馮煜婷，姜治偉，楊國利，謝志堅

組織工程學(xué)研究的興起解決了以往器官和組織移植的來源問題，二十余年的發(fā)展使其在種子細(xì)胞、生物材料、細(xì)胞與生物材料的整合以及植入物與體內(nèi)微環(huán)境的整合等方面得到不斷革新。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)已有超過500次臨床試驗，共涉及2 000例以上患者[1]，包括骨和軟骨、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等不同疾病模型。

然而MSC在實際臨床應(yīng)用時還存在很多問題，首先是數(shù)量問題，MSC需經(jīng)過體外培養(yǎng)才能達(dá)到足夠治療的細(xì)胞數(shù)量；另外，給藥的時間、劑量和方式仍沒有統(tǒng)一的認(rèn)識，尤其是給藥方式。系統(tǒng)給藥會導(dǎo)致細(xì)胞在非靶器官聚集，甚至可能引起栓塞、材料吸收等情況，局部給藥則有出血和組織損傷的風(fēng)險。對于這些給藥參數(shù)較難找到最適搭配，因此有人提出并開始實踐使用MSC的分泌產(chǎn)物或分泌因子來代替直接應(yīng)用細(xì)胞，即無細(xì)胞療法[2]。近年來，MSC來源的脫細(xì)胞基質(zhì)(mesenchymal stem cell derived extracellular matrix, MSC-ECM)作為一種新型的生物材料，因其供源豐富、免疫原性低等優(yōu)勢逐漸被重視。

1 MSC-ECM的主要成分與制備

MSC的分泌產(chǎn)物又稱MSC-分泌蛋白質(zhì)組，包括細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞粘附蛋白、酶、酶抑制/促進(jìn)劑、生長因子和生長因子結(jié)合蛋白、細(xì)胞因子、趨化因子以及一些基因產(chǎn)物如micro RNA，其中ECM蛋白占的最多[3]。對于MSC分泌蛋白質(zhì)組的成分目前還在研究中，ECM主要成分包括膠原、蛋白聚糖、糖蛋白及其他非膠原糖蛋白[4]，圍繞在細(xì)胞周圍，為細(xì)胞的增殖和生長提供相應(yīng)的環(huán)境[5]。近年來，有一些團隊開始嘗試脫細(xì)胞的方法來制取MSC-ECM，并通過再細(xì)胞化進(jìn)行體內(nèi)體外實驗研究。

脫細(xì)胞的概念來源于器官和組織移植的研究[6]，是指除去細(xì)胞成分以減少免疫反應(yīng)的過程，最終獲得三維的有天然成分和組織結(jié)構(gòu)的生物支架。脫細(xì)胞后，將需要的細(xì)胞重新接入，創(chuàng)造可植入體內(nèi)的功能性移植物，稱為再細(xì)胞化。

利用體外培養(yǎng)的MSC制備ECM需要三個步驟[7]。

① 培養(yǎng)產(chǎn)生ECM。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基體外培養(yǎng)MSC，同時補充維生素C(Vitamin C，Vc)來增加膠原及其他ECM成分的合成[8-9]，一些惰性分散的大分子物質(zhì)[10]如硫酸葡聚糖70和400、卡拉膠[11]等也可加快ECM的產(chǎn)生。另外，在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)表面預(yù)鋪如聚二甲硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)[12]來固定細(xì)胞，可促進(jìn)細(xì)胞生長和粘附，防止ECM部分脫離。

② 脫細(xì)胞。與整塊組織和器官脫細(xì)胞相比，細(xì)胞來源的ECM獲取時間更短、更溫和，不同脫細(xì)胞方法的效果略有不同[13-14]。最常用的試劑是氨水和Triton X-100，兩者能夠溶解細(xì)胞膜而不破壞單分子層[15]。為了除去ECM中的細(xì)胞質(zhì)成分，還需要用到核酸酶(DNA酶和RNA酶)。也有研究表明使用不同的洗滌劑[12]，如脫氧膽酸鹽、十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)，或快速反復(fù)凍融[16-17]，可以有效脫去ECM中的細(xì)胞。

③ 鑒定。采用蛋白質(zhì)組學(xué)[3,18]進(jìn)行蛋白定性和定量檢測，PicoGreen DNA定量分析檢測遺留的DNA含量[17]。其他如掃描電鏡[19]、原子力顯微鏡[20]、免疫熒光染色[18]、免疫組織化學(xué)染色[21]等，用于觀察MSC-ECM的主要成分及表征。

2 MSC-ECM的應(yīng)用

MSC-ECM的作用主要集中在三個方面[22]：作為細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)；保護(hù)細(xì)胞不受外在培養(yǎng)因素的影響；作為可溶因子的載體或儲存器。MSC-ECM能夠促進(jìn)在其上面培養(yǎng)的細(xì)胞的增殖、生長以及定向分化[23]。

2.1 MSC-ECM促進(jìn)骨形成

MSC-ECM常與人工支架材料結(jié)合應(yīng)用，如可與膠原/羥磷灰石復(fù)合體組裝模仿“骨髓龕”[24]，結(jié)果顯示再細(xì)胞化MSCs的增殖速率和成骨分化潛能顯著提高。為了最大程度上減小免疫原性，有學(xué)者選擇利用化學(xué)試劑去除原有的支架材料，僅剩下3D結(jié)構(gòu)的ECM，體內(nèi)實驗證明了其免疫原性降低[25]。還有研究制備了不需要支架材料且完整保留ECM結(jié)構(gòu)和相關(guān)生長因子的成骨誘導(dǎo)MSC-ECM片層，并發(fā)現(xiàn)該片層中富含骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)與轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)等促進(jìn)骨缺損修復(fù)的細(xì)胞因子[26]。

MSC-ECM上培養(yǎng)的MSCs即使培養(yǎng)基中沒有成骨誘導(dǎo)的成分，依然可以向成骨分化，在大鼠皮下植入ECM和細(xì)胞的水凝膠，也發(fā)現(xiàn)骨形成、血管密度和細(xì)胞活性都有所增加[27]。甚至對于衰老的MSCs，在年輕MSC-ECM上培養(yǎng)也可以恢復(fù)其增殖和成骨活力[28]。另外，若在培養(yǎng)基中加入成骨誘導(dǎo)成分，獲得的MSC-ECM能夠促進(jìn)再細(xì)胞化細(xì)胞的成骨分化和生物礦化[29-30]。

2.2 MSC-ECM促進(jìn)軟骨形成

軟骨細(xì)胞在體外標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時易去分化[31]，而MSC-ECM能夠顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖速率并且維持軟骨細(xì)胞特性[32]，制備軟骨細(xì)胞/ECM復(fù)合體，體內(nèi)外實驗均證明其促進(jìn)軟骨形成的作用。研究表明，成纖維細(xì)胞來源的ECM會減少脂肪干細(xì)胞的增殖，但是可通過Notch1和β-catenin信號通路促進(jìn)其成軟骨分化并防止細(xì)胞衰老[33]。

然而與軟骨細(xì)胞來源的ECM相比，MSC-ECM的維持軟骨細(xì)胞形態(tài)和促進(jìn)軟骨形成能力相對較弱[34]。研究表明，即使培養(yǎng)基中沒有成軟骨誘導(dǎo)的相關(guān)因子存在，軟骨細(xì)胞來源的ECM仍然可以促進(jìn)MSC的成軟骨分化[35]，且可能是通過調(diào)控微環(huán)境中的BMP-2實現(xiàn)[36]。

2.3 三維培養(yǎng)與混合培養(yǎng)

MSC-ECM的組成由于對培養(yǎng)環(huán)境較為敏感而易被調(diào)控[37]，如轉(zhuǎn)染Notch1后有11種ECM蛋白會發(fā)生變化[15]，因此在培養(yǎng)產(chǎn)生ECM的步驟中添加特定成分或改變培養(yǎng)條件，可以得到預(yù)想的結(jié)果。通常獲得MSC-ECM的是單層結(jié)構(gòu)，對于臨床應(yīng)用來說厚度明顯不足，Lee等[38]采用纖連蛋白和明膠作為ECM內(nèi)核，一層層裹上人皮膚成纖維細(xì)胞后，用熱膨脹水凝膠構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)，然后改變溫度使之分離，獲得單純的三維細(xì)胞膜片，厚度可達(dá)78.8 μm。MSC通過三維培養(yǎng)，ECM蛋白(主要是Ⅰ型膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白)增多[39]。將ECM與3D打印支架結(jié)合，再細(xì)胞化后發(fā)現(xiàn)成骨相關(guān)基因runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2, Runx2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨鈣蛋白、骨橋蛋白是空白組的3～4倍[40]。

研究表明，多層細(xì)胞膜片結(jié)構(gòu)相比單層的細(xì)胞膜片在應(yīng)用治療時表現(xiàn)出更為強大的組織再生功能和更好的療效[41]。多種類型細(xì)胞混合培養(yǎng)是為了模擬組織內(nèi)復(fù)雜的細(xì)胞成分以及其分泌的ECM蛋白種類。脫細(xì)胞獲得ECM后，成骨細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)獲得的ECM相比單純成骨細(xì)胞ECM，擁有更強的促進(jìn)成骨分化能力[35]。

3 不同組織來源的MSC-ECM

間充質(zhì)干細(xì)胞可以從多種不同組織中提?。汗撬琛⒅?、真皮組織、牙體組織、外周血、滑膜組織、胚胎組織、羊水、胎盤、臍帶血等。其中脂肪組織中含量最高[42]，是骨髓的500倍[43]，且提取方法簡便，因此被認(rèn)為是比較理想的MSC來源。不同組織來源的MSC產(chǎn)生的ECM和基質(zhì)金屬蛋白酶的濃度和組成有所不同[44]，其再細(xì)胞化細(xì)胞的成骨、成軟骨分化能力也不同。

Choi等[45]的研究發(fā)現(xiàn)前成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞脫細(xì)胞后獲得的ECM表面纖維的形態(tài)和大小不同，再細(xì)胞化MSC后，前成骨細(xì)胞ECM上MSC成骨分化更多，后者成軟骨分化多。有趣的是，羊水和骨髓來源的MSC-ECM在成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)后脫細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在空的培養(yǎng)皿和ECM上的增殖、生長無差異，但是鈣含量在骨髓來源的MSC-ECM中最高[17]。

MSC可分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞[46]，除脂肪細(xì)胞外，都有制成細(xì)胞膜片后經(jīng)過脫細(xì)胞處理獲得ECM的報道，用于研究不同組織缺損修復(fù)。

4 MSC-ECM在口腔領(lǐng)域的應(yīng)用前景

MSC-ECM雖然目前仍處于基礎(chǔ)研究階段，其在口腔臨床卻有著廣闊的應(yīng)用前景，尤其是口腔種植和牙周領(lǐng)域。Takewaki等[47]制備了MSC/ECM復(fù)合體，體內(nèi)實驗驗證了其促進(jìn)牙周組織再生的能力。Lee等[48]用癌化的人牙周膜細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞，加上用于增加血供的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，與Malassez上皮剩余細(xì)胞促進(jìn)牙周組織再生，四種細(xì)胞形成單層或多層的膜片裹在種植體表面，結(jié)果顯示可以恢復(fù)牙周膜的部分形態(tài)和功能。ECM無細(xì)胞成分，免疫原性顯著小于常規(guī)種植體表面的細(xì)胞膜片，且儲存簡便，倫理限制也相對較小。若能夠解決粘附、固定問題，改進(jìn)表面成骨組分，可逐步投入商業(yè)化生產(chǎn)。另外，引導(dǎo)組織再生所使用的生物膜也可考慮應(yīng)用MSC-ECM。

當(dāng)然，MSC-ECM還需要更多基礎(chǔ)研究支持，ECM的有效成分及機制仍需明確，殘留脫細(xì)胞試劑問題、應(yīng)用于臨床消毒滅菌方式的選擇、減少ECM的異質(zhì)性、MSC的培養(yǎng)條件優(yōu)化、可注射的MSC-ECM水凝膠等都是未來的研究方向。

5 結(jié) 論

MSC-ECM因其獨特的生物機械和化學(xué)特性，能夠為體外細(xì)胞的粘附、增殖和分化提供一個適宜的微環(huán)境，成為細(xì)胞培養(yǎng)的平臺，也可以作為組織工程產(chǎn)品的起始材料，符合質(zhì)優(yōu)、安全和高效的治療原則。目前對于MSC-ECM的研究涉及不同領(lǐng)域不同方向，主要集中在促進(jìn)定向分化和性能改良上，未來有望成為組織工程學(xué)最常用的重要材料之一。