賈新轉(zhuǎn)，王聰敏，劉二緩，張娜，魏蘭

人體內(nèi)的維生素D 主要循環(huán)形式是25-羥基維生素D［25-（OH）D］，活性形式為1，25二羥維生素D［1，25（OH）2D］。1，25（OH）2D與細胞內(nèi)維生素D受體結(jié)合，其復(fù)合物穿過細胞核，作為轉(zhuǎn)錄因子與特定基因結(jié)合發(fā)揮作用。人類性腺組織和生殖器官中存在維生素D受體。人類維生素D結(jié)合蛋白具有遺傳多態(tài)性［1］，不同種族間維生素D 結(jié)合蛋白的表型不同［2］。敲除維生素D受體的小鼠不能產(chǎn)生成熟卵母細胞，表明維生素D 對小鼠卵泡發(fā)育至關(guān)重要［3］。然而，維生素D在卵泡發(fā)育過程中的作用尚不清楚。體外受精（in vitro fertilization，IVF）可觀察卵泡發(fā)育、卵母細胞受精、胚胎發(fā)育、著床以及最終的臨床結(jié)局，為研究卵泡內(nèi)維生素D 水平與卵母細胞發(fā)育的關(guān)系提供了獨特的條件。近年來有學(xué)者報道，卵泡液25-（OH）D 水平可影響IVF 的臨床結(jié)局，如植入率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率，但研究結(jié)論各不相同，推測可能與研究人群的種族不同有關(guān)［4-5］。目前IVF臨床妊娠率為50%左右［6］，影響IVF 妊娠結(jié)局的因素主要為胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性。本研究旨在探討繼發(fā)性不孕且需行IVF 治療的女性卵泡液25-（OH）D水平與卵泡發(fā)育、卵母細胞成熟、胚胎質(zhì)量及臨床結(jié)局是否相關(guān)，為提高IVF 臨床妊娠率提供新思路。′

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2019 年6 月—9 月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖中心初次就診且需進行IVF的192例繼發(fā)性不孕患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：既往有妊娠史，而后無避孕連續(xù)12 個月未孕且需行IVF 治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）男方因素所致繼發(fā)性不孕。（2）男方或女方有吸煙、酗酒史。（3）高血壓、糖尿病、自身免疫性疾病、甲狀腺功能異常、惡性腫瘤。（4）重要臟器（如心、腦、肺、肝、腎等）疾患。（5）入組前3個月內(nèi)補充維生素D 及芳香化酶抑制劑。入組患者年齡24～32歲，平均（27.99±2.85）歲。根據(jù)繼發(fā)性不孕原因分為4組：輸卵管因素組（慢性輸卵管炎癥、輸卵管阻塞）58例、子宮內(nèi)膜異位癥組［依據(jù)2013 年歐洲人類生殖及胚胎學(xué)會（ESHRE）共識［7］診斷］45 例、多囊卵巢綜合征（PCOS）組（依據(jù)2004 年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)［8］診斷）47 例、卵巢儲備不足組（依據(jù)2011 年Bologna標(biāo)準(zhǔn)診斷［9］）42例。根據(jù)卵泡液25-（OH）D水平聚類分析分為2組，A組121例，B組71例。本研究通過我院倫理委員會的批準(zhǔn)，征得研究對象同意，并簽署知情同意書。

1.2 藥物與儀器 重組人促卵泡刺激素注射液（商品名果納芬，默克雪蘭諾有限公司，進口藥品注冊證號S20160040，規(guī)格：450 IU）、醋酸加尼瑞克注射液［商品名晴樂，正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20183025，規(guī)格：0.5 mL：0.25 mg（以加尼瑞克計）］、重組人絨毛膜促性腺激素（HCG）（商品名艾澤，默克雪蘭諾有限公司，進口藥品注冊證號S20130091，規(guī)格：250 μg）；21 G 單腔取卵針（庫克澳大利亞有限公司，國械注進20192181581，型號K-OPS-6035-RWHET）；25-（OH）D試劑盒（英國IDS公司）；JC028酶標(biāo)儀（瑞士澳斯邦公司）。

1.3 卵巢刺激方案 卵巢刺激開始于月經(jīng)周期第2天或第3天。根據(jù)患者體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)、基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平、抗苗勒管激素（AMH）給予皮下注射重組人促卵泡刺激素注射液（藥物劑量150～225 IU/d）治療，當(dāng)?shù)? 個卵泡直徑達到12 mm 或雌二醇達到200 ng/L 時，開始給予皮下注射醋酸加尼瑞克注射液0.25 mg/d抑制垂體分泌促黃體生成素，當(dāng)至少1 個卵泡直徑達到18 mm 或2 個卵泡最大直徑達到16 mm時，給予皮下注射HCG 250 μg。

1.4 卵泡液的收集 皮下注射HCG 36 h 后，陰道超聲引導(dǎo)下，將21 G 單腔取卵針連接到-110 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）封閉真空系統(tǒng)，選擇最大直徑≥16 mm的卵泡進行取卵，將卵泡液放入無菌容器中，立即檢查卵泡液中是否存在卵母細胞，當(dāng)存在卵母細胞時，將卵母細胞置于培養(yǎng)皿中，將卵泡液（除外沖洗液和血液污染）3 000 r/min 離心10 min，取上清液置于到-80 ℃冰箱保存待測。

1.5 實驗室檢查 采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法，按照試劑盒說明檢測卵泡液25-（OH）D 水平。抽取研究對象清晨空腹靜脈血2 mL，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定外周血激素水平，包括雌二醇、孕酮、黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）。

1.6 卵泡數(shù)及卵泡直徑的測量 由我科同一主治醫(yī)師行陰道彩超測量卵泡數(shù)及卵泡直徑。

1.7 胚胎評估 依照2011 年Istanbul 共識［10］中所述胚胎發(fā)育標(biāo)準(zhǔn)進行評估。培養(yǎng)第3天（D3）的優(yōu)質(zhì)胚胎即有8個對稱的、非碎片的卵裂球。在培養(yǎng)的第5天（D5），在胚泡期考慮3個指標(biāo)：內(nèi)細胞團的發(fā)育、滋養(yǎng)外胚層的出現(xiàn)和囊胚腔的擴張。D5優(yōu)質(zhì)囊胚是指擴張囊胚，囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變薄（4級）及正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶中逸出（5 級），具有高質(zhì)量的內(nèi)細胞團（A 級：細胞數(shù)目多，排列緊密）和滋養(yǎng)外胚層（A 級：上皮細胞層由較多的細胞組成，結(jié)構(gòu)致密）。

1.8 各指標(biāo)計算 IVF正常受精率=D1出現(xiàn)2原核（PN）及2極體（PB）卵子數(shù)/IVF 加精卵子總數(shù)×100%；D3 優(yōu)質(zhì)胚胎形成率=D3 優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵子數(shù)×100%；D5 優(yōu)質(zhì)囊胚形成率=D5 優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/正常受精卵子數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠（胚胎移植后35 d行B超檢查可見子宮內(nèi)孕囊）周期數(shù)/胚胎移植總周期數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（±s）表示。應(yīng)用K-均值聚類分析識別卵泡液25-（OH）D不同水平群體。2組間比較采用t檢驗；多組間的比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料以例或例（%）表示，2組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同繼發(fā)性不孕病因組一般資料及卵泡液25-（OH）D 的比較 4 組患者年齡、BMI、雌二醇、孕酮、LH、FSH及卵泡液25-（OH）D水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 K-均值聚類分析2 組一般資料以及卵泡液25-（OH）D 的比較 根據(jù)卵泡液25-（OH）D 水平進行K-均值聚類分析，B 組卵泡液25-（OH）D 水平顯著高于A 組（P＜0.01）；B 組HCG 日（皮下注射HCG當(dāng)日）大卵泡數(shù)及雌二醇、孕酮水平較A組顯著升高（P＜0.01）；2 組患者年齡、BMI、促性腺激素（Gn）治療量、HCG 日卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、LH、FSH，啟動日（卵泡刺激第1天）雌二醇、孕酮、LH及FSH水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.3 2 組胚胎評估及臨床結(jié)局的比較 B 組IVF 正常受精率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎形成率、D5優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、臨床妊娠率均顯著高于A組（P＜0.05），見表3。

Tab.1 Comparison of general information and 25-(OH)D levels in follicular fluid between four groups of patients表1 不同病因組一般資料及卵泡液25-（OH）D水平的比較

Tab.2 Comparison of general information and 25-(OH)D levels in follicular fluid between two groups表2 2組研究對象一般資料及卵泡液25-（OH）D水平的比較

Tab.3 Comparison of embryo evaluation and clinical outcomes between two groups表3 2組研究對象胚胎評估及臨床結(jié)局的比較

3 討論

目前認為維生素D缺乏是一個全球性公共衛(wèi)生問題［11］。人類80%～90%的維生素D 來源于日光照射皮膚合成，其余通過飲食獲得。25-（OH）D經(jīng)1α-羥化酶轉(zhuǎn)化為活性形式1，25（OH）2D。1α-羥化酶及維生素D受體存在于卵巢、子宮、胚胎、睪丸、前列腺等組織中，因此可在生殖器官局部形成維生素D的活化形式并發(fā)揮作用。女性類固醇激素主要產(chǎn)生于卵巢顆粒細胞中，維生素D 通過其受體可以調(diào)節(jié)卵巢類固醇激素生成［12］。有研究證實維生素D有利于月經(jīng)周期恢復(fù)和子宮內(nèi)膜增殖［13-14］，促進卵泡發(fā)育［15］。

女性不孕病因包括盆腔因素如慢性輸卵管炎癥、輸卵管積水或阻塞、輸卵管異常、子宮內(nèi)膜異位癥、生殖器腫瘤、生殖道發(fā)育異常等，以及排卵障礙如PCOS、卵巢功能減退和早衰、持續(xù)性無排卵等。本研究入組患者病因包括：輸卵管因素、PCOS、子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢儲備不足。多數(shù)學(xué)者僅對單一病因女性不孕癥患者血清/卵泡液25-（OH）D 進行相關(guān)性研究，如輸卵管因素［6］、PCOS［16］、子宮內(nèi)膜異位癥［17］、卵巢儲備不足［18］患者與健康對照女性相比，血清25-（OH）D水平均較低。而關(guān)于女性不孕癥不同病因組別之間血清/卵泡液25-（OH）D 比較的研究尚少見。本課題組在前期研究中證實卵泡液25-（OH）D水平與血清25-（OH）D水平高度相關(guān)，可反映體內(nèi)25-（OH）D儲存狀態(tài)［19］。本研究已排除可能影響25-（OH）D水平的潛在混雜因素（如糖尿病、高血壓、吸煙）［20］，結(jié)果顯示在不同繼發(fā)性不孕原因分組中，卵泡液25-（OH）D水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此在分析繼發(fā)性不孕患者卵泡液25-（OH）D水平時，暫不考慮病因因素。本研究樣本量較小，可擴大樣本量進一步驗證。

目前國內(nèi)外尚無卵泡液維生素D正常水平的標(biāo)準(zhǔn)。本研究根據(jù)卵泡液25-（OH）D水平進行聚類分析，將研究對象分為卵泡液25-（OH）D 低水平和高水平2 組，2 組卵泡液25-（OH）D 水平有顯著差異。2組患者年齡、BMI、Gn治療量、HCG日卵泡數(shù)、獲卵數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在HCG日，B組較A組外周血雌二醇、孕酮水平更高且有更多的大卵泡，提示在卵泡液25-（OH）D高水平組卵巢對藥物刺激的反應(yīng)較好。Kyrou 等［21］報道，在HCG 日大量的大卵泡與較高水平的雌二醇、孕酮相關(guān)。恒河猴動物實驗證明卵泡液中1，25（OH）2D3以劑量和階段依賴的方式影響卵泡的存活和生長以及卵母細胞的生長，低劑量組1，25（OH）2D3促進竇前卵泡存活，高劑量組卵泡直徑增大［22］，與本研究的結(jié)果相似。在人類顆粒細胞模型中，卵泡液中25（OH）D不足（＜75 nmol/L）的小卵泡（＜14 mm）與卵泡液中25（OH）D 水平≥75 nmol/L 的小卵泡相比，前者AMH 受體-ⅡmRNA 水平是后者2 倍［23］。而AMH 可降低卵泡對FSH 的敏感性及卵巢顆粒細胞芳香化酶的活性，阻礙卵泡發(fā)育［24］。推測維生素D通過可抑制AMH受體-Ⅱ的表達，降低AMH 對卵巢顆粒細胞的作用，從而促進卵泡成熟［25］。

本研究結(jié)果顯示，B組IVF正常受精率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎形成率、D5優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、臨床妊娠率高于A組，提示卵泡液25-（OH）D 可能有助于行IVF 治療的繼發(fā)性不孕女性卵母細胞成功受精、胚胎發(fā)育及臨床妊娠，可能與以下機制有關(guān)：（1）維生素D 通過AMH調(diào)節(jié)卵泡/卵母細胞成熟。人AMH基因啟動子區(qū)域存在功能性維生素D反應(yīng)元件（VDRE），維生素D可直接影響AMH的表達［11］。AMH結(jié)合AMHR-Ⅱ受體，通過Smad1/5/8 信號通路調(diào)節(jié)卵泡/卵母細胞成熟［26］。（2）維生素D通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性而影響臨床妊娠率［27］。維生素D可與子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中同源異型盒蛋白（homeobox protein A10，HOXA10）的受體結(jié)合，上調(diào)HOXA10 基因表達。在胚胎植入期HOXA10基因高表達是子宮內(nèi)膜容受性良好的關(guān)鍵標(biāo)志，同時HOXA10 是胚胎植入的必需基因，對女性生育力和胚胎著床至關(guān)重要。（3）維生素D 可通過參與免疫調(diào)節(jié)功能影響胚胎著床及早孕［28］。維生素D 通過抑制Th1 細胞增殖和促進Th2細胞來調(diào)節(jié)輔助性T淋巴細胞群［29］，Th1細胞分泌白細胞介素（IL）-2 和腫瘤壞死因子-α 等細胞因子促進細胞免疫，Th2 細胞可分泌IL-6、IL-10 等細胞因子促進體液免疫，在正常妊娠母體中，細胞免疫受抑制，體液免疫增強，Th2細胞處于優(yōu)勢地位有利于母體免疫耐受［30-31］。

由于本研究是單中心研究，且樣本量較??；加之目前無卵泡液25-（OH）D 正常值標(biāo)準(zhǔn)，本研究分組標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)納入數(shù)據(jù)界定，因此也僅適合本研究。

綜上所述，不同病因的繼發(fā)性不孕女性卵泡液25-（OH）D水平無顯著差異；在繼發(fā)性不孕行IVF治療的女性中，卵泡液25-（OH）D 高水平更易產(chǎn)生大卵泡及優(yōu)質(zhì)胚胎，其臨床妊娠率也更高。