代萬武，黃祖權，張波，杜勇軍，李興艷

山姜素（alpinetin）是從傳統(tǒng)中藥中提取的小分子藥物，來源廣泛，具有較高的藥用價值和開發(fā)價值。研究發(fā)現(xiàn)山姜素具有抗菌、抗氧化、抗癌、降血壓、降血脂、降血糖、止吐、鎮(zhèn)痛等作用［1］。山姜素可以抑制炎癥相關性疾病的發(fā)生發(fā)展，如在脂多糖（LPS）誘導子宮內膜炎的小鼠模型中，山姜素可以通過減輕子宮的組織學病變和降低髓過氧化物酶（MPO）的活性來保護小鼠免受子宮內膜炎侵害［2］。在LPS 誘導的小鼠急性腎損傷模型中，山姜素可以抑制腎組織中炎性因子如腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β 和IL-6 的產生，同時還可以通過抑制Toll 樣受體（TLR）4 的表達和核轉錄因子（NF）-κB 的活化來減輕腎臟損傷［3］。但是，有關山姜素對骨性關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）中軟骨細胞作用的研究較少。本研究通過LPS 構建OA 中的軟骨細胞損傷模型，旨在觀察山姜素在OA 治療中的作用，為小分子中藥治療OA提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD乳鼠5只，3～5 d，體質量（4±2）g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號SCXK（桂）2014-0002。

1.2 主要試劑與儀器 山姜素購自Sigma-Aldrich 公司，Eagle培養(yǎng)基、二甲基亞砜（DMSO）、CCK-8試劑盒、熒光素二乙酸酯/碘化丙啶（FDA/PI）購自Solarbio 公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）試劑盒、RNA提取試劑盒、RNA分離試劑盒購自Megentec 公司，逆轉錄試劑盒購自Fermentas 公司，免疫熒光抗體、免疫熒光染料FITC購自博士德公司，Ⅱ型膠原酶（Col2a1）、胰蛋白酶、活死細胞染色試劑盒、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液購自Gibco 公司，酶標儀購自Thermo Scientific MultiskanGO 公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，Light Cycle 96儀器購自瑞士Roche公司。

1.3 軟骨細胞的提取、分離和培養(yǎng) 于SD 乳鼠的膝關節(jié)處分離提取原代軟骨細胞后純化培養(yǎng)。具體步驟：將乳鼠過量麻醉致死，在超凈臺用無菌器械獲取乳鼠四肢關節(jié)處的軟骨組織，并剪成小顆粒后用胰蛋白酶在37 ℃下消化30 min，生理鹽水清洗3 遍后采用2 g/L 的Col2a1 置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化4 h后，重懸，取上清離心（1 000 r/min，5 min），收集細胞，在含10%（V/V）胎牛血清和1%（V/V）青霉素/鏈霉素的改良Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)、傳代。根據細胞生長形態(tài)，每1～2 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞完成后續(xù)實驗。

1.4 CCK-8 法檢測軟骨細胞活性 取對數(shù)生長期細胞，按5×103/孔的密度將軟骨細胞接種在96孔板中，將提取的軟骨細胞分為對照組、LPS 誘導組（模型組）和LPS 誘導后加山姜素處理組（山姜素組）。所有組別均設3 個復孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h待細胞貼壁。模型組和山姜素組中加入10 mg/L的LPS誘導1 h，構建軟骨細胞損傷模型［4］，隨后山姜素組中分別加入0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、30、40、50 mg/L 山姜素，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后每孔各加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2～4 h。酶聯(lián)免疫法檢測450 nm波長處每個孔的吸光度。

1.5 FDA/PI染色觀察軟骨細胞的存活 取對數(shù)生長期的軟骨細胞，消化離心計數(shù)后按1.5×104種植在含爬片的24 孔板中，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁，加入LPS誘導軟骨細胞損傷，再加5 mg/L 山姜素處理培養(yǎng)24 h 后，用現(xiàn)配的FDA/PI 染液（在1 mL PBS中分別加入0.5 μL FDA和2 μL的PI，混勻）室溫孵育5 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min，在熒光顯微鏡下觀察拍照、記錄分析。

1.6 qPCR 檢測 根據試劑盒步驟提取各組細胞總RNA，測定提取RNA濃度，逆轉錄反應合成cDNA再進行qPCR反應，檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）、Col2a1的mRNA 表達水平，引物序列見表1。每個組別設置3個復孔。反應體系為20 μL，反應條件為：95 ℃10 min，40 ℃10 s，60 ℃60 s，40個循環(huán)。按照2-ΔΔCt方法計算不同組別的mRNA相對表達量，重復3次。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR所用引物系列

1.7 免疫熒光分析軟骨細胞中IL-6的表達 將軟骨細胞按2.0×104接種在含爬片的24孔板中，培養(yǎng)24 h等待細胞貼壁。LPS 誘導炎癥環(huán)境，按照對照組、模型組和山姜素組處理24 h，PBS沖洗3次后用無水乙醇固定15～30 min，PBS洗3次，每次5 min，待用。將準備好的細胞爬片在室溫環(huán)境下用3%的H2O2孵育10～15 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min；室溫條件下山羊血清孵育10～15 min，棄掉山羊血清，注意勿洗；再用IL-6一抗稀釋液（1∶200）4 ℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3次，每次3 min；然后，滴加Cy3-羊抗兔IgG二抗稀釋液（1∶200），室溫避光孵育1 h，PBS沖洗3次，每次3 min；加入DAPI染液，避光孵育15 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min。細胞爬片防淬滅劑封片后熒光顯微鏡下觀察拍片、記錄分析。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0和Graph pad 8.0軟件對各實驗的結果數(shù)據進行分析，計量資料以±s表示，多組間數(shù)據用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。2 組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 山姜素處理對LPS 誘導的軟骨細胞活性的影響 模型組的吸光度（0.55±0.04）較對照組（0.65±0.03）降低（n=3，t=3.896，P＜0.05）。當采用劑量為5 mg/L的山姜素處理時，吸光度最高（n=3，F(xiàn)=5.321，P＜0.05）；當劑量＞5 mg/L時，軟骨細胞的吸光度并未隨之增加。因此選擇5 mg/L的山姜素劑量進行后續(xù)實驗研究，見圖1。

Fig.1 CCK-8 assay was used to detect the effect of alpinetin on the activity of LPS-induced chondrocytes.圖1 CCK-8法檢測山姜素組山姜素對LPS誘導軟骨細胞的活性的影響

2.2 FDA/PI 染色檢測山姜素對軟骨細胞的保護作用 與對照組比較，模型組的死細胞數(shù)量增加，活細胞數(shù)量減少；與模型組比較，山姜素組死細胞數(shù)量減少，活細胞數(shù)量增加，見圖2。

Fig.2 FDA/PI staining was used to detect the effect of alpinetin on chondrocytes cells(×200)圖2 FDA/PI染色檢測山姜素對軟骨細胞的作用（×200）

2.3 山姜素對Col2a1、IL-1β、IL-6、iNOS、TNF-α、MMP-13mRNA 的調控 與對照組相比，模型組Col2a1mRNA 表達降低，IL-1β、IL-6、iNOS、TNF-α、MMP-13mRNA 表達均顯著增高（P＜0.01）；山姜素組Col2a1mRNA 較模型組增高，IL-1β、IL-6、iNOS、TNF-α和MMP-13mRNA的表達水平較模型組降低（P＜0.01），見表2。

Tab.2 Comparison of the mRNA expression levels of inflammatory factors between 3 groups表2 3組炎性因子mRNA表達水平的比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of the mRNA expression levels of inflammatory factors between 3 groups表2 3組炎性因子mRNA表達水平的比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組山姜素組F Col2a1 1.00±0.05 0.45±0.03a 0.51±0.02ab 223.178＊＊IL-1β 1.03±0.35 75.60±1.88a 47.31±6.01ab 320.901＊＊IL-6 1.09±0.49 14.90±1.34a 9.56±0.90ab 153.828＊＊組別iNOS TNF-α MMP-13對照組模型組山姜素組F 1.05±0.41 716.00±22.71a 459.57±18.85ab 1 355.398＊＊1.01±0.63 118.99±11.65a 87.87±3.08ab 231.096＊＊1.00±0.14 12.61±0.20a 9.52±0.26ab 2 521.162＊＊

2.4 免疫熒光檢測各組軟骨細胞中IL-6 的表達 與對照組比較，模型組中IL-6 表達水平增高；與模型組比較，山姜素組中IL-6 表達水平降低，見圖3。

Fig.3 Immunofluorescence analysis of the regulation of alpinetin on IL-6 expression in chondrocytes cells(×200)圖3 免疫熒光分析山姜素對軟骨細胞IL-6表達的調控（×200）

3 討論

OA是由多種因素引起的慢性骨關節(jié)疾病，涉及關節(jié)軟骨、滑膜、軟骨下骨等組織，在中老年人中最常見并嚴重影響其健康和生活質量［5-6］。疾病早期大量炎性因子（如IL-1β、MMP-13和TNF-α）的過量表達和關節(jié)軟骨基質的降解［7］導致關節(jié)軟骨局部代謝紊亂，破壞軟骨細胞DNA 的合成以及細胞膜結構，從而導致軟骨細胞損傷以及軟骨下骨重塑，最終形成OA。

OA的主要臨床表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、關節(jié)摩擦感或摩擦音、僵硬、運動受限等。目前OA 的治療目標是減輕疼痛癥狀,矯正關節(jié)畸形和改善關節(jié)活動功能。治療方法主要包括阿片類鎮(zhèn)痛劑和非甾體類抗炎藥物治療,關節(jié)腔內注射玻璃酸鈉物理治療以及全（半）關節(jié)置換手術治療［8］。然而，這些藥物和治療手段只能減輕疼痛，并不能阻止OA 的進展。因此，在早期進行關節(jié)軟骨保護，減緩關節(jié)軟骨的退化是延緩OA進一步發(fā)生發(fā)展的理想策略。

山姜素是一種從天然植物中提取的類黃酮單分子藥物，具有良好的抗菌、抗氧化作用。研究表明，山姜素可通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）/NF-κB 信號通路抑制角叉菜膠誘導的小鼠急性腎損傷中炎性介質的產生［9］。He 等［10］證實山姜素可通過TLR4 信號通路降低葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的小鼠急性結腸炎相關炎性指標的表達。本研究旨在探討山姜素對LPS 誘導的OA 模型的軟骨細胞的保護作用，結果表明山姜素能夠有效地抑制LPS 誘導的軟骨細胞損傷。關節(jié)軟骨的主要成分是軟骨細胞和細胞外基質，其中膠原是細胞外基質中的主要成分，Col2a1 在其中起著軟骨支架結構的重要作用［11］。在山姜素組中Col2a1的基因表達較模型組增高，說明山姜素還可以通過促進Ⅱ型膠原的表達來保護軟骨細胞。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1 可以通過蛋白激酶/調節(jié)激酶/特異性蛋白1（MEK/ERK/Sp1）信號通路來促進關節(jié)軟骨的降解，并增強關節(jié)軟骨結構重塑［12］。此外，在OA 關節(jié)滑液和關節(jié)軟骨中能夠檢測到IL-6的表達，這表明IL-6參與OA的發(fā)生發(fā)展過程［13］。IL-1β和TNF-α是OA的關鍵促炎介質，同時TNF-α 對MMP-3 有較強的刺激作用［14］。此外，在OA 中，MMP-13 的高表達會導致軟骨細胞外基質的降解［15］。另有研究報道，抑制MMPs 的表達可以延緩關節(jié)軟骨的進展。在本研究中，山姜素組中的MMP-13的表達較模型組顯著降低，并較好地維持了細胞的形態(tài)并促進了軟骨細胞的增殖，進而保護軟骨細胞。一氧化氮（NO）已被確定為OA中的主要炎性介質之一，在OA的發(fā)展和進程中驅動多種病理變化。軟骨細胞中NO 的過量產生會導致軟骨破壞和細胞損傷，iNOS催化軟骨細胞中NO 的合成［16］，因此iNOS 的表達水平在一定程度上反映了軟骨細胞的損傷情況。在本研究中，模型組中的炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS）的表達水平顯著增加，山姜素組中的各項炎性因子明顯減少。

綜上所述，山姜素能夠通過抑制炎癥軟骨細胞中炎性因子IL-1β、iNOS、IL-6、TNF-α 及MMP-13的表達來維持軟骨細胞外基質的穩(wěn)態(tài)，并促進Col2a1 的表達，表明山姜素可能是治療骨性關節(jié)炎的一種可選擇的藥物，但有關山姜素保護軟骨細胞的具體細胞信號轉導機制還需進一步探討。