顏春魯， 安方玉， 蔣國鳳， 趙崇博， 李嘉進， 李孟翰， 郭 丹

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學 中西醫(yī)結(jié)合學院， 蘭州 730000； 2. 甘肅中醫(yī)藥大學 教學實驗實訓中心， 蘭州 730000；3. 甘肅中醫(yī)藥大學 臨床醫(yī)學院，蘭州730000； 4. 甘肅中醫(yī)藥大學 中醫(yī)臨床學院， 蘭州 730000)

現(xiàn)代醫(yī)學認為，膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)是一種涉及膝關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨并形成關(guān)節(jié)軟骨骨贅的慢性退行性關(guān)節(jié)病變，已成為老年人致殘最常見的關(guān)節(jié)退變性疾病[1]，其發(fā)病機制尚未完全明確。目前認為，KOA發(fā)病的根本原因是各種致病因素造成軟骨細胞的破壞和細胞外基質(zhì)的合成與降解失衡。近年研究[2-4]也表明，炎性因子引發(fā)的關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥反應是導致KOA關(guān)節(jié)發(fā)生退變的另一重要因素，也是導致KOA患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛的主要誘因，這些細胞因子主要包括白細胞介素(Interleukin，IL)、趨化因子(Chemotactic factor，CC)以及腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)等。白細胞介素-6(Interleukin，IL-6)是一種與多種炎癥介質(zhì)具有協(xié)同作用的促炎因子，是調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨炎癥反應的始動因素[5]。如：骨關(guān)節(jié)炎模型鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)白細胞介素-1(Interleukin，IL-1)、IL-6及腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)表達水平的增加程度與炎癥嚴重程度存在正相關(guān)關(guān)系，可以作為骨關(guān)節(jié)炎疾病程度的參考指標[6]；IL-6和IL-1β還是造成KOA關(guān)節(jié)軟骨破壞和軟骨基質(zhì)降解最主要的細胞因子[7]。IL-2是一類由Th1細胞分泌的細胞因子，過量分泌可引起局部慢性炎癥[8]，還可以刺激軟骨細胞分泌金屬蛋白酶，破壞或者抑制基質(zhì)合成，引起單核巨噬細胞炎性浸潤，導致軟骨組織破壞，引起疾病發(fā)生[9]。研究結(jié)果表明，膝關(guān)節(jié)滑膜液內(nèi)的細胞因子是KOA發(fā)生疼痛的主要原因[2]。

疼痛既是KOA最常見的臨床癥狀，也是大多數(shù)患者就診的主要原因。藤黃健骨膠囊具有補腎、活血、止痛等功效，臨床主要用于治療增生性關(guān)節(jié)炎和大骨節(jié)病等。有研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，藤黃健骨膠囊主要通過調(diào)控骨質(zhì)疏松模型鼠的鈣磷代謝和OPG/RANK/RANKL調(diào)節(jié)軸來影響其骨密度和骨礦含量，實現(xiàn)其治療作用。藤黃健骨膠囊是否對KOA治療有效及其治療機制是什么，目前鮮見報道。因此，本研究采用改良后Hulth 法建立KOA大鼠模型，通過觀察藤黃健骨膠囊對KOA大鼠模型血細胞變化和炎癥因子變化的影響，初步探討藤黃健骨膠囊的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只SPF級SD雌性大鼠，體重(200±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗動物中心提供。實驗動物質(zhì)量合格證編號：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 試劑及實驗藥物

水合氯醛(天津市光復精細化工研究所，批號：20150105)；慶大霉素(辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號：1805312221)；Rat IL-2 ELISA Kit檢測試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：MM-0192R1)；Rat IL-6 ELISA Kit檢測試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：MM-0190R1)；藤黃健骨膠囊(甘肅省西峰制藥有限責任公司，規(guī)格0.25 g/粒，批號：503010)；仙靈骨葆膠囊(國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司，規(guī)格0.5 g/粒，批號：190111)。

1.3 主要儀器

iMark型自動酶標分析儀(美國Bio-Rad公司)；FA2004N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；TDZ5-WS型醫(yī)用離心機(湖南平凡科技有限公司)；SYSMEX型全血自動分析儀(上海玉研科學儀器有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 實驗藥物給藥劑量

藤黃健骨膠囊，人的臨床用量為：2 g/d，按照人與大鼠的體表面積換算法2 g×0.018×5=0.18 g/kg作為中劑量，則藤黃健骨膠囊高、中、低劑量分別為0.36、0.18和0.09 g/kg。陽性對照藥仙靈骨葆膠囊，人的臨床用量為3 g/d，按照人與大鼠的體表面積換算法3 g×0.018×5=0.27 g/kg。

1.4.2 動物分組、造模及給藥

將 60 只 SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、KOA模型組、陽性對照組(仙靈骨葆膠囊)以及藤黃健骨膠囊高、中、低劑量組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠用改良Hulth 法[12-13]造模，采用10%質(zhì)量分數(shù)的水合氯醛腹腔注射麻醉各組動物后，將其仰臥位固定于操作臺，作髕骨前長約3 cm的內(nèi)側(cè)切口，逐層分離顯露髕骨，切除前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)半月板，行抽屜試驗陽性后逐層縫合切口。假手術(shù)組只作髕骨前長約3 cm的內(nèi)側(cè)切口，逐層分離暴露關(guān)節(jié)腔，對前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶和半月板均不作切除處理。術(shù)后3 d 各組大鼠給予慶大霉素以防感染。造模6周后假手術(shù)組、模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃方式，陽性對照組給予仙靈骨葆膠囊(0.27 g/kg)灌胃，藤黃健骨膠囊干預組給予高、中、低劑量的藤黃健骨膠囊(0.36、0.18和0.09 g/kg)灌胃治療，1次/d，連續(xù)干預8周。

1.4.3 HE染色觀察骨形態(tài)學變化

動物處死后取完整膝關(guān)節(jié)，將各組動物的右側(cè)膝關(guān)節(jié)脫鈣處理4周后，進行常規(guī)石蠟包埋，切約5μm厚度的切片，HE 染色，倒置在顯微鏡下觀察各組大鼠軟骨組織的形態(tài)學變化并進行 Mankin 評分，具體評分依據(jù)參考文獻[14]。

1.4.4 足跖腫脹厚度的測定

用游標卡尺分別測量各組大鼠造模前和干預后的右后足足跖厚度，用公式計算足跖腫脹度[15]。足跖腫脹度(mm)= 干預后足跖厚度(mm)-造模前足跖厚度(mm)。

1.4.5 外周血細胞變化的測定

末次給藥24 h后，腹腔注射10%質(zhì)量分數(shù)水合氯醛麻醉各組動物，摘除各組動物的眼球，取血用全血自動分析儀測定各組大鼠白細胞(White blood cell，WBC)、中性粒細胞(Neutrophils，N)、淋巴細胞(Lymphocyte，L)、單核細胞(Monocyte，M)和嗜酸粒細胞(Eosinophils，EOS)水平。

1.4.6 血清IL-2和IL-6含量的測定

眼球采血，血標本靜置2～3 h，1500 r/min離心10 min分離血清。ELISA法檢測各組動物血清IL-2及IL-6含量等指標。具體操作按試劑盒說明書進行。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 對軟骨組織病理形態(tài)改變的影響

軟骨組織病理形態(tài)結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠關(guān)節(jié)面及滑膜結(jié)構(gòu)完整，軟骨細胞呈水平排列，關(guān)節(jié)軟骨邊緣光滑；KOA模型組大鼠關(guān)節(jié)面嚴重受損，軟骨細胞大量脫落；藤黃健骨膠囊低劑量組大鼠關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面受損比較嚴重，軟骨細胞排列紊亂；藤黃健骨膠囊中、高劑量組和陽性對照組大鼠關(guān)節(jié)面及滑膜結(jié)構(gòu)趨于正常，軟骨細胞排列整齊，并呈水平排列。Mankin評分結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，KOA模型組大鼠Mankin評分升高，有顯著性差異(P<0.05)；與KOA模型組比較，藤黃健骨膠囊中、高劑量組和陽性對照組大鼠Mankin評分均降低，有顯著性差異(P<0.05)。具體見圖1和表1。

(a)假手術(shù)組；(b)KOA模型組；(c)陽性對照組；(d)藤黃健骨膠囊高劑量組；(e)藤黃健骨膠囊中劑量組；(f)藤黃健骨膠囊低劑量組

表1 藤黃健骨膠囊對去KOA模型大鼠Makin評分的影響(±S，n=10)

2.2 對足跖腫脹的影響

與假手術(shù)組比較，KOA模型組右后足足跖腫脹顯著增強(P<0.05)；與KOA模型組比較，藤黃健骨膠囊各劑量組和陽性對照組大鼠右后足足跖腫脹顯著減輕(P<0.05)。具體見表2。

表2 藤黃健骨膠囊對KOA模型大鼠足跖腫脹的影響

2.3 對血細胞變化的影響

由表3可知：與假手術(shù)組比較，KOA模型組大鼠白細胞(White blood cell，WBC) 、中性粒細胞(Neutrophils，N)、中性粒細胞/淋巴細胞(Neutrophils/lymphocyte，N/ L)等指標均升高，淋巴細胞(Lymphocyte，L)的數(shù)目降低(P<0.05)；與假手術(shù)組比較，KOA模型組大鼠單核細胞(Monocyte，M)和嗜酸粒細胞(Eosinophils，EOS)的含量也減低，但無顯著性差異(P>0.05)；與KOA模型組比較，藤黃健骨膠囊中、高劑量組和陽性對照組N的數(shù)目明顯降低，L的數(shù)目明顯增加，藤黃健骨膠囊各干預組和陽性對照組的WBC和 N/L等指標均明顯降低(P<0.05)；與KOA模型組比較，藤黃健骨膠囊各劑量組和陽性對照組大鼠M和EOS的含量升高，但無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 對IL-2和IL-6含量的影響

由表4可知：與假手術(shù)組比較，KOA模型組大鼠IL-2含量和IL-6含量顯著升高(P<0.05)；與KOA模型組比較，藤黃健骨膠囊高劑量組和陽性對照組IL-2含量顯著降低，藤黃健骨膠囊各干預組和陽性對照組IL-6含量均顯著降低(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

中醫(yī)將KOA歸屬于“筋痹、骨痹”范疇[16]。中醫(yī)理論認為，膝關(guān)節(jié)的局部濕濁痹阻與氣滯血瘀是導致KOA的主要病機，而長期的濕濁痹阻與氣滯血瘀又會導致筋脈受阻、腎氣虧損、經(jīng)絡(luò)受到淤滯，故臨床治療中以補腎壯骨、利濕除痹、舒筋通絡(luò)、活血化瘀和行氣止痛為主。藤黃健骨膠囊組方：熟地黃具有補血滋陰、益精填髓的功效，為君藥；鹿銜草、骨碎補(燙)、肉蓯蓉、淫羊藿輔助君藥發(fā)揮補益肝腎、強筋健骨的功效，為臣藥；雞血藤具有補血、活血、通絡(luò)等功效，為佐藥；萊菔子具有消食除脹、降氣化痰的功效，為使藥?？梢姡冱S健骨膠囊的組方原則與KOA的中醫(yī)病機是相吻合的。并已有研究[17-18]證明，藤黃健骨膠囊治療KOA有效。

表3 藤黃健骨膠囊對膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠血常規(guī)的影響

表4 藤黃健骨膠囊對KOA模型大鼠IL-2和IL-6含量的影響

在KOA的發(fā)生發(fā)展過程中，膝關(guān)節(jié)會因各種原因造成關(guān)節(jié)滑膜的損傷，導致滑膜下層毛細血管的通透性上升，從而使大量的滲出液積聚在關(guān)節(jié)腔內(nèi)，從而引起關(guān)節(jié)腫脹、疼痛等，引發(fā)關(guān)節(jié)炎癥反應。研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，在KOA模型大鼠中，促炎因子IL-1和IL-6可以促進關(guān)節(jié)炎癥細胞的浸潤，而大量炎癥細胞的浸潤反過來進一步促進了關(guān)節(jié)腔內(nèi)液體的滲出，加重了關(guān)節(jié)軟骨組織的病理損傷、關(guān)節(jié)軟骨的破壞和退變，從而造成惡性循環(huán)。KOA模型組大鼠關(guān)節(jié)面嚴重受損，軟骨細胞大量脫落，Mankin評分升高和右后足足跖腫脹顯著增強，炎癥細胞WBC數(shù)目和N數(shù)目顯著增加，炎癥細胞因子IL-2含量和IL-6的含量也顯著升高，而藤黃健骨膠囊可以使KOA模型組大鼠的關(guān)節(jié)面及滑膜結(jié)構(gòu)趨于正常，可以顯著降低KOA模型組大鼠的右后足足跖腫脹，顯著降低炎癥細胞WBC數(shù)目和N數(shù)目，同時也顯著降低其炎癥細胞因子IL-2含量和IL-6的含量。這說明藤黃健骨膠囊治療KOA有效，其具體機制可能是通過減少KOA機體炎癥細胞因子的分泌來減輕局部炎癥細胞的浸潤，減少關(guān)節(jié)液的滲出，從而改善關(guān)節(jié)軟骨組織的病理損傷，減輕關(guān)節(jié)軟骨的破壞和退變，從而發(fā)揮治療抗炎鎮(zhèn)痛的效果。但其具體的分子機制還需要進一步深入研究。