甘薯（Ipomoea batatas）中克隆出來[4]。此后，大量的WRKY 家族成員在幾十種植物中被相繼發(fā)現(xiàn)，其中，擬南芥中含有72 個(gè)成員[5]，水稻中有102 個(gè)成員[6，7]，大豆中有197 個(gè)[8]，棉花中有116 個(gè)[9]，油菜中有46 個(gè)[10]，黃瓜中有55 個(gè)[11]，蘋果中有116個(gè)[12]，石榴中有69 個(gè)[13]，番茄中有81 個(gè)[14]，楊樹中有104 個(gè)[15]，巨桉中有79 個(gè)[16]，橡膠樹中有81 個(gè)[17]，苜蓿中有29 個(gè)[18]。

本文將對WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和分類、在植物生長發(fā)育、對生物脅迫和非生物脅迫響應(yīng)防御等過程中發(fā)揮的調(diào)控功能進(jìn)行闡述，為全面研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的調(diào)控和深入剖析每個(gè)成員的作用機(jī)理提供思路。

1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與分類

WRKY轉(zhuǎn)錄因子最顯著的特征是含有高度保守的60 個(gè)氨基酸構(gòu)成的WRKY 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的N 末端有保守的WRKYGQK 七肽序列，C 末端有Cys(2)-His(2)型或Cys(2)-HisCys 型鋅指結(jié)構(gòu)。七肽序列的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)的類型決定了WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合靶基因啟動(dòng)子順式元件W-box（TTGACC/T）的親和能力，也是WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族分類的依據(jù)[19，20]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為3 類。第Ⅰ類含有兩個(gè)WRKYGQK 序列，第Ⅱ類和第Ⅲ類含有一個(gè)WRKYGQK 序列。第Ⅰ類和第Ⅱ類具有相同的鋅指結(jié)構(gòu)，為C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H，第Ⅲ類的鋅指結(jié)構(gòu)C-X7-C-X23-H-X1-C。依據(jù)氨基酸序列的差異，第Ⅱ類又可以進(jìn)一步細(xì)分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd 和Ⅱe5 個(gè)亞類。擬南芥的72 個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子中，第Ⅰ類有32 個(gè)，第Ⅱ類有26 個(gè)，第Ⅲ類有14 個(gè)。石榴WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的69 個(gè)成員中，第Ⅰ類有14 個(gè)成員，第Ⅱ類有45 個(gè)成員，第Ⅲ類有10個(gè)成員。

2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育中的作用

GA 是一類重要的激素，參與了植物種子萌發(fā)、營養(yǎng)生長、開花等過程。對水稻基因組序列分析得到的77 個(gè)WRKY 基因進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，OsWRKY71在糊粉層細(xì)胞中高表達(dá)并且GFP：OsWRKY71 被定位于糊粉層細(xì)胞核。GA 信號可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子OsGAMYB 的表達(dá)，同時(shí)，OsGAMYB 可激活α-淀粉酶基因Amy32b 的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OsWRKY71 通過與Amy32b 啟動(dòng)子上W-box 的結(jié)合，阻斷了OsGAMYB 對Amy32b 的激活。在水稻糊粉層細(xì)胞中，OsWRKY71 是GA 信號的轉(zhuǎn)錄抑制因子[21]。WRKY 蛋白WRKY18、WRKY40 和WRKY60通過與ABA 受體結(jié)合，作為ABA 信號負(fù)調(diào)控因子在擬南芥種子萌發(fā)和生長過程中起作用[22]。

褪綠是葉片衰老過程中可見的部分。葉綠素和光合反應(yīng)器的分解使葉片呈現(xiàn)淺綠色或淡黃色。當(dāng)葉片出現(xiàn)這些跡象時(shí)，衰老程序早已在分子水平上啟動(dòng)了。在多種植物中的研究證明了WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了植物的衰老過程，其中WRKY53 與H2O2、ROS（reactive oxygen species）、細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平、ABA、JA 等相關(guān)聯(lián)，被證明是植物衰老調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心之一[23]。轉(zhuǎn)棉花GhWRKY22 基因的擬南芥植株表現(xiàn)出雄性不育，花粉粒數(shù)量較野生型減少。與野生型相比，過量表達(dá)GhWRKY22 的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中JA 生物合成相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，而JA抑制因子JAZ1 和JAZ8 的表達(dá)下調(diào)。酵母單雜交和芯片qPCR 分析表明GhWRKY22 通過直接結(jié)合JAZ 基因的啟動(dòng)子來調(diào)控花藥/花粉發(fā)育[24]。

3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生物脅迫中的作用

植物的生物脅迫主要包括病原體、病原相關(guān)分子模式（PAMPs，Pathogen -associated molecular patterns）、激發(fā)子等。通常情況下，脅迫信號的感知是通過膜結(jié)合或可溶性受體或激活植物激素依賴過程來。在擬南芥中，由PROPEP 基因編碼的受體激酶PEPR1 和PEPR2，可感知植物損傷相關(guān)的分子模式，以增強(qiáng)防御反應(yīng)。WRKY33 以依賴激活的方式與2 個(gè)受體激酶基因的啟動(dòng)子結(jié)合并調(diào)節(jié)它們的表達(dá)[25]。煙草花葉病毒（TMV）和SA 都能誘導(dǎo)煙草tWRKY3 和tWRKY4 的表達(dá)；大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌（Pseudomonas syringae pv.glycinea）、SA、MeJA 等都能誘導(dǎo)編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因NtEIG-D48 的表達(dá)。這說明WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控不同防御基因的表達(dá)，參與了煙草多個(gè)防御途徑[26]。在擬南芥葉片細(xì)胞的PAMP 防御中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌或真菌病原體都可以啟動(dòng)AtWRKY22 和AtWRKY29 結(jié)合FLS2 起作用的防御途徑[27]。玫瑰56 個(gè)編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因中，有19 個(gè)基因受灰霉菌（Botrytis cinerea）誘導(dǎo)表達(dá)。通過VIGS（virus-induced gene silencing）的方法將花瓣中RcWRKY41 基因沉默，接種灰霉菌后發(fā)現(xiàn)：與對照相比，RcWRKY41 基因沉默花瓣的病斑明顯增大，表現(xiàn)出更嚴(yán)重的病癥[28]。通過對斜紋夜蛾（Spodoptera littoralis）進(jìn)食前后的擬南芥轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，食草行為導(dǎo)致擬南芥WRKY18 和WRKY40 在內(nèi)的42 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)表達(dá)，這也暗示著WRKY18 和WRKY40 在抵御斜紋夜蛾進(jìn)食行為對植物造成的傷害中起著重要的作用[29]。

4 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫中的作用

植物的非生物脅迫主要包括高溫、低溫、干旱、鹽害、機(jī)械損傷、缺素、滲透等。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與植物的非生物脅迫響應(yīng)，并發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。一個(gè)WRKY 蛋白通常參與多個(gè)脅迫響應(yīng)的調(diào)控，有些甚至能同時(shí)在生物脅迫和非生物脅迫中起作用。近年來，人們基于WRKY 基因的過量表達(dá)和敲除、基因組和轉(zhuǎn)錄組分析、基因芯片分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 等方法和技術(shù)，分析和鑒定了多種植物中WRKY轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫下的功能。

4.1 高溫和低溫脅迫

高溫和低溫脅迫是主要的非生物脅迫。植物在遭遇高溫或低溫脅迫時(shí)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)，幫助植物抵抗溫度的為害。TaWRKY1 和TaWRKY33 基因的啟動(dòng)子中含有多個(gè)非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件。TaWRKY1 在高溫或ABA 誘導(dǎo)下微弱上調(diào)，在低溫誘導(dǎo)時(shí)下調(diào)；TaWRKY33 在高溫、低溫、ABA 或MeJA 的誘導(dǎo)下都高表達(dá)。TaWRKY1 和TaWRKY33 基因的過量表達(dá)都能激活下游脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因擬南芥在多種脅迫下的發(fā)芽率和根生長量均高于對照。脫水處理時(shí)，轉(zhuǎn)TaWRKY33 基因擬南芥株系比轉(zhuǎn)TaWRKY1 基因擬南芥株系和對照表現(xiàn)出較低的脫水率。更重要的是，轉(zhuǎn)TaWRKY33 基因擬南芥株系耐高溫脅迫的能力增強(qiáng)[30]。在高溫脅迫下，擬南芥WRKY25 和WRKY26 基因的表達(dá)誘導(dǎo)上調(diào)，而WRKY33 基因的表達(dá)被抑制。與野生型擬南芥相比，3 個(gè)單突變體wrky25、wrky26 和wrky33 對熱激響應(yīng)微弱，而雙突變體wrky25wrky26、wrky25wrky33和三突變體wrky25wrky26wrky33 對熱脅迫的敏感性顯著增加，同時(shí)表現(xiàn)出種子發(fā)芽率降低、存活率下降和電解質(zhì)外滲升高。WRKY25、WRKY26 和WRKY33 基因的過量表達(dá)都能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株抵御熱激脅迫的抗性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，通過正向調(diào)節(jié)ETH 激活和熱激蛋白相關(guān)的信號途徑，WRKY25、WRKY26 和WRKY33 相互協(xié)同地調(diào)控著擬南芥對熱激脅迫的響應(yīng)[31]。

植物激素JA 參與了植物多個(gè)逆境脅迫的響應(yīng)，能降低低溫脅迫對果實(shí)的傷害。香蕉MaWRKY26 基因被低溫脅迫和MeJA 誘導(dǎo)表達(dá)，并能增強(qiáng)香蕉果實(shí)的抗寒性。通過與基因啟動(dòng)子的結(jié)合，MaWRKY26 還能反向激活JA 合成基因MaLOX2、MaAOS3 和MaOPR3 的表達(dá)，促進(jìn)JA 的合成從而減輕低溫對香蕉果實(shí)造成的傷害[32]。茄子SmWRKY26 和SmWRKY32 基因在冷害脅迫下表達(dá)上調(diào)。通過VIGS 的方法，將這兩個(gè)基因沉默后，在冷害脅迫下，基因沉默的株系出現(xiàn)嚴(yán)重萎蔫，而對照僅呈現(xiàn)輕微的黃化，同時(shí)，基因沉默株系的葉片冷害指數(shù)（leaf chilling injury index，LCI）顯著高于對照[33]。

4.2 干旱脅迫

干旱是抑制植物生長和限制作物產(chǎn)量最嚴(yán)重的環(huán)境因素之一。擬南芥WRKY57 基因啟動(dòng)子TDNA 插入的突變體adt 抗旱能力增強(qiáng)。與野生型擬南芥相比，adt 突變體和WRKY57 基因過量表達(dá)擬南芥植株內(nèi)ABA 含量增加，同時(shí)，脅迫相關(guān)基因RD29A，ABA3 和NCED3 表達(dá)上調(diào)。WRKY57 通過調(diào)節(jié)ABA 的水平和正向調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥的耐旱性[34]。T-DNA 插入突變體abo3（Atwrky63）突變體擬南芥降低了對ABA 的敏感性和耐旱性，進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)AtWRKY63 位于ABA 信號傳導(dǎo)途徑中ABI1、ABI2 和ABI5 的下游，ABF2、RD29A 和COR4 的上游，這說明AtWRKY63可通過調(diào)節(jié)ABA 的水平參與調(diào)控?cái)M南芥的耐旱性[35]。水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY30 能與OsMPK3、OsMPK4、OsMPK7、OsMPK14、OsMPK20-4 和OsMPK 20-5 相互結(jié)合，并且能被OsMPK3、OsMPK7 和OsMPK14 磷酸化。OsWRKY30 基因的過量表現(xiàn)可顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻的耐旱性。進(jìn)一步的研究證明OsWRKY30 在 MAPKs 作用下的磷酸化是OsWRKY30 發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵[36]。

杜梨PbrWRKY53 基因被干旱和ABA 誘導(dǎo)大幅上調(diào)，但只受到鹽害和冷害輕微誘導(dǎo)。PbrWRKY53 基因過量表達(dá)的煙草和杜梨植株都增強(qiáng)了對干旱脅迫的耐受性。與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更高的含水率、更少的活性氧含量、更高水平的抗氧化酶活性和代謝產(chǎn)物。此外，與野生型煙草相比，PbrWRKY53 基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的過量表達(dá)使植株維生素C 含量增加。PbrWRKY53 基因被敲除的杜梨植株中，PbrNCED1 表達(dá)量下降，同時(shí)，植株對干旱脅迫的耐受性降低。酵母單雜交試驗(yàn)、EMSA 和瞬時(shí)表達(dá)分析表明，PbrWRKY53 能與PbrNCED1 啟動(dòng)子區(qū)的W-box 結(jié)合。PbrWRKY53轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)PbrNCED1 的表達(dá)調(diào)控植株的耐旱性和維生素C 的合成[37]。玉米ZmWRKY40 基因的表達(dá)能被干旱、鹽害、高溫和ABA 所誘導(dǎo)，并且在干旱處理1 h 后即達(dá)峰值，為處理前表達(dá)量的12倍。對ZmWRKY40 基因過量表達(dá)的擬南芥分析發(fā)現(xiàn)，ZmWRKY40 通過調(diào)控脅迫相關(guān)基因STZ、DREB2B 和RD29A 表達(dá)，提高了POD（過氧化物歧化酶）和CAT（過氧化氫酶）的活性，降低了ROS（活性氧）的含量，從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因株系的抗旱性[38]。硬皮豆MuWRKY3 基因在干旱脅迫下極高表達(dá)。將MuWRKY3 基因轉(zhuǎn)入花生中進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫處理后萎蔫癥狀較輕，并且癥狀出現(xiàn)得更晚。在干旱脅迫下，與脅迫相關(guān)的LEA、HSP、MIPS、APX、SOD 和CAT 基因在轉(zhuǎn)基因花生中表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)基因花生植株體內(nèi)丙二醛、過氧化氫和超氧陰離子積累較少，游離脯氨酸、可溶性總糖含量和抗氧化酶活性較高[39]。

4.3 鹽害脅迫

鹽害脅迫不同程度地抑制了植物的營養(yǎng)生長和生殖生長，對植物造成原初鹽害和次生鹽害，破壞植物正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重時(shí)植物甚至干枯死亡。擬南芥WRKY25 和WRKY33 基因的表達(dá)受NaCl 誘導(dǎo)上調(diào)，并且WRKY25 和WRKY33 基因的過量表達(dá)，能都增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對NaCl 的抗性[40]。葡萄VvWRKY30 基因的表達(dá)受鹽脅迫的誘導(dǎo)。將VvWRKY30 基因過量表達(dá)，鹽脅迫下的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中與抗氧化生物合成、糖代謝和脯氨酸生物合成相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)具有較低的活性氧含量、較高的抗氧化活性、可溶性糖和脯氨酸濃度[41]。番茄SlWRKY8 基因的表達(dá)受番茄細(xì)菌性葉斑病病原（Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000，Pst.DC3000）、干旱、鹽害、冷害、ABA、SA 的誘導(dǎo)上調(diào)。在鹽害脅迫下，SlWRKY8 基因過量表達(dá)的植株相較于對照植株僅表現(xiàn)輕微的萎蔫，同時(shí)，脯氨酸等滲透物質(zhì)含量更高，脅迫應(yīng)答基因SlAREB、SlDREB2A 和SlRD29 的表達(dá)上調(diào)[42]。酵母單雜交和瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染試驗(yàn)表明，苦蕎FtWRKY46 基因能與W-box 結(jié)合并激活報(bào)告基因的表達(dá)。在鹽害脅迫下，轉(zhuǎn)FtWRKY46 基因擬南芥的種子發(fā)芽率、根長、葉綠素含量、脯氨酸含量顯著高于對照，但MDA 含量顯著低于對照[43]。

4.4 其它非生物脅迫

利用擬南芥單突變體wrky54、wrky70，雙突變體wrky54wrky70 和WRKY70 過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行滲透脅迫（聚乙二醇）研究發(fā)現(xiàn)，wrky54wrky70 雙突變體對滲透脅迫的耐受性明顯增強(qiáng)，同時(shí)，起滲透保護(hù)作用的脯氨酸積累減少，滲透脅迫反應(yīng)基因的表達(dá)下調(diào)。滲透脅迫處理后，wrky54wrky70 雙突變體的失水率和氣孔導(dǎo)度比野生型要低。表明WRKY70 和WRKY54 共同作為氣孔關(guān)閉的負(fù)調(diào)節(jié)因子，影響了擬南芥的滲透脅迫耐受性[44]。在不同濃度低磷脅迫處理下，馬尾松PmWRKY11、PmWRKY12 和PmWRKY13 基因表達(dá)都上調(diào)[45]。過量表達(dá)OsWRKY74 基因顯著增強(qiáng)了水稻對磷饑餓（Pi starvation）的耐受性，而OsWRKY74基因下調(diào)的轉(zhuǎn)基因植株對磷饑餓敏感。在磷饑餓條件下，與野生型相比，過量表達(dá)OsWRKY74 基因的水稻植株根生物量、莖生物量、磷濃度、分蘗數(shù)、粒重不同程度地增加了，同時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的磷饑餓耐受性[46]。WRKY25 基因過量表達(dá)延長了轉(zhuǎn)基因擬南芥的生命周期，而敲除WRKY25 基因則加快了植株的衰老。與野生型擬南芥相比，WRKY25 基因過量表達(dá)植株表現(xiàn)出更低的H2O2含量和更強(qiáng)的氧化脅迫耐受性，wrky25 突變體的表現(xiàn)與WRKY25 基因過量表達(dá)植株恰恰相反[47]。

5 展望

WRKYs 是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與了植物生物脅迫和非生物脅迫響應(yīng)和植物生長發(fā)育的調(diào)控并發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。近年來，對WRKY 在上述方面的研究取得了一定的進(jìn)展，但是由于WRKY 家族成員眾多和參與調(diào)控的各種途徑相互交織，對WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族各成員功能的冗余和差異，自我反饋調(diào)節(jié)機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑間的調(diào)控機(jī)理尚不清楚，仍需在深入持久研究的基礎(chǔ)上加以證實(shí)和完善。