謝賽飛 譚勁 鄭玲 朱可可 周領(lǐng)航 陳明

〔摘要〕 目的 探索扶正活血解毒方對檳榔堿提取物（areca nut extract， ANE）誘導(dǎo)的口腔黏膜下纖維化（oral submucous fibrosis， OSF）Wnt/β-catenin 信號通路的作用機制。方法 體外培養(yǎng)大鼠口腔黏膜上皮細胞（epithelial cell， EC），分為正常組、模型組、中藥高/中/低劑量組和IWR-1組。以ANE為誘導(dǎo)劑，扶正活血解毒方含藥血清為干預(yù)藥物，以Wnt/β-catenin信號通路抑制劑IWR-1為陽性對照物，采用CCK8檢測EC細胞增殖;PCR檢測Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1基因的表達;Western blot檢測Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1蛋白的表達。結(jié)果 與正常組相比，模型組EC增殖水平提高，Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白表達增加，Axin基因及蛋白表達降低（P<0.05）;與模型組相比，中藥高、中劑量組EC增殖水平降低，Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白表達降低，Axin基因及蛋白表達升高（P<0.05）;與模型組相比，IWR-1組EC增殖水平降低，Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白表達降低，Axin基因及蛋白表達升高（P<0.05）。結(jié)論 扶正活血解毒方可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，抑制ANE刺激的EC增殖，逆轉(zhuǎn)OSF癌前病變的形成。

〔關(guān)鍵詞〕 口腔黏膜下纖維化;檳榔堿提取物;扶正活血解毒;Wnt/β-catenin信號通路

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.11.001

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of Fuzheng Huoxue Jiedu Prescription on Wnt/β-catenin signaling pathway induced by areca nut extract （ANE） in oral submucosal fibrosis. Methods The rat oral mucosa epithelial cells （ECs） cultured in vitro were assigned into a normal group， a model group， a Chinese materia medica high， medium and low dose group， a IWR-1 group. ANE was inducer， and Fuzheng Huoxue Jiedu Prescription-containing serum was intervention medicine. Wnt/β-catenin signaling pathway inhibitor IWR-1 was the positive control medicine. The CCK8 was used to test EC cell proliferation; PCR was used to detect Wnt1， β- catenin， Axin， cylinD1 gene expression; Western Blot was used to detect Wnt1， β-catenin， Axin， cylinD1 protein expression. Results Compared with the normal group， ECs proliferation levels of the model group increased， and Wnt1， β-catenin， cylinD1 gene and protein expression increased. Axin gene and protein expression decreased （P<0.05）; Compared with model group， ECs proliferation levels of Chinese materia medica high and medium dose groups were reduced， and Wnt1， β-catenin， cylinD1 gene and protein expression were reduced. Axin gene and protein expression increased （P<0.05）; Compared with the model group， ECs proliferation level of the IWR-1 group was reduced， and Wnt1， β-catenin， cylinD1 gene and protein expression were reduced. Axin gene and protein expression increased （P<0.05）. Conclusion Fuzheng Huoxue Jiedu Prescription can inhibit the proliferation of EC cells stimulated by ANE， and reverse the formation of OSF precancerous lesions through regulating Wnt/β-catenin signaling pathway.

〔Keywords〕 oral submucosal fibrosis; areca nut extract; Fuzheng Huoxue Jiedu; Wnt/β-catenin signal pathway

口腔黏膜下纖維化或稱口腔黏膜下纖維性變（oral submucous fibrosis， OSF）是一種口腔黏膜潛在惡性疾病[1-2]。其癌變率高達7%，WHO將OSF列為癌前狀態(tài)[3]。流行病學(xué)調(diào)查表明，咀嚼檳榔是OSF主要的致病因素，但癌變機制尚不清楚，可能與檳榔的致癌成分檳榔堿、細胞因子、創(chuàng)傷及細胞免疫等關(guān)系密切[4-5]，尤其認為某些細胞因子參與了OSF的癌變過程，其中以Wnt與TGF-β1介導(dǎo)的信號通路最具代表性[6-8]。如何阻斷TGF-β與Wnt信號通路細胞因子間的聯(lián)系，將成為防治OSF癌變的關(guān)鍵。前期研究發(fā)現(xiàn)扶正活血解毒中藥通過調(diào)控TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能具有抑制檳榔堿提取物（areca nut extract， ANE）刺激的EC細胞增殖的作用[9-11]。本研究將從Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的角度探討扶正活血解毒方對OSF癌前病變的作用機制，為臨床OSF癌變的防治提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?實驗細胞 ?口腔黏膜上皮細胞（epithelial cell， EC）購自于中國上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。收到細胞后，選擇相差顯微鏡對細胞進行鑒定，鏡下細胞為多角形，胞核大，培養(yǎng)皿中細胞鋪滿的位置顯微鏡下可見鋪路石狀。高倍鏡下未見成纖維細胞。

1.1.2 ?實驗藥物 ?（1）檳榔提取物（ANE）購于深圳潤慧生物科技有限公司。（2）扶正活血解毒方所用藥物為顆粒劑，由廣東三九制藥有限公司生產(chǎn)，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。具體組方規(guī)格如下：丹參10 g，玄參10 g，當歸10 g，紅花5 g，生地黃10 g，白花蛇舌草10 g，夏枯草10 g，生黃芪10 g，薄荷10 g，白芍10 g，茵陳10 g，桔梗10 g?？藬?shù)為生藥劑量，為同一批次同一產(chǎn)地藥材。將以上中藥按處方量取14劑，一劑生藥（共115 g）加入500 mL溫開水沖泡并充分攪拌，使用水煎濃縮的方法將藥物濃縮成500 mL液體，生藥濃度為0.23 g/mL，藥物現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3 ?含藥血清 ?8周齡SPF級雄性SD大鼠20只由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室提供，在SPF條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將大鼠隨機分為正常組、中藥高劑量組、中藥中劑量組和中藥低劑量組4組，每組5只，其中正常組以0.9%生理鹽水組灌胃8 mL/只，中藥高、中、低劑量組分別按照活扶正活血解毒方12、8、4 mL/kg灌胃[中藥低、中、高劑量大鼠灌胃量按照成人每日用量的1、2、3倍定為等效劑量（正常成人體質(zhì)量按60 kg進行換算）]，每日2次，連續(xù)灌胃7 d。大鼠末次灌胃1 h后，行心臟取血，4 ℃、1 ?500 r/min離心10 min，取上清56 ℃滅活30 min，將滅活后的血清通過0.22 μm濾器過濾除菌，配置成完全培養(yǎng)基備用[12-13]。

1.1.4 ?主要試劑 ?大鼠口腔黏膜上皮細胞完全培養(yǎng)液（上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司，批號RATiCELLM013）;胰酶（美國Hyclone，批號SH30042.01）;2.24 μg/mL DispaseⅡ酶（美國Gibco，批號25200-027）;PBS（美國Hyclone，批號SH30256.01B）;CCK8增殖檢測試劑盒（日本DOJINDO，批號CK04）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國北京康為世紀，批號CW2569）;Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（日本TOYOBO，批號QPK-201）;引物由Genecopoeia合成;Wnt1抗體（英國Abcam，批號ab15251）;β-catenin抗體（英國Abcam，，批號ab32572）;Axin2抗體（英國Abcam，批號ab32197）;cylinD1抗體（英國Abcam，批號ab251892）;IWR-1（美國MCE，批號HY-12238）;羊抗兔二抗（英國Abcam，批號ab6747）;顯色液（美國Cyanagen，批號23423）。

1.1.5 ?主要儀器 ?全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司，型號UniCelDxI 800）;Nanno Drop 分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司，型號NDoneC）;基因擴增儀（美國MjRE-SEARCH公司，型號TTC-220）;離心機（中國湖南湘儀，型號H1650R）;Motic顯微鏡（成貫儀器上海有限公司，型號BA210T）;酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司，型號SpectraMax M4]。

1.2 ?方法

1.2.1 ?細胞分組及培養(yǎng) ?分離培養(yǎng)的細胞增殖至對數(shù)期，將細胞分為正常組、模型組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組、IWR-1組6組。其中正常組以正常大鼠血清干預(yù)，模型組以正常大鼠血清+50 μg/mL ANE干預(yù)，中藥高、中、低劑量組分別以高、中、低劑量含藥血清+50 μg/mL ANE干預(yù)，IWR-1組以正常大鼠血清+5 μmol/L IWR-1。

1.2.2 ?CCK8檢測EC細胞增殖 ?將6組細胞按105/mL濃度接種于96孔板中，每孔100 μL，共鋪5板，檢測時間為12、24、36、48 h 4個時間點，在檢測前2 h加入CCK8 10 μL/孔，37 ℃ 5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)至檢測時間點，取出培養(yǎng)板，放置于酶標儀中，450 nm和600 nm雙波長檢測并讀數(shù)[14-15]。

1.2.3 ?PCR檢測Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1基因的表達 ?將6組細胞按105/mL濃度接種于T25培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至細胞長滿培養(yǎng)瓶，將其消化、離心、棄上清留存細胞。以RNA提取試劑盒提取細胞RNA，具體操作步驟根據(jù)試劑盒中的使用說明進行。RNA提取后，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作步驟根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。再根據(jù)反應(yīng)體系將cDNA與SYBR溶液配比，進行PCR操作，并讀取mean CT值和△△CT值。

1.2.4 ?Western blot檢測Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1蛋白的表達 ?將6組細胞按105/mL濃度接種于T25培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至細胞長滿培養(yǎng)瓶，將其消化、離心、棄上清留存細胞。將細胞中加入RIPA裂解液充分裂解后離心吸取上清，以BCA蛋白濃度試劑盒測量蛋白濃度后加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱5 min。根據(jù)蛋白分子量配置凝膠并電泳、轉(zhuǎn)膜、孵抗體、顯色，并讀取灰度值。

1.2.5 ?統(tǒng)計學(xué)方法 ?采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布者采用單因素ANOVA分析，數(shù)據(jù)非正態(tài)者采用非參檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?CCK8檢測結(jié)果

與正常組相比，模型組EC增殖被抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比，中藥高、中劑量組和IWR-1組均促進EC細胞增殖水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。詳見表1。

2.2 ?PCR檢測結(jié)果

與正常組相比，模型組Wnt1、β-catenin、cylinD1基因的表達量增高，Axin基因表達量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比，中藥高、中劑量組和IWR-1組的Wnt1、β-catenin、cylinD1基因的表達量均降低，Axin基因表達量均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。詳見表2。

2.3 ?Western blot檢測結(jié)果

與正常組相比，模型組Wnt1、β-catenin、cylinD1蛋白的表達量增高，Axin蛋白表達量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比，中藥高、中劑量組和IWR-1組的Wnt1、β-catenin、cylinD1蛋白的表達量均降低，Axin蛋白表達量均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。詳見圖1、表3。

3 討論

OSF發(fā)病率高，且癌變率目前也有所增高。OSF的發(fā)病與多種因素有關(guān)，目前研究較多的是檳榔中的致癌成分檳榔堿，以及機體自身的免疫因子和通路，其中Wnt信號通路較為經(jīng)典。Wnt信號傳導(dǎo)通路有以下主要的分支：（1）Wnt/β-catenin通路;（2）WNT-Ca2+通路;（3）細胞極性通路。其中，Wnt/β-catenin通路是經(jīng)典的、主要的傳導(dǎo)通路，本文探討的為該信號通路。

Wnt/β-catenin信號通路是一個由多種分子參與、相互影響及制約的復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，對細胞增殖和分化具有重要調(diào)節(jié)作用，Axin蛋白是Wnt信號通路中為一個重要的構(gòu)形蛋白，它串聯(lián)起腺瘤病大腸桿菌蛋白（adenomatosis polyposis coli， APC）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β， GSK-3β）蛋白形成一個復(fù)合體，在正常情況下，這個復(fù)合體可使β-catenin磷酸化后被相關(guān)酶降解。但在異常情況下，Wnt配體-受體復(fù)合物抑制APC、β-catenin、GSK-3β降解復(fù)合體的穩(wěn)定性，使β-catenin降解障礙，胞漿內(nèi)游離的β-catenin聚集，在細胞質(zhì)中達到一定濃度后進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活Wnt/β-catenin信號通路使得下游癌基因表達增加。其中cyclinD1是Wnt信號通路的一個下游基因，為細胞G1/S期的特異性周期蛋白，主要功能是刺激細胞增殖，其過度表達可以導(dǎo)致細胞失控，從而導(dǎo)致細胞癌變。

本試驗通過體外培養(yǎng)EC細胞，以CCK8檢測EC細胞的增殖，以PCR檢測Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1基因的表達，以Western blot檢測Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1蛋白的表達。其檢測結(jié)果可見，模型組加入ANE后，EC細胞的增殖水平明顯提高，且ANE促進了Wnt1、β-catenin、cylinD1基因和蛋白的表達，降低了Axin基因和蛋白的表達。中藥高、中劑量組下調(diào)了EC細胞的增殖水平，且下調(diào)了Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白的表達，上調(diào)了Axin基因和蛋白的表達，高劑量組下調(diào)水平優(yōu)于中劑量組，中劑量組優(yōu)于低劑量組，呈現(xiàn)一定的藥物量效關(guān)系。IWR-1組通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路，從而降低了EC細胞的增殖水平，下調(diào)了Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白的表達，上調(diào)了Axin基因和蛋白的表達。

中藥具有療效可靠、靶點多、無副作用而且來源廣泛等優(yōu)點。譚勁教授在古方桃紅四物湯的基礎(chǔ)上加減選用，由丹參、玄參、當歸、紅花、生地黃、白花蛇舌草、夏枯草、生黃芪、薄荷、白芍、茵陳、桔梗十二味中藥制成扶正活血解毒方。方中丹參、當歸、紅花活血化瘀;生黃芪、白芍益氣扶正;生地黃、玄參、茵陳、薄荷養(yǎng)陰清熱;白花蛇舌草、夏枯草解毒散瘀;桔?；瞪⒔Y(jié)?，F(xiàn)代藥理研究也表明，白花蛇舌草、夏枯草具有抗癌、增強免疫、抑制炎癥因子的作用，桔梗祛痰效果顯著[16-18]。全方諸藥合用，共奏扶正活血、祛痰解毒之功。

從本實驗結(jié)果可以看出，ANE能夠促進EC細胞的增殖，也可以激活Wnt/β-catenin信號通路，促進相關(guān)基因及蛋白的表達，說明咀嚼檳榔可能是通過激活Wnt/β-catenin信號通路進而促進了OSF的發(fā)生。扶正活血解毒方能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路，降低EC細胞的增殖。IWR-1組通過加入Wnt/β-catenin信號通路抑制劑IWR-1抑制了該信號通路，降低了Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白的表達，上調(diào)了Axin基因和蛋白的表達，中藥組與IWR-1組在Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1基因及蛋白的表達上無明顯差異。這表明中藥扶正活血解毒方是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，從而降低EC細胞增殖產(chǎn)生療效。

綜上所述，本研究從Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的角度探索了扶正活血解毒方的起效機制，該結(jié)果為其臨床療效提供了理論依據(jù)，同時也為臨床OSF癌變的防治提供新的實驗依據(jù)。然而本實驗尚存在一定的不足，在探索扶正活血解毒方對OSF的影響時，未增加在體動物實驗以及臨床試驗作為理論支持，這也是我們課題組后期的研究方向。

參考文獻

[1] 黃 ?琰，高義軍，尹曉敏.口腔黏膜下纖維性變及其癌變組織中Survivin、c-myc的表達[J].實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（3）：448-449.

[2] 邵小鈞，席 ?慶.食用檳榔及其與口腔癌間的關(guān)系[J].國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2015，42（6）：668-672.

[3] HALLIKERI K， NAIKMASUR V， GUTTAL K， et al. Prevalence of oral mucosal lesions among smokeless tobacco usage： A cross-sectional study[J]. Indian Journal of Cancer， 2018， 55（4）： 404-409.

[4] SU S C， CHANG L C， LIN C W， et al. Mutational signatures and mutagenic impacts associated with betel quid chewing in oral squamous cell carcinoma[J]. Human Genetics， 2019， 138（11/12）： 1379-1389.

[5] CHATTOPADHYAY I， VERMA M， PANDA M. Role of oral

microbiome signatures in diagnosis and prognosis of oral cancer[J]. Technology in Cancer Research & Treatment， 2019， 18： 1533033819867354.

[6] NOGUTI J， DE MOURA C F， HOSSAKA T A， et al. The role of canonical WNT signaling pathway in oral carcinogenesis： A comprehensive review[J]. Anticancer Research， 2012， 32（3）： 873-878.

[7] PALUSZCZAK J， SARBAK J， KOSTRZEWSKA-POCZEKAJ M， et al. The negative regulators of Wnt pathway-DACH1， DKK1， and WIF1 are methylated in oral and oropharyngeal cancer and WIF1 methylation predicts shorter survival[J]. Tumour Biology： the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine， 2015， 36（4）： 2855-2861.

[8] KATASE N， LEFEUVRE M， TSUJIGIWA H， et al. Knockdown of Dkk-3 decreases cancer cell migration and invasion independently of the Wnt pathways in oral squamous cell carcinoma derived cells[J]. Oncology Reports， 2013， 29（4）： 1349-1355.

[9] JI Q， LIU X， HAN Z F， et al. Resveratrol suppresses epithelial-to-mesenchymal transition in colorectal cancer through TGF-β1/Smads signaling pathway mediated Snail/E-cadherin expression[J]. BMC Cancer， 2015， 15： 97.

[10] 顧紅兵，李繼坤.TGF-β/Smads信號通路與胃癌關(guān)系研究進展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2010，10（3）：574-577.

[11] KI K D， TONG S Y， HUH C Y， et al. Expression and mutational analysis of TGF-beta/Smads signaling in human cervical cancers[J]. Journal of Gynecologic Oncology， 2009， 20（2）： 117-121.

[12] 王者令，劉中景，宋 ?霆，等.扶正活血不同組方大鼠含藥血清對HSC-T6增殖的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2010，16（11）：1050-1051.

[13] 羅玉姣，岳金寶，吳 ?丹，等.扶正活血解毒方干預(yù)ANE誘導(dǎo)口腔黏膜成纖維細胞I型膠原表達的實驗研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（12）：1308-1311.

[14] 賈鵬宇.CCK8法檢測杏丁聯(lián)合吡柔比星對膀胱原代癌細胞的增值抑制作用[D].桂林：桂林醫(yī)學(xué)院，2012.

[15] 劉素貞，曹曉敏，許麗娟，等.應(yīng)用CCK8法檢測雞淋巴細胞活性的檢測最佳條件研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（7）：212-214.

[16] 王 ?靜，彭解英.口腔黏膜下纖維化的易感性研究[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2005，21（5）：581-582.

[17] 譚 ?勁，李元聰，陳 ?安.丹玄口康治療口腔粘膜下纖維化的臨床研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，26（5）：41-43.

[18] 馮春來，袁 ?穎，張海生，等.夏枯草抗腫瘤分子協(xié)同作用網(wǎng)絡(luò)分析[J].中成藥，2016，38（9）：2003-2012.