丁 艷，朱蘭保，盛 蒂，常曉梅

(蚌埠學(xué)院土木與水利水電工程學(xué)院，安徽 蚌埠，233000)

水稻是重要糧食作物之一，全球約有50%以上的人口以稻米為主食[1]。水稻的生長(zhǎng)過(guò)程中，磷肥是不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素，磷可增強(qiáng)植株體內(nèi)活力，促進(jìn)養(yǎng)分合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，增強(qiáng)光合作用，延長(zhǎng)葉的功能期，有益于水稻增產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)[2,3]。磷素供應(yīng)不足會(huì)影響水稻的正常生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而影響其產(chǎn)量和品質(zhì)[4,5]。

有研究表明，在低磷條件下，作物會(huì)從形態(tài)和生理等方面做出一些適應(yīng)性反應(yīng)，以適應(yīng)低磷環(huán)境[6～8]。劉文菊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型水稻在磷脅迫下其根系形態(tài)發(fā)生了明顯變化，如根長(zhǎng)、根冠比均呈增加趨勢(shì)。在低磷條件下，水稻植株分蘗數(shù)增減少，且每株根系相互之間有橫向交織生長(zhǎng)現(xiàn)象[10]。推測(cè)水稻在低磷處理下根系可能會(huì)通過(guò)橫向生長(zhǎng)來(lái)擴(kuò)大與培養(yǎng)液的接觸面積，從而增加對(duì)磷的吸收。此外，磷脅迫下水稻可通過(guò)提高根系A(chǔ)Pase 活性增強(qiáng)對(duì)磷脅迫環(huán)境的適應(yīng)性[11]。綜上所述，有關(guān)水稻對(duì)低磷脅迫的適應(yīng)機(jī)制的研究，大多集中在苗期根系的適應(yīng)性機(jī)制，針對(duì)水稻地上部組織在形態(tài)和生理等方面對(duì)缺磷的適應(yīng)性反應(yīng)的報(bào)道較少。本次研究是在前期研究的基礎(chǔ)上，選取3種不同基因型水稻為研究對(duì)象，采用全營(yíng)養(yǎng)液和低磷營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)水稻幼苗，以植株表型、根系形態(tài)、生物量及根系分泌物(APaes，H+)等為參數(shù)，分析低磷脅迫對(duì)水稻生長(zhǎng)的影響，以及水稻對(duì)低磷的適應(yīng)性反應(yīng)，旨在為進(jìn)一步從分子水平上闡明水稻對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用鄭旱6號(hào)(ZH6，耐低磷基因型)、通粳981(TJ981，磷敏感基因型)和鎮(zhèn)稻99(ZD99，根系擴(kuò)展型)3種不同基因型水稻品種為試驗(yàn)材料，供試水稻種子由江蘇潤(rùn)揚(yáng)種業(yè)股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇籽粒飽滿的水稻種子，浸入100 mL/L H2O2溶液中消毒30 min，用去離子水反復(fù)沖洗后，放入盛有適量去離子水的培養(yǎng)皿(17 cm)中，催芽。待種子露白時(shí)，挑選發(fā)芽勢(shì)一致的種子放入96孔板置于塑料容器內(nèi)，采用國(guó)際水稻研究所(International Rice Research Institute, IRRI)完全培養(yǎng)液培養(yǎng)[12]。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至3葉期時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)健壯的幼苗進(jìn)行分組培養(yǎng)，即正常營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)(記為：+P)和低磷營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)(記為：-P)，且c(+P)∶c(-P)= 25∶1。每個(gè)處理選擇4株生長(zhǎng)健壯且長(zhǎng)勢(shì)基本一致的幼苗，每個(gè)處理設(shè)置10個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用泡沫板固定后置于12 L黑色塑料桶中，放置于塑料大棚中。自然光照和溫度條件下，分別用正常供磷和缺磷培養(yǎng)液進(jìn)行全生育期培養(yǎng)。幼苗生長(zhǎng)期，每3 d更換1次培養(yǎng)液，拔節(jié)至成熟期，每5 d更換1次培養(yǎng)液。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1根系形態(tài)掃描 分別挑選正常供磷和低磷處理的水稻植株各20株，用去離子水反復(fù)沖洗根部后，利用植物根系掃描與分析系統(tǒng)(型號(hào)：WinRHIZO，生產(chǎn)商：上海臨嘉科教儀器有限公司生產(chǎn))掃描根系并進(jìn)行分析。

1.3.2生物量、葉綠素含量及根系活力的測(cè)定 選擇低磷處理15 d的水稻植株，每個(gè)處理分別取20株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，用去離子水反復(fù)沖洗根系和葉片表面，吸水紙吸干其表面水分，稱其地上部和根部的鮮質(zhì)量，后置于烘箱中，105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒質(zhì)量，再次稱量地上部和根部的質(zhì)量。采用差減法計(jì)算單株相對(duì)含水率，地上部(或根部)干物質(zhì)質(zhì)量及根冠比等參數(shù)。采用分光光度法測(cè)定葉片中葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；TTC還原法測(cè)定根系活力。

1.3.3根系分泌酸性磷酸酶活性的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行，略有改動(dòng)。取生長(zhǎng)健壯的水稻幼苗2株，用去離子水沖洗干凈根系，置于含有100 mL摩爾濃度為1 mmol/L對(duì)硝基酚磷酸二鈉(p-NPP)培養(yǎng)液的錐形瓶中，錐形瓶用黑色薄膜包裹，正常光照培養(yǎng)2 h后，吸取1 mL反應(yīng)液加入到含有5 mL摩爾濃度為1 mol/L NaOH的試管中，搖勻。以無(wú)酶反應(yīng)為空白對(duì)照，450 nm處測(cè)定吸光度值。根系分泌酸性磷酸酶活性以單位時(shí)間單位質(zhì)量鮮根水解p-NPP生成p-NP的量來(lái)表示(單位：mg·(h·g)-1)。

1.3.4根際或根表pH值的顯色觀察-瓊脂糖凝膠法 稱取1.5 g瓊脂糖分別溶于150 mL正常供磷(+P)和缺磷(-P)培養(yǎng)液(pH 5.4)中，于微波爐中溶解，取出后冷卻至40～50 ℃時(shí)，加入甲基紅和溴甲酚綠混合酸-堿指示劑，使混合酸-堿指示劑的終質(zhì)量濃度為0.06 g/L，繼續(xù)冷卻至室溫，并分裝于25 mL玻璃試管中。分別選擇萌發(fā)后(帶胚乳)和低磷處理3 d后(去胚乳)長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，植入裝有10 g/L瓊脂糖的試管中，自然光溫條件下生長(zhǎng)，分別在其生長(zhǎng)24，48，72 h后觀察瓊脂糖的顏色變化[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低磷對(duì)水稻植株表型和根系形態(tài)的影響

與正常供磷水稻相比，磷素供應(yīng)不足導(dǎo)致水稻植株表現(xiàn)出顯著的表型差異(圖1(A))。主要表現(xiàn)為：地上部生長(zhǎng)緩慢，植株矮小，葉面積減小；分蘗期延遲且分蘗數(shù)減少。此外，低磷導(dǎo)致根系形態(tài)發(fā)生變化：磷敏感型品種TJ981根長(zhǎng)增加明顯(1.37倍)，且增長(zhǎng)幅度高于耐低磷品種ZH6(1.15倍)和磷高效吸收型品種ZD99(1.31倍)；而ZH6和ZD99根平均直徑(1.13 倍和1.25倍)和根表面積(1.45倍和1.82倍)增加幅度均大于TJ981(1.07倍和0.83倍)(圖2)。

低磷處理的不同基因型水稻，其主根長(zhǎng)度均較正常供磷水稻主根長(zhǎng)明顯增長(zhǎng)，尤其磷敏感型水稻品種TJ981主根長(zhǎng)度增長(zhǎng)較顯著(1.67倍)，其次是ZD99(1.57倍)，而耐低磷水稻品種ZH6主根長(zhǎng)增幅較小(1.41倍)(圖3)。由此可見(jiàn)，磷脅迫導(dǎo)致水稻根系增長(zhǎng)，且磷敏感基因型水稻TJ981根系增長(zhǎng)幅度顯著高于ZD99和ZH6。也就是說(shuō)，根系形態(tài)變化是水稻對(duì)低磷脅迫的一種適應(yīng)性響應(yīng)，即低磷時(shí)水稻通過(guò)改變根系形態(tài)，增加與土壤的接觸面積，從而提高其對(duì)土壤中磷的吸收和利用。

與對(duì)照相比，低磷處理使3種不同基因型水稻分蘗期葉片的長(zhǎng)度和寬度均呈減小趨勢(shì)(圖3)。其中，低磷處理葉片與對(duì)照葉片長(zhǎng)度比率分別為ZH6(0.899)，TJ981(0.929)，ZD99(0.799)；葉片寬度比率的變化表現(xiàn)為ZH6(0.922)，TJ981(0.843), ZD99(0.810)。本次研究結(jié)果可知，低磷脅迫導(dǎo)致水稻開(kāi)花期較正常供磷水稻延遲，穗形偏小且每株穗數(shù)和每穗粒數(shù)減少(圖1(B))。這是由于磷素匱乏致使水稻植株葉片的長(zhǎng)度和寬度均減小，光合速率下降，光合產(chǎn)物積累量減少，進(jìn)而影響水稻的產(chǎn)量。

2.2 低磷對(duì)水稻幼苗相對(duì)含水率和干物質(zhì)量的影響

本次研究結(jié)果顯示，缺磷水稻幼苗相對(duì)含水率下降，以ZH6植株含水率下降較大(圖4(A))；根部干質(zhì)量增加(圖4(B))，與TJ981和ZD99相比，ZH6根部干質(zhì)量增加較多。3個(gè)不同基因型水稻植株根冠比變化由大到小依次為：ZH6，ZD99，TJ981(圖4(D))。這是由于低磷導(dǎo)致水稻幼苗地上部生長(zhǎng)受阻(圖4(C))，而根系為了增加與土壤的接觸面獲取更多的營(yíng)養(yǎng)，從而改變其形態(tài)。

2.3 低磷對(duì)水稻葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

低磷條件下，水稻植株分蘗期葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較對(duì)照發(fā)生變化，其中TJ981和ZH6葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，而ZD99葉片中葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)(圖5(A))；進(jìn)入孕穗期以后，與分蘗期相比較，ZH6和TJ981植株葉片的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均下降，ZD99變化不明顯；與對(duì)照相比，3種不同基因型水稻葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均表現(xiàn)為下降(圖5(B))?？梢?jiàn)，隨著低磷處理時(shí)間的延長(zhǎng)，水稻葉片中葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。

圖1 低磷處理?xiàng)l件下，不同基因型水稻幼苗表型(A)分蘗期；(B)抽穗、灌漿期

圖2 低磷處理2周后水稻根系形態(tài)指標(biāo)的變化

圖3 水稻分蘗期的主根長(zhǎng)及葉片變化

2.4 低磷處理對(duì)水稻幼苗根系活力的影響

低磷處理不同基因型水稻幼苗15 d后，其根系活力均呈下降的趨勢(shì)(圖6)。即低磷脅迫下磷敏感型品種TJ981，根系擴(kuò)展型ZD99和耐低磷品種ZH6根系活力有不同程度的下降，其中ZH6和ZD99根系活力呈顯著下降(p<0.05)，根系活力下降率分別為42.01%和19.70%，而TJ981根系活力呈極顯著下降(p<0.01)。這表明低磷脅迫影響水稻根系的活力水平，且TJ981較其它2種基因型水稻根系活力下降幅度大(下降率為51.48%)，可見(jiàn)磷敏感型水稻TJ981對(duì)低磷的適應(yīng)能力弱。

圖4 低磷處理(3周)水稻植株生物量的變化(A)：相對(duì)含水率；(B)：根部干質(zhì)量；(C)：地上部干質(zhì)量；(D)：根冠比

圖5 葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化(A)：分蘗期；(B)：孕穗期注：*和**分別代表p<0.05和p<0.01，下同。

2.5 低磷處理對(duì)水稻幼苗根系分泌酸性磷酸酶(APase)活性的影響

低磷處理3種不同基因型水稻幼苗1，8，15 d后，其根系分泌的酸性磷酸酶活性均高于對(duì)照，但不同基因型水稻幼苗根系分泌的磷酸酶活性增長(zhǎng)表現(xiàn)不一(圖7)。其中：耐低磷品種ZH6低磷處理1 d時(shí)，根系分泌的酸性磷酸酶活性較對(duì)照增強(qiáng)52.7%；低磷處理8 d和15 d時(shí)，其活性增長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，增幅分別為9.1%和9.7%。ZD99根系分泌酸性磷酸酶的活性隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，分別為5.5%，26.0%和40.1%；而磷敏感性品種TJ981隨低磷處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其根系分泌酸性磷酸酶的活性增強(qiáng)相對(duì)穩(wěn)定，增幅分別為12.5%，11.0%和11.6%(圖7)?？梢?jiàn)低磷脅迫使不同基因型水稻根系分泌酸性磷酸酶活性增強(qiáng)。

圖6 低磷條件下水稻根系活力的變化

圖7 低磷條件下水稻根系A(chǔ)Pase活性的變化

2.6 低磷處理對(duì)水稻幼苗根際或根表pH的影響

本次試驗(yàn)以耐低磷品種ZH6為例，采用10 g/L 瓊脂糖凝膠觀察根系分泌酸的變化。主要原理是：甲基紅-溴甲酚綠酸堿混合指示劑的變色點(diǎn)為 5.1，pH > 5.1 呈綠色，pH < 5.1 呈酒紅色。與對(duì)照相比，缺磷水稻幼苗根系分泌酸使瓊脂糖變紅色，而且隨著處理時(shí)間(24，48，72 h)的延長(zhǎng)，瓊脂糖的紅色加深，這表明磷脅迫促進(jìn)了根系分泌酸的增多(圖8)。同時(shí)，在幼苗移植時(shí)采用帶胚乳(圖8(A))和去胚乳(圖8(B))2種情況進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，同樣低磷處理48 h，移植時(shí)帶胚乳的幼苗根系比去胚乳的幼苗根系分泌的酸量多，即帶胚乳幼苗根系分泌酸使瓊脂糖呈較深的紅色。這表明幼苗生長(zhǎng)前期胚乳可以提供部分營(yíng)養(yǎng)供其生長(zhǎng)發(fā)育所需，在沒(méi)有胚乳營(yíng)養(yǎng)的條件下，幼苗生長(zhǎng)力減弱，分泌酸減少。但相比于對(duì)照，低磷處理的根系分泌酸量增加，瓊脂糖紅色明顯。

圖8 低磷對(duì)ZH6幼苗根系分泌酸的影響(A)萌發(fā)后帶有胚乳植入；(B)：萌發(fā)后去胚乳植入

3 討論與結(jié)論

水稻是對(duì)磷營(yíng)養(yǎng)較敏感的作物。低磷脅迫下，為了適應(yīng)逆境條件水稻會(huì)產(chǎn)生一系列的適應(yīng)性響應(yīng)。黃榮等[14]研究表明，缺磷會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育且產(chǎn)生相應(yīng)的癥狀，如植株生長(zhǎng)遲緩、矮小、分枝數(shù)減少。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，低磷脅迫會(huì)使水稻植株矮小、葉小、分枝、分蘗減少，這是由于低磷影響植株體內(nèi)核蛋白的形成，從而抑制細(xì)胞分裂與增殖，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)發(fā)育延緩[15]。根系是最先感受養(yǎng)分脅迫信號(hào)并對(duì)這一逆境信號(hào)加工、處理和傳遞[4]，其形態(tài)變化是水稻適應(yīng)低磷脅迫的機(jī)制之一，如主根增長(zhǎng)，側(cè)根數(shù)目增多，根表面積增大[16]。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，低磷處理水稻幼苗2周后，耐低磷水稻品種鄭旱6號(hào)在低磷條件下其根系長(zhǎng)度變化不明顯，但其平均直徑和根面積均呈增加趨勢(shì)；而磷敏感型品種通粳981根系增長(zhǎng)、根平均直徑和根面積減小，根系呈細(xì)長(zhǎng)型(圖2)。因此，由于缺磷改變根系形態(tài)并使其根質(zhì)量增加，從而促進(jìn)根冠比增大。此外，低磷條件下，分蘗期水稻根長(zhǎng)顯著增長(zhǎng)。鄭旱6號(hào)，通粳981和鎮(zhèn)稻99的根長(zhǎng)增幅分別為對(duì)照的1.4，1.7和1.6倍?？梢?jiàn)低磷脅迫時(shí)水稻可以通過(guò)增加根系長(zhǎng)度，增大根表面積等，擴(kuò)大與土壤的接觸面積，進(jìn)而增加對(duì)磷素的吸收和利用效率，滿足自身生長(zhǎng)所需的磷營(yíng)養(yǎng)[17]。

低磷脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生一系列的生理生化反應(yīng)以調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，低磷處理水稻幼苗，使其葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在分蘗期和孕穗期表現(xiàn)不一。其中，鄭旱6號(hào)和通粳981葉片中葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增后減，鎮(zhèn)稻99葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在分蘗期和孕穗期均減少。這是因?yàn)殡S著低磷處理水稻時(shí)間的延長(zhǎng)，低磷限制了葉綠素的合成使其含量降低。此外，低磷水稻抽穗期延遲，且每株穗數(shù)及穗粒數(shù)減少，這是由于低磷水稻葉片中葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的減少，減弱了水稻植株的光合能力，影響光合產(chǎn)物的形成和積累，進(jìn)一步降低了水稻的產(chǎn)量。

在生理學(xué)上，植物可以通過(guò)根分泌酸性磷酸酶(APase)活性的提高和小分子量有機(jī)酸的增加，從而減小根際的pH。APase是一種誘導(dǎo)酶，當(dāng)磷是植物生長(zhǎng)的主要限制因子時(shí)，植物根系就向胞外分泌酸性磷酸酶，增加對(duì)土壤有機(jī)磷的水解[6]，其活性受植物供磷狀況的影響，低磷能誘導(dǎo)根系A(chǔ)Pase活性顯著升高[11]。本次試驗(yàn)結(jié)果也顯示，低磷處理3種不同基因型水稻根系分泌酸性磷酸酶活性均有不同程度的提高。根際酸化是植物，特別是雙子葉植物，應(yīng)對(duì)低磷脅迫的一種響應(yīng)。本次研究發(fā)現(xiàn)，低磷促使水稻根系分泌酸增多，根系分泌的有機(jī)酸與難溶性磷酸鹽進(jìn)行陰離子交換或競(jìng)爭(zhēng)性吸附，以釋放或溶解難溶性磷酸鹽，從而提高磷的利用率。