黃菲菲，張 陽(yáng)，汪 洋，李先根，王秀英，朱惠玲，劉玉蘭，肖 勘

（武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023）

腸道不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場(chǎng)所，也是重要的免疫器官，能夠抵御外來(lái)病原入侵[1]。應(yīng)激會(huì)造成腸道屏障功能障礙，導(dǎo)致腸道通透性增加并引起黏膜損傷[2]。腸道損傷后的修復(fù)包括上皮細(xì)胞的增殖、分化、成熟和遷移等復(fù)雜過(guò)程[3]。Xu 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）信號(hào)通路在腸黏膜損傷的修復(fù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

TGF-β是一類(lèi)多肽細(xì)胞因子超家族，包括TGFβs、活化素和抑制素等[5]，其中TGF-βs 最受關(guān)注。哺乳動(dòng)物基因組可編碼3 種不同的TGF-β亞型，即TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3[6]，其中TGF-β1 在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的比例最高，且能參與細(xì)胞的創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程[7-8]。TGF-β1 信號(hào)通路主要由Smads 分子介導(dǎo)[9]。Smads 蛋白接受信息并傳遞至胞內(nèi)，發(fā)揮其信號(hào)傳導(dǎo)作用[10]。Smads 蛋白分為受體激活型Smad（R-Smad，包括Smad2 和Smad3）、共介導(dǎo)型Smad（Co-Smad）和抑制型Smad（I-Smad，主要有Smad7）3 種。TGF-β1 能夠促進(jìn)傷口愈合[11]，還與仔豬斷奶應(yīng)激后腸道屏障功能的恢復(fù)有關(guān)，在TNF-α刺激后，TGF-β1 通過(guò)激活Smad 和MAPK 信號(hào)通路保護(hù)腸道完整性[12-13]?，F(xiàn)階段尚無(wú)與TGF-β1 及Smads 信號(hào)通路在仔豬腸道損傷后的作用時(shí)期和修復(fù)機(jī)制相關(guān)的報(bào)道。

本研究以脂多糖（LPS）構(gòu)建腸道損傷模型，探究LPS 刺激后不同時(shí)間點(diǎn)，腸道損傷修復(fù)中的關(guān)鍵因子TGF-β1 以及Smads 信號(hào)通路的動(dòng)態(tài)變化，為營(yíng)養(yǎng)調(diào)控腸道損傷修復(fù)尋找合適的時(shí)間點(diǎn)和調(diào)控靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑 LPS：大腸桿菌血清型O55:B5（購(gòu)于Sigma 公司）；RNA 提取所用TRIzol 試劑、反轉(zhuǎn)錄所用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒以及實(shí)時(shí)定量PCR 所用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 試劑盒均由寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司（TaKaRa 中國(guó)）提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取42 頭體重（7.09±0.9）kg 的21 日齡杜×長(zhǎng)×大斷奶仔豬（斷奶仔豬由湖北奧登農(nóng)牧科技有限公司提供），按注射LPS 后時(shí)間點(diǎn)（注射LPS 之前和注射LPS 后1、2、4、8、12、24 h）隨機(jī)分成7個(gè)處理，每個(gè)處理6 頭豬。日糧配方參照 NRC（1998）進(jìn)行配制，日糧原料組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 樣品采集 預(yù)試14 d 后，LPS 刺激組腹膜注射100 μg/kg體重（BW）的LPS，分別在注射LPS 之前（0 h）和注射LPS 后1、2、4、8、12、24 h 屠宰仔豬，剪取回腸和結(jié)腸腸段，剪開(kāi)并棄除內(nèi)容物，生理鹽水沖洗，除去腸系膜及表面脂質(zhì)后置于速凍管，在液氮中速凍，再轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中儲(chǔ)存待測(cè)。

1.4 mRNA 表達(dá)量測(cè)定

1.4.1 總RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 將回腸和結(jié)腸樣品研磨，參照陳逢[14]的方法提取總RNA，根據(jù)Prime Script RT reagent kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI 已知的豬TGF-β1、TGF-β1受體1（TGF-βR1）、TGF-βR2以及其下游Smads 信號(hào)通路上的關(guān)鍵信號(hào)因子Smad2、Smad3、共介導(dǎo)分子Smad4和抑制性分子Smad7基因序列，利用Primer Premier 6.0 設(shè)計(jì)引物，并由武漢擎科生物科技有限公司合成，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

1.4.3 實(shí)時(shí)定量PCR 以回腸和結(jié)腸的cDNA 為模板，運(yùn)用Real-time PCR 試劑盒，測(cè)定目的基因的mRNA表達(dá)量。數(shù)據(jù)分析以GAPDH為內(nèi)參，采用Livak 等[15]的2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，1、2、4、8、12、24 h 分別與0 h 比較，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P≤0.05 為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，0.05＜P≤0.10 為具有顯著性趨勢(shì)。

2 結(jié)果

2.1 LPS 刺激后不同時(shí)間點(diǎn)斷奶仔豬回腸TGF-β1以及Smads 信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA 表達(dá)情況 如表3 所示，LPS 刺激后，回腸中的TGF-β1的基因表達(dá)在2 h迅速上升，2、4 h 均顯著升高，至24 h 達(dá)到峰值（P＜0.01）；TGF-βR1、TGF-βR2雖然在1～12 h 無(wú)顯著變化，但在24 h 時(shí)極顯著升高；下游關(guān)鍵因子Smad2在1、4、12 h均顯著上升，并在24 h 到達(dá)峰值（P＜0.01），Smad3在24 h 到達(dá)峰值（P＜0.01），共介導(dǎo)分子Smad4的mRNA表達(dá)量在24 h 也顯著上升；同時(shí)，TGF-β1 信號(hào)通路的抑制性分子Smad7的mRNA 表達(dá)量也在2、8 h 顯著上升，且在24 h 達(dá)到峰值（P＜0.01）。

2.2 LPS 刺激后不同時(shí)間點(diǎn)斷奶仔豬結(jié)腸TGF-β1以及Smads 信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA 表達(dá)情況 如表4 所示，LPS 刺激后，結(jié)腸中的TGF-β1及其受體TGF-βR1、TGF-βR2的mRNA 表達(dá)量在1～8 h 無(wú)顯著變化，但是TGF-β1及其受體TGF-βR1在24 h 顯著上升，TGF-βR2在12 h 時(shí)顯著上升；Smad2、Smad4以及Smad7的mRNA 表達(dá)量在刺激后1～12 h 無(wú)顯著性變化，在24 h時(shí)顯著上升，而Smad3 的mRNA 表達(dá)量在8 h 顯著升高，表明TGF-β1以及Smads 信號(hào)通路在結(jié)腸中被激活，但激活時(shí)間滯后于回腸。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物信息

表3 脂多糖刺激后不同時(shí)間點(diǎn)斷奶仔豬回腸TGF-β1/Smads 信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA 表達(dá)變化

表4 脂多糖刺激后不同時(shí)間點(diǎn)斷奶仔豬結(jié)腸TGF-β1/Smads 信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA 表達(dá)變化

3 討 論

腸道作為機(jī)體重要的消化吸收?qǐng)鏊兔庖咂鞴?，是機(jī)體抵御內(nèi)源性和外源性致病菌入侵的重要防線。腸道形態(tài)和功能的完整性在機(jī)體病理生理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。正常狀態(tài)下，腸道的上皮屏障能夠阻擋腸腔內(nèi)的有害微生物和代謝產(chǎn)物進(jìn)入體內(nèi)，但受到應(yīng)激時(shí)，腸道也最容易受到影響，環(huán)境溫度、營(yíng)養(yǎng)因素、細(xì)菌感染等諸多因素都會(huì)導(dǎo)致腸道損傷[2]。LPS 主要存在于革蘭氏陰性菌，可通過(guò)激活機(jī)體的免疫細(xì)胞引起炎癥信號(hào)通路激活，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1 等產(chǎn)生，造成腸道損傷[16]。劉玉蘭等[17]研究表明，LPS 能夠引起腸道損傷。因此，LPS 常被用以構(gòu)建腸道損傷模型。

腸道損傷后的修復(fù)過(guò)程是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。TGF-β1 屬于多肽類(lèi)細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)功能，它可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、增殖、遷移和凋亡，參與細(xì)胞外基質(zhì)的形成、創(chuàng)傷修復(fù)、免疫調(diào)控等生理調(diào)節(jié)過(guò)程[18-19]。Mei 等[20]研究仔豬斷奶時(shí)空腸和回腸TGF-β1 表達(dá)和分布的瞬時(shí)變化，推測(cè)TGF-β1 在腸道結(jié)構(gòu)的修復(fù)中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。在本研究中，仔豬回腸中的TGF-β1、Smad2、Smad7基因在LPS 刺激2 h 后迅速激活，且與TGF-βR1、TGF-βR2、Smad3、Smad4一起在刺激后24 h 達(dá)到峰值，表明該通路在此時(shí)全部激活，腸道的修復(fù)過(guò)程也同時(shí)啟動(dòng)。同時(shí)抑制性Smad7 也在24 h 達(dá)到頂峰，表明此時(shí)Smads 信號(hào)通路全面參與損傷后的修復(fù)，這可能與Smads 信號(hào)的反饋調(diào)節(jié)有關(guān)，防止TGF-β1 信號(hào)過(guò)度激活。Dignass[21]和Margadant 等[22]也發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 在調(diào)節(jié)腸黏膜細(xì)胞遷移、增殖、分化以及上皮細(xì)胞的恢復(fù)中具有重要的調(diào)節(jié)作用。Howe 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，T84 細(xì)胞跨膜電阻在TGF-β1 處理16 h 后顯著升高，并在處理72 h 后到達(dá)峰值，在修復(fù)腸道屏障功能中發(fā)揮重要作用。汪洋[24]研究發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激后，空腸絨毛在1 h 出現(xiàn)萎縮，絨毛高度在4～12 h 顯著降低，絨毛深度在2～12 h 顯著降低，且空腸絨毛的形態(tài)在24 h 時(shí)逐漸恢復(fù)，這表明TGFβ-1信號(hào)通路與腸道形態(tài)有相關(guān)性。同時(shí)LPS 刺激導(dǎo)致空腸炎性細(xì)胞因子（如TNF-α）的mRNA 表達(dá)量在1～2 h顯著升高并達(dá)到峰值，隨后逐漸下降恢復(fù)，這與本研究中回腸TGF-β1/Smads 信號(hào)通路相關(guān)基因的變化趨勢(shì)相一致，說(shuō)明腸道修復(fù)的時(shí)間與炎性因子的釋放是同步的。

本研究還發(fā)現(xiàn)，仔豬結(jié)腸中的TGF-βR2、Smad3基因在LPS 刺激12 h 后迅速激活，且與TGF-β1、TGFβR1、Smad2、Smad4、Smad7一起在刺激后24 h 達(dá)到峰值，表明結(jié)腸的TGF-β1/Smads 信號(hào)通路在LPS 刺激損傷腸道后全面激活，參與腸道的損傷修復(fù)過(guò)程。但是結(jié)腸TGF-β1/Smads 信號(hào)通路激活時(shí)間滯后于回腸的激活時(shí)間。在小鼠模型上得出的結(jié)果與本試驗(yàn)類(lèi)似。D'Arpino 等[25]使用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的小鼠糖尿病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)TGF-β1/Smad 是糖尿病結(jié)腸組織重塑的關(guān)鍵成分。Hering 等[26]使用HT-29/B6 細(xì)胞模型，研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1 通過(guò)增強(qiáng)claudin-4 的蛋白水平，從而產(chǎn)生屏障保護(hù)作用。本研究中回腸在2 h 就有TGF-β1/Smads 信號(hào)通路中關(guān)鍵基因TGF-β1被激活，而結(jié)腸直到8 h 才有Smad3基因被激活，TGF-β1更是在24 h 才有所增加，這表明結(jié)腸TGF-β1/Smads 信號(hào)通路的激活時(shí)間滯后于回腸，推測(cè)這可能與腸段的特異性有關(guān)，但是具體原因還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS 刺激后會(huì)造成腸道受損，同時(shí)腸道損傷修復(fù)機(jī)制也立即啟動(dòng)，其關(guān)鍵修復(fù)因子TGF-β1 及其相關(guān)的Smads 信號(hào)通路迅速激活，從而參與腸道損傷后的修復(fù)過(guò)程。