梁 晨，段鐘平，鄭素軍

近年來，基因測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳性和病因不明疾病的診斷、無創(chuàng)產(chǎn)檢、臨床微生物的檢測、個(gè)體化用藥、腫瘤診治等方面[1, 2]?；驕y序多由第三方檢測公司完成，這使得臨床醫(yī)師如何選擇恰當(dāng)?shù)幕驒z測方法，并正確解讀檢測報(bào)告，顯得越發(fā)重要[3, 4]。既往該類工作多由具備遺傳學(xué)資質(zhì)的醫(yī)師完成，然而其數(shù)量在世界范圍內(nèi)均明顯缺乏[5, 6]。在臨床實(shí)踐中，多數(shù)臨床醫(yī)生常會(huì)面臨諸如目前有哪些常見基因測序技術(shù)、它們有哪些優(yōu)缺點(diǎn)、如何恰當(dāng)選用、如何準(zhǔn)確理解檢測報(bào)告等問題[7]?；诖?，本文將結(jié)合我們在遺傳代謝性肝病診療中的一些體會(huì)，對如上問題做一介紹。

1 三代測序技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用選擇

1.1 第一代測序技術(shù) 1975年，Sanger發(fā)明了利用DNA聚合酶的雙脫氧核苷酸末端終止測序法(Sanger法)，第1代測序技術(shù)正式誕生[7, 8]。該方法對目標(biāo)基因擴(kuò)增后通過毛細(xì)管電泳讀取序列[9]。可用于未知或已知的基因變異的檢測，基本適用于所有的基因變異類型，如點(diǎn)變異、插入或缺失變異等，準(zhǔn)確率幾乎100%，是測序技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)。但其依賴于PCR擴(kuò)增，只能逐段分析單個(gè)DNA片段，通量小。自動(dòng)化程度低，測序成本高[3,8,10]。

1.2 第二代測序技術(shù)(next generation sequencing, NGS) 又被稱為高通量測序技術(shù)，可同時(shí)對幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定。根據(jù)測序覆蓋范圍，將其分為全基因組測序(whole gene sequencing, WGS)、全外顯子測序(whole exome sequencing, WES)和靶向區(qū)域測序(targeted /panel sequencing)[3, 11]。與第一代測序技術(shù)相比，NGS以高通量、高靈敏性、高準(zhǔn)確性、自動(dòng)化程度高、成本低廉為顯著特征，合成與測序同時(shí)進(jìn)行，可一次性檢測未知物種、未知基因全基因組區(qū)域的所有位點(diǎn)。但該技術(shù)需要將基因組片段化，讀長(測序反應(yīng)所能測得序列的長度，須將基因組分割為讀長以內(nèi)的短序列才能測序)較短，不利于后續(xù)分析數(shù)據(jù)時(shí)信息的拼接整合，也不能捕獲所有的基因變異類型[3, 12]。WGS主要針對全基因組水平的變異進(jìn)行檢測，可最大限度地覆蓋靶標(biāo)，但費(fèi)用昂貴，某些著絲粒區(qū)、端粒區(qū)和某些高GC含量區(qū)等特定區(qū)域，屬于測序盲區(qū)，數(shù)據(jù)可信度相對較差。目前，除應(yīng)用于基因組拷貝數(shù)變異(染色體微小片段缺失或重復(fù))等少數(shù)情況外，“原則上全基因組測序一般不用于臨床檢測[13]”，其臨床應(yīng)用尚需進(jìn)行前瞻性試驗(yàn)以評估選擇WGS是否利大于弊[14-16]。

外顯子序列大概占到人類基因組序列的1%～2%左右[17]。由于遺傳性疾病基因變異主要發(fā)生在外顯子區(qū)域，且WES與WGS相比，數(shù)據(jù)分析量相對較小，成本相對較低，基因型-表型關(guān)系更直接，可一次性捕獲約20000個(gè)與人類疾病相關(guān)的基因，在遺傳性疾病診斷方面得到了更為廣泛應(yīng)用。例如對孕婦和胎兒進(jìn)行WES檢測，可為孕婦及其家庭提供優(yōu)生優(yōu)育咨詢等服務(wù)[18, 19]。通常，靶向區(qū)域測序是對可引發(fā)某種臨床表現(xiàn)(即表型)的多種可能性致病基因進(jìn)行測序。與WES相比，在同等數(shù)據(jù)量的情況下，靶向測序?qū)δ繕?biāo)序列的覆蓋率可達(dá)99%以上，甚至100%，平均測序更深，靶向區(qū)域測序在數(shù)據(jù)質(zhì)量方面優(yōu)于全基因組或全外顯子測序[12, 16]，提高了表型相關(guān)致病基因變異的檢出率，且檢測及數(shù)據(jù)分析成本減小，診斷時(shí)間縮短。

1.3 第三代測序技術(shù) 第三代測序技術(shù)是在單分子和單細(xì)胞水平對基因組進(jìn)行測序的技術(shù)[20]，測序速度快，每秒讀取堿基數(shù)可達(dá)10個(gè)，其理論讀長可達(dá)10 kb，甚至可以無限長。不需要PCR擴(kuò)增，檢測精度明顯提高[21]，適用于測序要求高的全基因組測序、甲基化研究、RNA測序、基因的重復(fù)序列(例如polyA尾)和癌癥的診治等[22, 23]。但該方法成本高，通量及準(zhǔn)確性相對低，目前多應(yīng)用于科研領(lǐng)域，對遺傳性疾病的檢測并非首選[24, 25]。

1.4 基因測序方案的選擇 臨床上，應(yīng)結(jié)合患者臨床特征和不同測序技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，來恰當(dāng)選擇檢測方法[7]。針對臨床表現(xiàn)高度疑似某種單基因病、有常見致病變異位點(diǎn)時(shí)，可應(yīng)用一代測序(例如以非溶血性間接膽紅素升高為主要表現(xiàn)，懷疑Gilbert綜合征時(shí)，常見變異包括A(TA)7TAA、c.211G>A，-3156G>A和-3279T>G等)。對于臨床表型相對復(fù)雜、鑒別診斷的范圍較廣而有一定困難時(shí)(例如主要表現(xiàn)為黃疸、脾腫大、貧血，不能排除Gilbert綜合征與遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥等血液系統(tǒng)疾病共存時(shí))，可以采用全外顯子測序；對于有相同或相似臨床表現(xiàn)的一組遺傳代謝性疾病，例如膽汁淤積癥，可采用靶向區(qū)域測序，對進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥(PFIC1-5型)、良性復(fù)發(fā)性肝內(nèi)膽汁淤積癥(BRIC1-2型)、先天性膽汁酸合成障礙、Alagille綜合征、Niemann-Pick病(C1/C2型),Zellweger 綜合征等過氧化物酶病等多種疾病的致病基因?qū)崿F(xiàn)靶向測序，以增加診斷的敏感度和準(zhǔn)確性[16, 17]。目前，全基因組測序和第三代測序，除少數(shù)用于懷疑基因組結(jié)構(gòu)改變引起的疾病或待檢樣本不易獲取、量少等特殊情況外，目前更多用于科學(xué)研究[7]。

2 基因檢測報(bào)告解讀

2.1 檢測報(bào)告的生成 以二代測序?yàn)槔?，測序數(shù)據(jù)經(jīng)與人類基因組序列比對分析，對檢出的變異位點(diǎn)可借助比對疾病數(shù)據(jù)庫/群體數(shù)據(jù)庫，例如人類基因數(shù)據(jù)庫(HGMD)、美國國家生物信息學(xué)中心ClinVar、千人組計(jì)劃(1000genomics)等，以及參考已發(fā)表的文獻(xiàn)，來判定基因變異的臨床意義。同時(shí)，運(yùn)用基因分析軟件，如PolyPhen-2、SIFT、MutationTaster、Provean、GeneSpilcer等，預(yù)測相應(yīng)變異對蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的影響[26]。最后，用Sanger測序驗(yàn)證與表型可能相關(guān)的變異，并結(jié)合患者表型特征和臨床檢查結(jié)果、家族史、遺傳方式等信息，按照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(the American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)制定的測序變異的解讀指南，得出基因變異的致病性判斷[16, 27]。

2.2 檢測報(bào)告的常見內(nèi)容 一份正規(guī)的檢測報(bào)告，常由報(bào)告正文和附錄兩部分組成。正文的重要內(nèi)容包括檢測結(jié)果以及對結(jié)果的解讀。附錄常列出此次檢測的補(bǔ)充信息，如檢測基因的范圍、基因?qū)?yīng)疾病的背景知識、檢測方法的細(xì)節(jié)、檢測的局限性、質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)和附圖等。

2.2.1 檢測結(jié)果 以ACMG指南為標(biāo)準(zhǔn)[27]，常包括變異基因名稱、染色體編號和坐標(biāo)、核苷酸變異、氨基酸變異、等位基因雜合性、變異的致病性、參考文獻(xiàn)等?，F(xiàn)對報(bào)告中涉及的相關(guān)內(nèi)容分別說明如下(以ATP7B基因?yàn)槔?。

基因名稱：原則上列出的是美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)上的官方命名[16]，在染色體上的位置是絕對固定的，如ATP7B基因位于13號染色體長臂1區(qū)4帶3亞帶(13q14.3)[28]。對于DNA及氨基酸水平的變異，采用不同命名方式，例如g.代表基因組序列，c.是指編碼DNA序列，p.代表氨基酸序列，m.是指線粒體相關(guān)序列[27]。

基因變異類型：主要包括：①點(diǎn)變異：單個(gè)堿基改變，如ATP7B基因c.2333G>T，表示在編碼區(qū)2333位的堿基由G變異為T；IVS18+6C>T，表示該基因內(nèi)含子18的第6位堿基C變異為T；②移碼變異：在DNA的堿基組成中缺失或插入一個(gè)或幾個(gè)堿基對，如插入變異-129_-128insGCCGC，表示從非編碼區(qū)128位置到129位置插入GCCGC。

基因變異導(dǎo)致氨基酸改變類型：主要有，①錯(cuò)義變異：單個(gè)堿基變異造成該位置氨基酸變化，如c.2333G>T對應(yīng)的氨基酸變化p.R778L，表示ATP7B編碼的氨基酸第778位置上精氨酸(單字母縮寫為R)變異為亮氨酸(L)；②同義變異:堿基發(fā)生變異，但編碼的氨基酸未發(fā)生改變,如p.L770L，表示770位置上的亮氨酸未發(fā)生改變；③無義變異：堿基變異使編碼氨基酸的密碼子變異為終止密碼子，使肽鏈的合成提前終止(用X表示)，如p.Q111X，表示編碼111位置上谷氨酰胺(Q)的密碼子變異為終止密碼子；④移碼變異：是指在某位點(diǎn)插入或缺失3N+1個(gè)堿基后，該位點(diǎn)及之后的的氨基酸序列發(fā)生明顯改變。如p.V1146A fs*6，表示1146位置上氨基酸由纈氨酸(V)變異為丙氨酸(A),自該位點(diǎn)后移碼(fs)并翻譯5個(gè)氨基酸就終止了；⑤剪接位點(diǎn)變異：因影響DNA的轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 mRNA 序列的異常，從而導(dǎo)致蛋白序列的異常。需要注意的是，同義變異常不致病，而無義變異、移碼變異，特別是起始密碼子變異、單個(gè)或多個(gè)外顯子缺失、經(jīng)典±1或2的剪切變異，常導(dǎo)致蛋白無功能，在致病性證據(jù)級別上歸為非常強(qiáng)。

遺傳方式：根據(jù)變異基因所在染色體類型(常染色體或性染色體)及遺傳方式(顯性或隱性)的不同，分為常染色體顯性遺傳(autosomal dominant inheritance，AD)、常染色體隱性遺傳(autosomal recessive inheritance，AR)、性連鎖遺傳：X連鎖顯性遺傳(X-linked dominant inheritance，XLD)、X連鎖隱形遺傳(X-linked recessive inheritance，XLR)和Y連鎖遺傳和線粒體基因母系遺傳等。如ATP7B基因變異引起的Wilson病屬于AR[28]。需要指出的是，一種疾病有可能有多種遺傳方式。

等位基因(allele) 指位于一對同源染色體(分別來源于父母)相同基因位置上控制同一性狀的基因。對于常染色體上的變異，當(dāng)一對等位基因相同位置上都發(fā)生變異時(shí)稱為純合變異(Hom)；一對等位基因中只有一個(gè)基因發(fā)生變異時(shí)，稱為雜合變異(Het)。對于僅有1條X染色體的男性來說，Y染色體上缺少與之對應(yīng)的等位基因，故男性僅有等位基因中的1個(gè)成員，稱為半合子(Hemi)。復(fù)合雜合變異是指在由父母雙方遺傳來的一對等位基因中，其中一個(gè)等位基因上發(fā)現(xiàn)了變異，另一個(gè)等位基因的不同基因位點(diǎn)也發(fā)生了變異。需指出的是，對于AD，理論上只要有一個(gè)雜合的高危害性變異就能致病。但如果是AR，只有兩個(gè)等位基因都存在有害變異，也就是純合或者復(fù)合雜合時(shí)才能致病。對于XLR，男性半合子即可發(fā)病。

變異位點(diǎn)的致病性：2015年，ACMG和美國分子病理學(xué)會(huì)(the Association for Molecular Pathology，AMP)聯(lián)合提出了詳細(xì)的等級評定標(biāo)準(zhǔn)，可分為致病、疑似致病、臨床意義未明、疑似良性、良性5個(gè)等級[27]。一般來講，當(dāng)變異認(rèn)定為致病、疑似致病時(shí)，其臨床意義較大，但仍需結(jié)合臨床、遺傳方式和家族史來綜合判斷。而報(bào)告中列出的參考文獻(xiàn)常有助于進(jìn)一步了解該位點(diǎn)的致病性。應(yīng)注意的是，部分文獻(xiàn)變異位點(diǎn)的研究方法、檢測范圍可能存在缺陷，并沒經(jīng)過功能驗(yàn)證，不能簡單地認(rèn)為文獻(xiàn)報(bào)道在患者中檢出的變異就是致病變異[29]。同時(shí)，對于臨床意義未明的變異，需要綜合參考軟件預(yù)測及人群頻率注釋信息，隨著基因不斷被報(bào)道及遺傳學(xué)證據(jù)的累積，將來也可能轉(zhuǎn)為致病等級[27]。

2.2.2 報(bào)告解讀及附錄 報(bào)告解讀是針對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋。它常常包括變異位點(diǎn)致病性的證據(jù)，例如檢測所發(fā)現(xiàn)的變異是否全部或部分地解釋患者的臨床表型、是否有文獻(xiàn)報(bào)道、用軟件對編碼蛋白的功能影響預(yù)測等。同時(shí)，一些優(yōu)秀報(bào)告還包括對臨床醫(yī)生的建議，這些建議包括一些需補(bǔ)充的臨床檢測，如對患者進(jìn)行細(xì)胞酶學(xué)/功能的檢測，以及對患者家系其他成員進(jìn)行變異檢測，以便為進(jìn)一步解讀變異檢測結(jié)果提供支持[27]。

報(bào)告的附錄部分會(huì)提供很多檢測的細(xì)節(jié)，例如檢測基因的范圍、對應(yīng)疾病的背景知識、檢測方法細(xì)節(jié)、檢測的局限性、質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)及附圖等，了解這些有助于對檢測結(jié)果做出更好的解釋。例如應(yīng)了解檢測覆蓋的范圍，采用的是全基因組、全外顯子組檢測，還是基因靶向測序。靶向區(qū)域測序要注意公司提供的基因檢測范圍是否包含臨床疑似疾病的致病基因，以免造成漏檢[12, 16, 17]。

3 基因檢測在遺傳代謝性肝病診斷中一些應(yīng)用體會(huì)

3.1 送檢信息要全面，表型要準(zhǔn)確 細(xì)致可靠的患者基本信息、臨床表型、常規(guī)檢查結(jié)果及家族史是診斷遺傳病的基礎(chǔ)，也是解讀基因檢測結(jié)果的依據(jù)[30]。在二代測序數(shù)據(jù)分析中，檢測機(jī)構(gòu)常會(huì)重點(diǎn)分析與患者表型可能相關(guān)的基因是否存在致病性變異。若送檢單中臨床表型提供不準(zhǔn)確，有可能導(dǎo)致基因檢測結(jié)果與臨床表型或診斷不符，使臨床醫(yī)師難以采信檢測的結(jié)果。為避免非專業(yè)表型表述，建議使用中文人類表型標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(Chinese Human Phenotype Ontology，CHP)(可登陸http：//www．Chinahpo.org/在線搜索)。同時(shí)，患者的年齡和性別對于疾病的表型、性連鎖疾病等會(huì)有提示作用：家族史常提示遺傳方式，準(zhǔn)確的家族史有助于給數(shù)據(jù)分析提供方向[27]。

3.2 送檢標(biāo)本最好包括一代親屬，尤其是父母親 通過家系的共分離分析，有利于提高發(fā)現(xiàn)致病基因變異的陽性率，也有助于過濾掉非致病變異，使檢測結(jié)果更精準(zhǔn)。所謂遺傳學(xué)共分離原則，是指由于表型和基因型的連鎖綁定，在一個(gè)家系里，患者和非患者在致病變異位置上的基因型一般是不同的[27]。例如對于AR遺傳病，患者是純合或復(fù)合雜合基因型，父母各自攜帶一個(gè)致病等位基因。如果僅檢測患者本人，是無法判定復(fù)合雜合變異的。相反，AR遺傳病患者基因上發(fā)現(xiàn)一個(gè)純合變異，如果父母任何一方也是純合基因型但無臨床表型，則該變異的致病性可能很小。對于AD遺傳病，患者是雜合基因型，理論上其父母之一也應(yīng)當(dāng)是患者。根據(jù)這一原則，AD遺傳病患者基因上發(fā)現(xiàn)的雜合變異，在外顯率為100%的情況下，如果父母都未患病且不攜帶此變異，則可確認(rèn)其為新發(fā)變異。

3.3 不能將基因檢測作為診斷的唯一標(biāo)準(zhǔn) 假陽性可由檢測方法本身缺陷所致，也可以由報(bào)告閱讀者“誤判”所致。前者例如WES測序在外顯子捕獲、PCR擴(kuò)增、重新拼接過程中可能出現(xiàn)錯(cuò)誤而檢出“基因變異”，該情況盡管少見，但若報(bào)告中未提示該結(jié)果是否經(jīng)過一代測序驗(yàn)證，且不能解釋患者臨床表現(xiàn)時(shí)，則應(yīng)警惕假陽性問題。誤判主要由解讀不當(dāng)引起。例如僅檢測到UGT1A1基因c.211G>A單位點(diǎn)雜合變異，在檢測報(bào)告中常標(biāo)識為致病性，此時(shí)若解讀不當(dāng)，則可能誤診為Gilbert綜合征，導(dǎo)致疾病診斷的“假陽性”。其實(shí)，在我國正常人群中，該基因變異攜帶率高達(dá)10%，我們前期小樣本研究顯示，在總膽紅素<17.1μmol/L的健康體檢人群中，c.211G>A基因頻率高達(dá)29.1%。既往也曾有病例報(bào)道，對Wilson先證者的親屬進(jìn)行基因篩查發(fā)現(xiàn)，其兄弟姐妹即使存在相同的純合或復(fù)合雜合變異位點(diǎn)，也有可能終生不發(fā)病[29]。單純依靠基因檢測結(jié)果，也可能造成疾病診斷的“假陽性”?；蜃儺惻c臨床表型的相關(guān)性還受到宿主本身(例如體內(nèi)激素水平、年齡、性別)、修飾基因、外界環(huán)境、甚至藥物的影響。故檢測結(jié)果也需要與患者具體臨床表現(xiàn)結(jié)合起來，最終做出準(zhǔn)確診斷并制定相應(yīng)的處理措施。

由于檢測方法及數(shù)據(jù)質(zhì)量存在的固有缺陷，使得本來存在的致病性變異未檢出，可產(chǎn)生假陰性問題。例如采用全外顯子測序，則針對增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、內(nèi)含子以及由于外顯子和內(nèi)含子的拼接區(qū)的變異覆蓋不到而無法檢出，出現(xiàn)假陰性。例如UGT1A1基因的增強(qiáng)子區(qū)-3279位點(diǎn)、啟動(dòng)子區(qū)的TA變異，常常是Gilbert的致病位點(diǎn)，采用全外顯子測序就不能檢出，而應(yīng)用一代測序則可有效檢測出該位點(diǎn)。當(dāng)WGS需進(jìn)行捕獲雜交時(shí)，對于檢出的大片段的基因缺失，很難判斷是因?yàn)殡s交沒有捕獲到，還是真的缺失。再例如靶向區(qū)域測序，由于所測基因由檢測機(jī)構(gòu)自行確定，其中若沒有包含疑似疾病的真正致病基因，也可以導(dǎo)致檢測陰性[17]。所以，再次強(qiáng)調(diào)所有測序方案都不是萬能的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍，不是二代測序就一定比一代測序好，檢測不出變異也不能完全排除疾病。只有掌握測序機(jī)理和優(yōu)缺點(diǎn)，才能面對檢測結(jié)果，做到正確解讀[7]。若發(fā)現(xiàn)基因檢測結(jié)果與臨床不符時(shí)，建議加強(qiáng)臨床和實(shí)驗(yàn)室之間的溝通和互動(dòng)，也是一種增加診斷成功率的好方法。必要時(shí)，可向第三方檢測公司索要檢測的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行再分析，尤其在檢測結(jié)果為陰性或意義未明時(shí)[27]。