馬偉煜， 鄧志華

山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 消化內(nèi)科， 太原 030001

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種與自身免疫相關(guān)的慢性進行性肝內(nèi)膽汁淤積，標(biāo)志性血清學(xué)特征是抗線粒體抗體(AMA)的出現(xiàn)伴隨多克隆IgM和炎性細胞因子水平的升高(TNFα、IFNγ、IL-1和IL-6等)，PBC的病理學(xué)特征是以肝內(nèi)小膽管為中心的淋巴細胞浸潤[1]。PBC自身免疫反應(yīng)主要是以肝內(nèi)小膽管上皮細胞線粒體內(nèi)的丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基(pyruvate dehydrogenase complex-E2,PDC-E2)為抗原的免疫應(yīng)答的激活(T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫和B淋巴細胞介導(dǎo)的體液免疫)，這種免疫激活與基因表達密切相關(guān)。人類白細胞抗原(HLA)基因復(fù)合體是一組與免疫應(yīng)答相關(guān)的基因群，全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome wide association study, GWAS)[2-6]揭示了HLA Ⅱ類基因及非HLA基因與PBC患者T、B淋巴系統(tǒng)免疫激活的相關(guān)性。

1 PBC與HLA基因

HLA Ⅱ類基因位于染色體6p21，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮抗原提呈作用。歐洲、日本和中國的GWAS[2-5]證實了HLA II類基因與PBC顯著相關(guān)，尤以HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DQA1關(guān)系密切，其中HLA-DRB1最具基因多態(tài)性，按影響類型分為PBC風(fēng)險基因和保護基因，前者為：HLA-DRB1*08∶01、DRB1*08∶03、DRB1*04∶05，后者為HLA-DRB1*11∶01、DRB1*13∶02等。

風(fēng)險基因HLA-DRB1*08∶01與保護基因HLA-DRB1*11∶01是高度同源的等位基因，兩者區(qū)別是HLA-DRB1*0∶01分子缺乏β鏈57位點處的天冬氨酸殘基，這種缺乏導(dǎo)致HLA-抗原肽復(fù)合物不穩(wěn)定，造成抗原對T淋巴細胞的反復(fù)刺激出現(xiàn)T淋巴免疫系統(tǒng)的過度激活。Chow等[7]研究發(fā)現(xiàn)，具有HLA-DRB1*08∶01單倍型PBC患者的基因可結(jié)合PDC-E2肽序列中的三條肽鏈(PDC-E2145-159、PDC-E2249-263和PDC-E2629-643)，引發(fā)抗原提呈細胞與T淋巴細胞高親和力的免疫反應(yīng)，但具有HLA-DRB1*11∶01單倍型健康人與上述肽結(jié)合時無明顯免疫反應(yīng)，且其β57-59DEE序列賦予了HLA-抗原肽復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致免疫耐受以達到保護作用。

基于HLA Ⅱ類分子的α1和β1與外源性抗原肽的氨基酸殘基結(jié)合誘導(dǎo)T淋巴細胞免疫應(yīng)答。Umemura等[4]分析了日本PBC患者HLA-DRB1編碼的氨基酸殘基與PBC易感性的關(guān)系，結(jié)果顯示PBC患者HLA-DRB1*08∶03編碼的氨基酸以第13位甘氨酸、第16位酪氨酸和第74位亮氨酸多見，健康人群HLA-DRB1*11、DRB1*13編碼的氨基酸以第13位絲氨酸、第16位組氨酸和第47位苯丙氨酸多見，可能是基因編碼的氨基酸賦予了PBC的易感性。為了進一步闡明HLA Ⅱ類基因編碼的氨基酸與PBC的風(fēng)險關(guān)聯(lián)，Darlay等[8]對英國11 375例研究對象(2861例PBC患者和8514例健康對照者)的HLA基因和氨基酸多態(tài)性進行分析，發(fā)現(xiàn)PBC與氨基酸的關(guān)聯(lián)是由基因編碼的5個不同位置上氨基酸的變異所決定，并明確了HLA-DPβ1及其分子上氨基酸的變異是主要因素。按氨基酸變異與PBC的風(fēng)險相關(guān)程度由高到低排列如下：HLA-DPβ1 11L/G、HLA-DRβ1 74L、HLA-DQβ1 57D 、HLA-C 156R 、HLA-DQα1-13A。其中，HLA-DRβ1 74L變異發(fā)生在HLA-DRB1*08∶01(與歐洲PBC人群密切相關(guān))和HLA-DRB1*08∶03(與日本及中國PBC人群相關(guān))[2-4]，提示不同種族PBC人群HLA-DRB1*08的差異也與其編碼的氨基酸變異有關(guān)。這些氨基酸具體如何影響免疫系統(tǒng)，需要深入探討。

另外，HLA Ⅱ類基因編碼的氨基酸也與PBC特異性抗體有關(guān)，近期關(guān)于我國PBC患者自身抗體的GWAS研究[9]顯示，HLA-DRβ1-Asn77/ Arg74、DRβ1-Ser37和DPβ1-Lys65是抗sp100抗體產(chǎn)生的主要決定因素，并與風(fēng)險基因DRB1*03∶01相關(guān)性最強。這樣的相關(guān)性也表明了抗sp100抗體的產(chǎn)生是T淋巴細胞依賴的免疫應(yīng)答結(jié)果，而抗gp210與之無明顯關(guān)聯(lián)。

2 PBC與非HLA基因

六次大規(guī)模的GWAS鑒定了27個與PBC易感性相關(guān)的非HLA基因座[10]，并認為PBC的遺傳易感基因存在種族差異，但涉及的基因免疫途徑基本相同。與PBC相關(guān)的非HLA易感基因[10](IL-12A、IL-12RB2、STAT4、CD80、CD28/CTLA4、TNFSF15、IKFF3-ZPBP2-GSDMB、TNFRSF1A、NF-κB1、CXCR5、IL-21/IL-21R、TNFRSF1A和RPS6KA4等)主要參與針對自身抗原的T、B淋巴免疫系統(tǒng)的激活，進而產(chǎn)生TNFα、IFNγ、IL-2、IL-17、IL-21、IgM、AMA等炎性細胞因子和抗體，最終造成小膽管上皮細胞損傷及肝內(nèi)膽汁淤積。

2.1 IL-12途徑 IL-12途徑主要由IL-12及其受體和STAT4組成。IL-12是p35和p40亞基組成的異源二聚體，兩個亞基分別由IL-12A和IL-12B基因編碼；相應(yīng)的IL-12受體由IL-12RB1和IL-12RB2組成，分別由位于染色體19p13.1的IL-12RB1和1p31.2的IL-12RB2兩個基因編碼。STAT4由位于染色體2q32.2-32.3基因編碼，主要參與Th1/Th2細胞分化的調(diào)控。PBC相關(guān)IL-12具體途徑[11]為：PDC-E2抗原通過TLR激活抗原遞呈細胞，后者在磷酸化的干擾素調(diào)節(jié)因子5磷酸化后產(chǎn)生IL-12，IL-12通過結(jié)合CD4+T淋巴細胞表面的IL-12RB2受體，進而激活NF-κB和STAT4等信號因子，產(chǎn)生Th1炎性細胞因子(TNFα和IFNγ)的T淋巴細胞免疫應(yīng)答；其中IL-12RB2可被IFNγ上調(diào)作為IL-12的正反饋通路，加重膽管細胞的損傷。

GWAS證實了IL-12途徑與PBC相關(guān)的三個非HLA風(fēng)險基因是IL-12A、IL-12RB2和STAT4[12]。Li等[13]通過IL-12A的精細定位遺傳分析在PBC人群的調(diào)控機制，IL-12A 的SNP(rs4679868和rs6441286)是潛在的順式eQTL(數(shù)量性狀基因座)，該基因座通過上調(diào)IL-12A的表達刺激IL-12途徑，直接參與PBC的發(fā)生。Wasik等[14]的一項單中心研究發(fā)現(xiàn)，IL-12RB2的基因多態(tài)性與PBC相關(guān)，與健康人相比，PBC患者的IL-12RB2的SNP rs3790567等位基因A和rs6679356等位基因C在肝內(nèi)過表達，當(dāng)兩者共存時，肝硬化發(fā)生的風(fēng)險顯著增加。rs3790567等位基因還與AMA-M2有關(guān)，與GG純合子相比，rs3790567的AA純合子與AMA-M2的相關(guān)性更強、抗體滴度更高，這種相關(guān)性充分說明IL-12途徑激活的T淋巴免疫系統(tǒng)與B淋巴免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身抗體的必然聯(lián)系。Joshita等[15]也發(fā)現(xiàn)了日本PBC人群的三種STAT4 SNP(rs7574865、rs8179673和rs10181656)與抗核抗體(ANA)具有相關(guān)性，但分子免疫機制需要進一步探討。

2.2 CD28/CTLA4 細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA 4)基因位于2號染色體長臂33，編碼的蛋白質(zhì)分為膜性和可溶性CTLA 4，這兩種蛋白表達于活化的CD4+和CD8+T淋巴細胞表面，作為T淋巴細胞免疫應(yīng)答的負性調(diào)控因子。因此，CTLA 4基因異常導(dǎo)致CTLA 4蛋白的表達失衡，從而降低T淋巴細胞的免疫耐受性。Yang等[16]對PBC人群與CTLA 4基因多態(tài)性的Meta分析表明，CTLA 4 SNP rs231775和rs231725的多態(tài)性是PBC的危險因素，其中CTLA4上SNP rs231775 的GG、GA基因型以及G等位基因和rs231725 的AA、GA基因型以及A等位基因均與亞洲及高加索PBC人群顯著相關(guān)，這與Li等[17]和Eskandari-Nasab等[18]研究的CTLA 4基因與PBC相關(guān)性的Meta分析一致。

2.3 腫瘤壞死因子15(TNFSF15) TNFSF15也稱TL1A, 為位于染色體9q32的基因所編碼，與死亡受體3相互作用，并能與IL-12協(xié)同促進Th1、Th17細胞的極化。日本GWAS[19]結(jié)果顯示，TNFSF15在日本PBC人群的易感性最強，具有遺傳多態(tài)性。Hitomi等[20]通過1279例日本PBC人群的病例對照研究和體外功能分析顯示，TNFSF15啟動子區(qū)的功能性變體rs4979462與PBC相關(guān)，并與TNFSF15 mRNA表達水平有關(guān)，具體為通過結(jié)合核因子(NF-1)上調(diào)了TNFSF15的表達，從而增強T淋巴細胞的免疫應(yīng)答。Sun等[21]進一步對TNFSF15精細定位分析顯示，TNFSF15 rs4979462的T等位基因與PBC風(fēng)險增加顯著相關(guān)。

此外，TNFα信號通路對NF-κB通路的激活對PBC的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控起重要作用，歐洲GWAS[22]也確定了參與PBC的TNFα信號傳導(dǎo)途徑的3個易感基因，分別是TNFRSF1A、DENND1B和TNFAIP2，但是TNFSF15與此信號途徑無明顯相關(guān)。在PBC基因治療靶點方面，TNFSF15和NF-1可能成為治療PBC的潛在靶點，需深入研究具體靶向藥物及通路。

2.4 17q12-21區(qū)域 染色體17q12-21包括IKAROS家族鋅指3(IKZF3)、透明帶結(jié)合蛋白2(ZPBP2)、gasdermin-B(GSDMB)和ORM1樣蛋白3(ORMDL3)4種基因，其中IKZF3編碼Ikaros鋅指蛋白，作為轉(zhuǎn)錄因子對B淋巴細胞增殖和分化的調(diào)節(jié)起重要作用；GSDMB編碼含411個氨基酸的蛋白質(zhì)，在促進和維持上皮細胞的終末分化狀態(tài)起重要作用；ORMDL3編碼含153個氨基酸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，主要參與T淋巴細胞的活化；ZPBP2編碼透明帶結(jié)合蛋白，具體功能不詳。

該區(qū)域被日本GWAS[23]鑒定為日本PBC人群非HLA易感基因，其中ZPBP2基因的SNP rs11557467與PBC存在最強關(guān)聯(lián)。17q12-21區(qū)域具體如何影響PBC，Hitomi等[24]通過體外功能分析表明，在IKZF3與其上游GRB7之間的基因區(qū)域存在FOXO1蛋白，該蛋白的SNP rs12946510是該染色體增強子區(qū)域的功能變體，其T等位基因可破壞FOXO1的結(jié)合位點，降低ORMDL3和GSDMB的表達水平，導(dǎo)致Th2細胞因子(IL-4、IL-13)水平的降低，降低T淋巴細胞的免疫耐受進而賦予了PBC的易感性；相反，rs12946510的C等位基因可增強GSDMB和ORMDL3的表達，降低了PBC的發(fā)生，表明GSDMB和ORMDL3可能對PBC具有負性調(diào)控作用。

2.5 CXCR5、IL-21/IL-21R基因 濾泡輔助T淋巴細胞(Tfh)是一種具有特征性CXCR 5表達的CD4 T淋巴細胞亞群，在B淋巴細胞的激活和抗體的分泌中起重要作用。Tfh特異性基因CXCR5被歐洲GWAS鑒定為PBC易感性基因，Li等[25]在66例PBC人群的血液中發(fā)現(xiàn)，CXCR5+CD4+Tfh數(shù)量增加，并且與PBC嚴重程度顯著相關(guān)，具體機制可能是其通過接收來自CXCL13-CXCR5軸的趨化信號，并定位于B淋巴細胞進而促進自身抗體及炎性細胞因子的分泌。與此同時，他們還發(fā)現(xiàn)了CXCR5+CD4+Tfh細胞通過CD19+B淋巴細胞促進AMA的產(chǎn)生，且能誘導(dǎo)血清和肝內(nèi)IL-21水平的升高。

IL-21也與PBC密切相關(guān)，GWAS將IL-21和IL-21R確定為中國漢族PBC人群的易感基因位點。Qiu等[26]在PBC人群中發(fā)現(xiàn)了IL-21廣泛表達在門靜脈周圍和浸潤性炎癥細胞，IL-21R+廣泛表達在受損的小葉間膽管細胞周圍，并證實了IL-21/IL-21R通路活化，激活多個下游信號分子(STAT 1和STAT 3)，對T、B、NK細胞的增殖和分化起重要作用。同時，他們還確定了，IL-21的SNP rs925550、rs17005934和IL-21R的SNP rs2189521與PBC顯著相關(guān)。IL-21不僅受其基因多態(tài)性的影響，還與IL-12途徑相關(guān)聯(lián)，IL-12能促進IL-21的產(chǎn)生和IL-21+CD4 T淋巴細胞的增加，共同加重PBC小膽管的損傷。

2.6 NF-κB途徑 NF-κB是一個由Rel (cRel)、p65 (RelA, NF-κB3)、RelB、p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2) 五個亞單位組成的轉(zhuǎn)錄因子蛋白，能與DNA特定區(qū)域結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。NF-κB中的NF-κB1 / MANBA基因區(qū)域位于染色體4q24，與PBC密切相關(guān)。Hitomi等[27]在研究PBC的NFKB1/ MANBA區(qū)域的主要功能變體中指出，位于NF-κB1內(nèi)含子11上的SNP rs17032850和位于MANBA內(nèi)含子10上的rs227361是PBC的遺傳易感性基因的功能變體，分別與轉(zhuǎn)錄因子淋巴細胞增強因子和和抑制性轉(zhuǎn)錄因子視黃醇X受體α結(jié)合，從而上調(diào)NF-κB1和MANBA的轉(zhuǎn)錄及炎癥因子的釋放，參與了PBC的進展。

PBC風(fēng)險基因TNFRSF1A、CD80、RPS6KA4和PRKCB也參與了NF-κB途徑的活化[28]。其中，PRKCB最近被日本GWAS[29]鑒定為日本PBC人群的易感基因，具體的易感方式是位于PRKCB內(nèi)含子中的PRKCB rs35015313，通過調(diào)節(jié)B淋巴細胞抗原受體誘導(dǎo)NF-κB的活化從而影響PBC，但PRKCB的遺傳多態(tài)性未發(fā)現(xiàn)與PBC明顯相關(guān)，有待更加深入的探討。

3 治療

大量證據(jù)表明PBC的發(fā)生發(fā)展涉及多種免疫相關(guān)基因，這些基因主要參與T、B淋巴細胞系統(tǒng)驅(qū)動的肝內(nèi)小膽管破壞?，F(xiàn)階段PBC唯一被推薦的治療藥物是熊去氧膽酸(UDCA)，但超過30%的患者對UDCA治療不應(yīng)答，研究針對PBC免疫調(diào)控的藥物可能具有廣泛臨床治療前景[30]。目前調(diào)控免疫應(yīng)答的方法包括皮質(zhì)類固醇激素的免疫抑制以及針對T和B淋巴細胞的靶向免疫調(diào)控。

Rautiainen等[31]進行了一項為期3年的多中心隨機開放研究，將41例接受布地奈德(6 mg/d)聯(lián)合UDCA(15 mg/kg)的PBC患者與36例接受UDCA(15 mg/kg)的PBC患者比較，結(jié)果顯示，3年后前者ALP、ALT、GGT顯著改善(P值均<0.05)，且肝臟病理分期Ⅲ期PBC患者的肝纖維化下降25%；后者肝酶雖有所改善，但肝纖維化增加70%，說明布地奈德聯(lián)合UDCA在改善和穩(wěn)定PBC肝組織病理方面比單獨使用UDCA更有效，證實了皮質(zhì)類固醇激素布地奈德在PBC的治療地位，但需考慮到布地奈德的安全劑量及副作用，未來有可能將布地奈德與UDCA聯(lián)合作為PBC的二線治療方案。

與免疫抑制劑相比，生物制劑具有特異性免疫調(diào)控作用。目前針對PBC靶向免疫調(diào)控的生物制劑包括抗IL-12/23抗體(Ustekinumab)、CTLA-4 IgG(Abatacept)和抗CD20單克隆抗體(利妥昔單抗)。Ustekinumab是一種人免疫球蛋白IgG1 kappa單克隆抗體，與IL-12/23共有的p40蛋白亞基特異結(jié)合阻斷T淋巴細胞的激活。Hirschfield 等[32]對20例UDCA反應(yīng)欠佳的PBC患者在第0、4、12、20、28周皮下注射90 mg Ustekinumab，將治療反應(yīng)定義為ALP降低>40%，緩解定義為對于ALP在1.67×ULN～2.8×ULN的患者，ALP降至正常；對于ALP>2.8×ULN的患者，ALP降至<1.67×ULN即可達到緩解。結(jié)果顯示，第28周35%的患者ALP下降≥20%，且該藥物具有改善肝臟纖維化的作用，仍需要進一步研究用量、療程以及緩解標(biāo)準(zhǔn)，為Ustekinumab在PBC的治療提供有力的證據(jù)。

Abatacept是一種由CTLA-4的胞外結(jié)構(gòu)域和IgG1的Fc結(jié)構(gòu)域片段組成的重組融合蛋白，能特異性結(jié)合配體并下調(diào)CD28介導(dǎo)的T淋巴細胞免疫應(yīng)答。Bowlus等[33]一項為期24周的臨床開放研究，對16例UDCA治療欠佳的PBC患者皮下注射Abatacept 125 mg/周，結(jié)果顯示，在24周內(nèi)，外周血表達炎性趨化因子受體CCR5的CD4+T淋巴細胞頻率減低，表達穩(wěn)態(tài)趨化因子受體CCR7的CD4+T淋巴細胞頻率增加，表明Abatacept逆轉(zhuǎn)了PBC患者的T淋巴系統(tǒng)免疫異常。

利妥昔單抗是針對B淋巴細胞表面CD20抗原的鼠-人嵌合單抗，具有靶向消耗B淋巴細胞的作用。Myers等[34]對14例PBC患者在第1天和第15天靜脈輸注利妥昔單抗(1000 mg)，并隨訪72周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療后1周的所有患者B淋巴細胞顯著減低，血清IgM和AMA在第6個月時明顯下降，分別是3.6 g/L降至2.1 g/L和1∶320降至1∶80。23%的患者在第18個月時，ALP恢復(fù)正常或下降幅度≥25%，60%的患者在12個月內(nèi)瘙癢得到改善，說明選擇性消耗B淋巴細胞可導(dǎo)致自身抗體產(chǎn)生減少而減弱自身膽管上皮細胞的破壞。

4 總結(jié)與展望

目前免疫抑制劑和生物制劑在PBC的應(yīng)用仍處在臨床試驗階段。具有治療前景的生物制劑的靶向療效除與分子免疫機制有關(guān)外，給藥方式、給藥時間、療程及判斷療效的標(biāo)準(zhǔn)也是重要的療效影響因素。既然PBC是自身免疫性疾病，探討PBC的分子免疫病理并研發(fā)針對免疫異常的靶向藥物是PBC取得個體化治療良好結(jié)局的基石。