從光雷，劉 青，孫 偉，曾申明

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009）

精液保存是人工授精最重要的技術環(huán)節(jié)之一，保存方式有液態(tài)（0℃以上）和冷凍（0℃以下）2 種。液態(tài)保存有常溫和低溫保存，其原理是通過緩慢降低溫度（0℃以上）使精子的運動和代謝速率降慢來延長精子體外存活時間，同時不喪失受精能力。目前，在綿羊精液冷凍保存尚難在生產中推廣的情況下，精液的液態(tài)保存有很大的實用價值，且使用時需用設備簡單、操作方便。冷凍保存在綿羊生產中尚未推廣開，主要是因為精子在冷凍過程中會遭受到物理性、化學性和氧化性損傷，導致其活力和受精能力下降。精液無論是液態(tài)還是冷凍保存，在處理和保存過程中都會產生活性氧化物，它們能破壞精子膜結構，對精子質量造成有害影響。目前主要是在稀釋液中添加抗氧化劑來降低氧化應激對精子造成的損傷，但各研究結果不盡一致，需要進一步深入研究和分析。此外，單獨添加某種抗氧化劑的研究較多，聯(lián)合添加較少，因此需對各種類型抗氧化劑深入了解，才能改進現(xiàn)有的稀釋液或開發(fā)出新型稀釋液。本文根據國內外最新進展，全面綜述抗氧化劑在綿羊精液保存中的研究和應用現(xiàn)狀，為新型稀釋液的研究提供參考。

1 精液在處理和保存過程中產生的氧化物種類及危害

活性氧（ROS）包括超氧陰離子（O2-）、超自由基（-OH）和過氧化氫（H2O2）等。適量ROS 對維持精子正常的生理功能是必要的，如生理功能的調節(jié)、結合透明帶能力的提升等[1]。此外，ROS 在精子獲能過程中發(fā)揮重要作用，當精液中過氧化氫含量下降到一定水平后，精子將不能發(fā)生獲能。但ROS 過量就會造成精子DNA 碎裂、質膜損傷、線粒體功能異常和調亡等，最終縮短精子在體外存活時間[2]。對于綿羊而言，ROS主要由精子的芳香族氨基酸氧化酶（AAAO）催化產生，這種酶主要來自死精子。如果精液中死精子越多，這種酶活性越強，從而造成惡性循環(huán)，導致某些仍有活力的精子因為ROS 濃度升高而受到損害[3]。

活性氧化物還有一類含氮化合物，統(tǒng)稱為活性氮（RNS）。它們是O2-與其他的自由基反應生成，包括一氧化氮（NO-）、二氧化氮（NO2-）和過氧化亞硝酸鹽（ONOO-）等。正常男性精液中NO-濃度顯著低于弱精子癥患者，NO-濃度與精子活力呈顯著線性負相關，NO-濃度與精子活力運動參數(shù)（曲線及直線運動等）亦呈顯著線性負相關[4]。以上研究表明，自由基產生過多或暴露在氧化環(huán)境下會降低精子直線前進運動率。但適宜的NO-濃度能促進精子獲能，所以NO-對精子的生理作用可能依賴于其氧化還原狀態(tài)及濃度。

2 精液保存中消除氧化物危害的策略

綿羊精液和精子本身具有抗氧化機制，包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶，以及非酶抗氧化劑，如蛋氨酸、抗壞血酸和生育酚。但精子合成上述物質的能力有限，同時在精液處理和保存過程也會產生ROS 和RNS。為了降低氧化物對精液品質的影響，通常會在稀釋液中添加外源抗氧化劑來改善精子質量。

精液無論是液態(tài)還是冷凍保存，在處理和保存過程中都會產生活性氧化物，它們能破壞精子膜結構，對精子質量造成有害影響。目前，生產應用中液態(tài)保存下添加不同類型的抗氧化劑是主要策略。因為冷凍保存精液的過程會造成精子冰晶化產生活性氧化物，對精子傷害大于液態(tài)保存。因而，近年來在冷凍保存中添加抗氧化劑的研究較多。

3 綿羊精液保存中的抗氧化劑種類和應用進展

3.1 酶 新鮮精液中超氧化物歧化酶含量最高，是主要活性酶。調控精子中過氧化物濃度的酶系統(tǒng)由谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽合成和還原所需的幾種輔酶組成。谷胱甘肽過氧化物酶作用于谷胱甘肽將過氧化氫還原為水，脂肪酶還原為烷基醇。而谷胱甘肽還原酶在氧化應激下又能誘導谷胱甘肽從氧化態(tài)轉化為還原態(tài)。Kasimanickam 等[5]報道，質量較差的精液中谷胱甘肽過氧化物酶活性較高，而超氧化物歧化酶活性與精液質量無關。Marti 等[6]報道，綿羊精液在15℃保存6 h后，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性保持不變；精液冷凍保存時，谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性保持穩(wěn)定，但超氧化物歧化酶活性約下降一半。然而，精液冷凍保存中添加超氧化物歧化酶的研究結果存在爭議。Mohsen 等[7]發(fā)現(xiàn)在精液冷凍保存中添加150 μmol/L 超氧化物歧化酶能保護精子質量；Silva 等[8]在精液冷凍保存中添加超氧化物歧化酶（25、50、100 U/mL）并未發(fā)現(xiàn)精子運動參數(shù)有明顯增強，但添加100 U/mL 能保持精子頂體的完整性，并增強對線粒體的保護。

過氧化氫酶是酶類抗氧化劑，又稱觸酶，能使過氧化氫分解為氧和水，阻斷氧化反應，從而保護精子免受過氧化氫的損傷。液體保存中添加100、200 U/mL 過氧化氫酶均能降低凍融對精子運動性能的影響，但過氧化氫酶濃度大于200 U/mL 會對精子產生毒性[9]。

谷胱甘肽具有抗氧化作用，對精子起到保護作用。綿羊精液在液體保存時，添加谷胱甘肽對精子的總運動性能未見影響。在冷凍保存中添加5 mmol/L 谷胱甘肽會導致精液中谷胱甘肽過氧化物酶活性增加，但對脂質過氧化和精子運動性能未見影響[10]。Silva 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊精液冷凍保存中添加2.5 mmol/L 谷胱甘肽對精子的運動性能未見影響，然而添加7 mmol/L 谷胱甘肽會導致精子直線前進運動降低。因此，精液稀釋液中是否需要添加谷胱甘肽還需進一步研究。

3.2 維生素 在正常精液和精子中，維生素E 是主要的親脂性抗氧化劑，在質膜中含量豐富，能保護精子中多不飽和脂肪酸免受過氧化。有報道在綿羊精液液態(tài)保存稀釋液中添加1 mg/mL 維生素E 能提高精子直線前進運動率[11]。Kheradmand 等[12]報道，在綿羊精液冷凍保存中添加1 mg 或2 mg 維生素E 能提高精子運動性能和膜完整性。

奎諾二甲基丙烯酸酯是一種類似維生素E 的水溶性抗氧化劑，具有清除脂質過氧自由基的功能。精液液態(tài)保存時添加奎諾二甲基丙烯酸酯對綿羊精液的脂質過氧化有保護作用[13]，而Mata 等[14]研究指出，添加奎諾二甲基丙烯酸酯對精子質量有害。冷凍保存液中添加60、120 μmol/L 奎諾二甲基丙烯酸酯對精子質膜完整性和運動性能有益[15]，而Maia 等[16]報道，冷凍保存中添加奎諾二甲基丙烯酸酯（50 mol/108精子）對精子質膜完整性和活力未有增加。綜上說明，奎諾二甲基丙烯酸酯添加效果可能與稀釋液相關組成成分有關。

抗壞血酸是一種水溶性維生素，對人體至關重要，抗壞血酸與生育有關，但其在生殖生理學中確切作用尚不確定。Choucair 等[17]推測抗壞血酸可能是通過阻止氧化損傷來保護精子DNA 完整性。Azawi[11]在5℃保存Awassi 羊精液中添加0.9 mg/mL 抗壞血酸能提高精子運動性能。Sánchez-Partida 等[18]報道，在綿羊冷凍保存中添加50、100 mmol/L 抗壞血酸時，凍融精子比對照組的直線前進運動率降低。Rietjens 等[19]、Amidi 等[20]報道，抗壞血酸在過渡金屬離子存在時可促氧化活性，當亞鐵離子存在時，抗壞血酸將Fe3+轉化為Fe2+，F(xiàn)e2+與氧或過氧化氫反應生成羥基自由基，引發(fā)脂質過氧化。而稀釋液中含有多種無機鹽時，F(xiàn)e3+會從乳鐵蛋白中釋放出來[21]。因此導致精子活力降低。

維生素B12是一種水溶性維生素，在許多生化反應中起輔酶作用。Asadpour 等[22]報道，在液態(tài)和冷凍保存液中添加維生素B12（2 mg/mL）能提高雜交羊和Dallagh 羊精子運動性能。哈福等[23]研究指出，冷凍保存液中添加維生素B 復合物（3% v/v）能提高精子運動性能膜完整性。

3.3 氨基酸 正常精液或精子中的氨基酸具有抗氧化功能，通常精液中存在高濃度的氨基酸。精液保存液中主要添加的氨基酸有谷氨酰胺、半胱氨酸、蛋氨酸、麥角硫氨酸、?；撬岷透彼岬取０腚装彼岷凸入赘孰哪芫S持精子質量、保護精子質膜和頂體完整性；麥角硫因是單線態(tài)氧羥基自由基和過氧自由基的清除劑，有利保護精液DNA 完整和提高精子總運動力；蛋氨酸具有保護細胞免受氧化損傷的作用，是谷胱甘肽的前體氨基酸，在解毒過程中發(fā)揮重要作用。牛磺酸是主要的非酶清除劑之一，能夠防止精子脂質過氧化和精子活力的降低；牛血清白蛋白能保護精子質膜完整性，也是酶的穩(wěn)定劑，防止酶的分解和非特異性吸附，減輕有些有害環(huán)境因素的影響。

半胱氨酸是一種含巰基的氨基酸，參與谷胱甘肽的合成。精液冷凍保存液中添加10 mmol/L 半胱氨酸比其他濃度（0、5、20 mmol/L）更能保護精液質量[24]，添加半胱氨酸（1、5、10 mmol/L）還能提高精子運動性能和質膜完整性[25-26]。

精液的液態(tài)保存液中添加蛋氨酸（1、2、4 mmol/L）能提高精子總運動力、直線前進運動率和線粒體活性[27]。Bucak 等[28]研究指出，精液冷凍保存液中添加5 mmol/L谷氨酰胺能提高精子運動能力和質膜完整性。Mehr 等[29]也驗證了這一結果，稀釋液中添加L-谷氨酰胺（40、80 mmol/L）能提高精子總運動力、直線前進運動及頂體和質膜完整性。

麥角硫因是一種重要的低分子量硫醇，它是單線態(tài)氧羥基自由基和過氧自由基的清除劑，有利保護精液DNA 完整。Coyan 等[27]報道，與對照組相比，冷凍保存中添加麥角硫蛋白（2、4 mmol/L）提高了精子總運動力和直線前進運動率。Abozar 等[30]報道，冷凍保存液中添加6 mmol/L 麥角硫因能提高精子總運動力、直線前進運動率和質膜完整性，并降低脂質過氧化。

?；撬崾且环N磺酸氨基酸，存在于附睪和輸卵管液中，是主要的非酶清除劑之一。Saleh 等[31]報道，液態(tài)保存液中添加?；撬崮鼙Ｗo精子免受活性氧和脂質過氧化影響。冷凍保存液中添加牛磺酸能提高精子運動性能和膜完整性[18,32]。Sangeeta 等[33]報道，冷凍保存精液時添加L-谷氨酰胺和L-脯氨酸的卵黃稀釋液，能夠提高精子的總運動力，使羊附睪精子的質膜和頂體完整性優(yōu)于對照組。

牛血清白蛋白能保護精子質膜完整性，也是酶的穩(wěn)定劑，可防止酶的分解和非特異性吸附，減輕一些不利環(huán)境因素的影響。此外，稀釋液中添加10%、15% 牛血清白蛋白能替代卵黃，并能在凍融過程中提高精子的直線前進運動率[34-35]。

3.4 植物提取物 植物（香合子、厚樸、山茶花等）的提取物可用來提高精液質量，例如丁香富含酚酸、黃酮醇甙、酚類揮發(fā)油（丁香酚、乙酰丁香酚、異丁香酚）和單寧，這些物質具有清除自由基和螯合重金屬的功能。Baghshahi 等[36]報道，與冷凍保存液中添加0、115 μg/mL丁香花蕾相比，添加35、75 μg/mL 丁香花蕾提高了精子運動性能。同樣，冷凍保存液中添加4%、6% 迷迭香水提取物能提高精子總運動力、直線前進運動率和質膜完整性[37]。

除了丁香和迷迭香之外，綠茶含有多種生物活性的化合物，如多酚、兒茶素、表兒茶素、沒食子酸酯和沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯，這些都具有清除自由基的功能。冷凍保存液中添加綠茶提取物能保護精子免受氧化應激的損傷[38]。

大豆卵磷脂是通過穩(wěn)定和替代磷脂來保護精子膜，從而增加對冷凍過程的耐受性。精液冷凍保存液中添加1.5% 大豆卵磷脂能提高精子質量[39]，然而精液5℃保存液中添加3.5%大豆卵磷脂會導致運動性和線粒體活性降低[40]。

近期研究表明，精液冷凍保存中添加少量摩洛哥堅果油和仙人掌籽油能提高精子總運動力、直線前進運動率和質膜完整性，并且降低了脂質過氧化（自發(fā)和誘導）和DNA 損傷。精液的液態(tài)保存液中添加1%仙人掌榕提取物，也得到了類似結果[41]。

3.5 其他復合物 近年還有許多復合物用來延長精液保存，例如白藜蘆醇、蜂王漿、丁基化羥基甲苯、番茄紅素、蝦青素等。據報道，白藜蘆醇和槲皮素分別是具有抗氧化活性的非黃酮類和黃酮類多酚。在精液保存中添加白藜蘆醇或槲皮素（5～20 μg/mL）能提高精子直線前進運動力[8]；稀釋液中添加（15 μg/109精子）白藜蘆醇可抑制精子脂質過氧化[42]。

蜂王漿主要成分是蛋白質，其次是糖類、氨基酸、核酸和脂肪酸等，具有多種生理和藥理作用。精液保存中添加蜂王漿（0.5%、1.0%）能提高精子運動性能和質膜完整性[43]。在精液保存中，蜂蜜、大蒜（大蒜屬）和脫脂奶混合使用能顯著提高精子總運動力[44]。

丁基化羥基甲苯是一種合成酚類抗氧化劑，通過提供氫原子來抑制自由基鏈反應，能有效地抑制脂質過氧化。稀釋液中添加丁基羥基甲苯（0.5、2.0 mmol/L）能提高精子質量，降低脂質過氧化[45]。Farshad 等[46]研究發(fā)現(xiàn)，冷凍保存液中添加2 mmol/L 丁基羥基甲苯能提高精子總運動力、直線前進運動率和質膜完整性。

咖啡因具有促進精子運動能力和提高精子質量的功能。?paleková 等[47]報道，在精液保存中添加4 mmol/L咖啡因能提高加魯特公羊精子質量。Kubovi?ová 等[48]報道，在冷凍保存稀釋液中添加咖啡因對精子總運動力具有積極作用，能維持精子運動性能和減少精子凋亡。

液體保存液中添加明膠能提高精液質量。Meque 等[49]在精液保存中添加不同濃度的明膠（0.5%、1%、2%和4%），結果發(fā)現(xiàn)最有效的濃度為0.5%。Yániz 等[50]報道，15℃精液保存液中添加明膠能提高精子的總運動力和受精能力，表明明膠作用機制可能是使精子更均勻地分布，防止死、活精子凝集沉淀，從而最大限度減少pH 和有毒代謝產物對精液的影響。

蝦青素是一種強效的脂溶性紅色類胡蘿卜素，它是在某些海洋植物中發(fā)現(xiàn)，是自然界中最強大的抗氧化劑之一。精液保存中添加蝦青素能保護精子質膜完整性，提高精子的總運動力[51]。

番茄紅素是番茄和紅色水果中最豐富的類胡蘿卜素，是所有類胡蘿卜素中最有效的抗氧化劑。Peker 等[52]報道，5℃精液保存液中添加番茄紅素能提高綿羊精子總運動力和線粒體活性，同時降低氧化應激。Uysal 等[24]報道，精液冷凍保存液中添加番茄紅素能提高精子的總運動力。

角黃素是在植物、綠藻、細菌、甲殼類動物、魚類和鳥類中發(fā)現(xiàn)的一種類胡蘿卜素。已經報道稱精液冷凍保存液中添加角黃素（10、25 μmol/L）能提高精子運動性能[53]。

褪黑激素是松果體分泌的一種激素，也是一種內源性抗氧化劑，但在綿羊精液保存中研究稀缺。褪黑素對哺乳動物精子功能的維持有良好的作用，可以改善精子的形態(tài)特征[54]。Ashrafi 等[55]研究表明，在冷凍稀釋液中添加褪黑素可以降低牛精子凍融過程的不利影響。褪黑素對精子的保護作用與降低脂質過氧化有關，也可能與提高抗氧化能力和抗氧化酶活性有關。褪黑素能夠促進幾種酶（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶）的活性，這幾種酶參與ROS 的代謝，能夠保持細胞膜的流動性。Li 等[56]報道，在水牛精子冷凍保存時添加褪黑素能降低精液處理和凍融對水牛精子的影響。Martín-Hidalgo 等[57]觀察到，野豬精液17℃保存中添加1 μmol/L 褪黑素除了改善精子中頂體完整的比例外，并沒有改善精子功能（保存7 d）。Succu 等[58]報道，褪黑素對公羊精子低溫保存的保護作用取決于褪黑素濃度。因此，在綿羊精液保存中添加褪黑素有待進一步研究。

丙酮酸在精液保存中常作為能量物質來添加，但其也具有抗氧化作用。通過丙酮酸能引起芳香族氨基酸氧化酶活性的增強，從而產生抗氧化作用。其作為抗氧化劑添加到綿羊精液稀釋液中的報道稀少。Upreti 等[59]報道，綿羊精液釋液（RSD-1）中添加丙酮酸鈉（5 mmol/L）具有抗氧化劑作用。

4 小 結

綿羊精液保存（液態(tài)或冷凍）時經過一系列處理，精子不可避免地產生活性氧，導致質膜受到損傷和精子質量下降。因此，多年來人們一直嘗試在稀釋液中添加抗氧化劑來清除精液保存中產生的活性氧，從而延長精液保存時間和精子質量，但研究結果不盡一致，還需要進一步深入研究和分析；此外，單獨添加某種抗氧化劑的研究較多，聯(lián)合添加的研究較少；需要對不同種類抗氧化劑進行深入了解，才能改進現(xiàn)有的稀釋液或開發(fā)出新型稀釋液。