楊雪艷 彭俊 趙永旺 唐云驄 彭輝燦

〔摘要〕 目的 觀察不同濃度的枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharide， LBP）對(duì)體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（human retinal capillary endothelial cells， HRCEC）增殖及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）表達(dá)的影響。方法 獲取人眼球摘除術(shù)后的HRCEC，予以體外培養(yǎng)，選取最佳狀態(tài)的3～4代細(xì)胞;CCK8法檢測(cè)在不同濃度LBP體外高糖環(huán)境下分別作用12、24、36 h后HRCEC的增殖情況;Western blot法檢測(cè)各組HRCEC的VEGF表達(dá)情況。結(jié)果 同一時(shí)間組間比較，高糖組HRCEC活性及VEGF的表達(dá)量均高于低糖組（P<0.05）;不同濃度LBP實(shí)驗(yàn)組HRCEC活性及VEGF表達(dá)量均明顯低于高糖組（P<0.05），80 μg/mL LBP組HRCEC活性及VEGF表達(dá)低于20 μg/mL LBP實(shí)驗(yàn)組與40 μg/mL LBP實(shí)驗(yàn)組（P<0.05）;各實(shí)驗(yàn)組在干預(yù)36 h時(shí)， HRCEC活性及VEGF表達(dá)低于干預(yù)12 h與24 h（P<0.05）。結(jié)論 LBP能抑制高糖環(huán)境下HRCEC的增殖并下調(diào)VEGF的表達(dá)，并與LBP濃度和作用時(shí)間正相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 枸杞多糖;人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;高糖;新生血管

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.11.002

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of different concentrations of Lycium barbarum polysaccharide （LBP） on the proliferation of human retinal capillary endothelial cells （HRCEC） and the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） cultured in a high glucose environment in vitro. Methods The HRCEC was obtained after human eyeball enucleation， and cultured in vitro. The best 3 to 4 generation cells were selected; CCK8 method was used to detect the proliferation of HRCEC after 12 h， 24 h， 36 h under high glucose environment by different concentration of LBP in vitro; Western Blot method was used to detect VEGF expression of HRCEC in each group. Results In comparison between groups at the same time， HRCEC activity and VEGF expression in the high glucose group were higher than those in the low glucose group （P<0.05）; HRCEC activity and VEGF expression in the LBP experimental group at different concentrations were significantly lower than those in the high glucose group （P<0.05）. HRCEC activity and VEGF expression in 80 μg/m LLBP group were lower than 20 μg/mL LBP experimental group and 40 μg/mL LBP experimental group （P<0.05）; HRCEC activity and VEGF expression in each experimental group with intervention for 36 h were lower than 12 h and 24 h （P<0.05）. Conclusion LBP can inhibit the proliferation of HRCEC and down-regulate the expression of VEGF in a high glucose environment， and is positively correlated with the concentration of LBP and the duration of action.

〔Keywords〕 LBP; HRCEC; VEGF; high glucose; neovascularization

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy， DR）發(fā)病率逐漸升高，世界范圍內(nèi)的糖尿病患者中，DR患病率約34%[1]，DR早期癥狀隱匿，極易導(dǎo)致失明[2]。DR發(fā)生的主要原因是視網(wǎng)膜缺血缺氧，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，VEGF高表達(dá)，最終視網(wǎng)膜新生血管（retinal neovascularization， RNV）形成，DR的主要并發(fā)癥是視網(wǎng)膜出血與黃斑水腫（diabetic macular edema， DME）。玻璃體腔注射抗VEGF藥物雖然是DR并發(fā)黃斑水腫的一線治療方法[3]，但抗VEGF藥物（雷珠單抗、貝伐單抗、阿柏西普、康柏西普等）價(jià)格昂貴、作用時(shí)間短[4]。尋求價(jià)格低廉、安全有效的抗VEGF藥物成為目前DR研究的熱點(diǎn)。枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharide， LBP）是一種天然水溶性多糖，藥理作用廣泛。LBP可以降低DM小鼠的視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及血管新生[5]，LBP還可以抑制VEGF、Ang及其受體在DM小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)，具有治療DR的作用。既往雖然較多關(guān)于LBP在糖尿病、血管內(nèi)皮細(xì)胞等方面的研究，但尚未發(fā)現(xiàn)在人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（human retinal capillary endothelial cells， HRCEC）的相關(guān)研究，本文基于LBP對(duì)小鼠糖尿病VEGF抑制作用的基礎(chǔ)上，研究了LBP對(duì)高糖環(huán)境下HRCEC及VEGF的影響，期望為研發(fā)防治DR新藥物提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 ?主要試劑 ?胎牛血清（Gibco公司，貨號(hào)04-001-1ACS）;LBP（陜西康盛生物技術(shù)有限公司，KS118，純度35%）;兔抗人VEGF 抗體（博奧森公司，貨號(hào)bs-0279R）;β-actin（Mouse）、HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG（美國(guó)proteintech公司，貨號(hào)依次為：66009-1-Ig、SA00001-1、SA00001-2）;高糖培養(yǎng)基（SIGMA公司，貨號(hào)D5796）;蛋白預(yù)染Marker（Thermo公司）;SuperECL Plus超敏發(fā)光液（美國(guó)Advansta公司，貨號(hào)K-12045-D50）;胰酶消化液、RIPA裂解液（中國(guó)上海碧云天生物有限公司，貨號(hào)C0201、P0013B）;顯影液、定影液（中國(guó)上海佳信公司，BW-61、BW-62）;蛋白裂解液（中國(guó)上海碧云天公司，貨號(hào)P0013B）;TEMED（中國(guó)上海阿拉丁公司，T105497）;SDS（中國(guó)大連美倫公司，貨號(hào)MB2479）;第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體（Abcam公司）。

1.1.2 ?LBP溶液的配制 ?LBP母液配置：稱取35%含量LBP 10 mg，加入10 mL DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋，搖勻、溶解，500 r/min離心5 min，雙層0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾細(xì)菌及沉淀，并密封分裝，4 ℃保存。此時(shí)母液配置完成，含量為1 mg/mL。配置實(shí)驗(yàn)LBP濃度，移取母液200 μL置于15 mL離心管中，加入DMEM高糖培養(yǎng)基至10 mL，反復(fù)搖勻，配置成20 ？滋g/mL LBP，做好標(biāo)記，置于4 ℃冰箱保存。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ?HRCEC的培養(yǎng) ?在南華大學(xué)第二附屬醫(yī)院手術(shù)室選取角膜移植手術(shù)后余下的眼球，慶大霉素注射液浸泡30 min，分離視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，常溫下2%胰蛋白酶消化，過(guò)濾，加入20%小牛血清培養(yǎng)液停止消化，1 200 r/min離心8 min，去除上清液，在離心管內(nèi)加入10% Gibico FBS+1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基吹打混勻，接種于含有10% Gibico FBS+1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，再置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿底部約80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 ?HRCEC鑒定 ?（1）細(xì)胞爬片;（2）固定：PBST洗涕，加入4%PFA（多聚甲醛），4 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱30 min固定;（3）按照Western blot實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行破膜封閉、一抗孵育、二抗孵育;（4）包埋：抽取已二抗孵育好的細(xì)胞爬片，PBST緩沖液清洗，滴取1滴Fluoromount-G后蓋玻片再蓋上;（5）陽(yáng)性染色鏡檢示：經(jīng)過(guò)山羊抗小鼠IgG二抗橙紅色DyLight594熒光標(biāo)記。顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.3 ?實(shí)驗(yàn)分組 ?取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行分組：（1）AL組：低糖對(duì)照組（低糖+細(xì)胞）;（2）AG組：高糖對(duì)照組（高糖+細(xì)胞）;（3）A1組：20 μg/mL LBP實(shí)驗(yàn)組;（4）A2組：40 μg/mL LBP實(shí)驗(yàn)組;（5）A3組：80 μg/mL LBP實(shí)驗(yàn)組。其中低糖濃度為1 g/L，高糖濃度為4.5 g/L;實(shí)驗(yàn)組為不同濃度LBP+高糖培養(yǎng)基+細(xì)胞。

1.2.4 ?CCK8法行細(xì)胞增殖活性的檢測(cè) ?取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，以5×103個(gè)細(xì)胞/孔密度接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL。各組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)貼壁，每孔加入10 μL/孔的CCK8，用完全培養(yǎng)基配置CCK8溶液，去除含藥培養(yǎng)基每孔加入100 μL含有CCK8的培養(yǎng)基。37 ℃，5% CO2繼續(xù)孵育4 h后于Bio-Tek酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度（OD）值，測(cè)定各組HRCEC的增殖活性。

增殖抑制率=（高糖對(duì)照組OD值-藥物干預(yù)組OD值）/高糖對(duì)照組OD值×100%

1.2.5 ?Western blot 蛋白檢測(cè) ?（1）PBS洗滌細(xì)胞，3 000 r/min離心2 min，加入120 μL RIPA裂解液，超聲破碎1.5 min;冰上裂解;4 ℃，12 000 r/min離心15 min;取上清液。按照BCA法，測(cè)定550nm之間波長(zhǎng)的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。（2）樣品準(zhǔn)備：取80 μL蛋白上清，加入20 μL 5*loading buffer混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷備用。（3）電泳：點(diǎn)入marker 2 μL，其它按照分組順序每孔上樣15 μL已變性蛋白。恒定電壓75 V，130 min。（4）轉(zhuǎn)膜：分別切膠VEGF（24kD），β-actin（42kD）;300 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜，VEGF約39 min，β-actin 約60 min。（5）封閉：用1*PBST配制5%脫脂奶粉，室溫封閉60 min，4 ℃過(guò)夜，次日室溫放置30 min。（6）一抗孵育：加入一抗（Rabbit Anti-VEGF antibody （bs-0279R），1∶1 000;Mouse anti-β-actin antibody（66009-1-Ig）1∶5 000，室溫孵育90 min;1*PBST洗3次，每次15min。（7）二抗孵育：加入二抗（HRPgoatanti-mouse IgG，SA00001-1，1∶5 000;HRPgoat anti-rabbit IgG，SA00001-2，1∶6 000）溫孵育90 min后1*PBST洗3次，每次10 min。（8）顯色/曝光：化學(xué)發(fā)光法（chemiluminescence， ECL）顯色曝光，顯影沖洗，Image lab軟件分析灰度值。

1.3 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，全部的計(jì)量資料均采用“x±s”表示，選用t檢驗(yàn)行兩組數(shù)據(jù)間比較，應(yīng)用單因素方差分析（ANOVA One-Way）進(jìn)行多組數(shù)據(jù)之間比較，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 ?HRCEC的培養(yǎng)及鑒定

HRCEC新提取時(shí)混有白細(xì)胞、周細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h開(kāi)始貼壁，細(xì)胞呈梭形，經(jīng)過(guò)10 d觀察到HRCEC形成細(xì)胞集落。含有10%Gibico FBS+1%雙抗的DMEM培養(yǎng)，丟棄凋亡細(xì)胞，留優(yōu)良的HRCEC。培養(yǎng)半月時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)HRCEC鋪滿培養(yǎng)皿底部，呈鋪路石樣（圖1A）。經(jīng)山羊抗小鼠IgG二抗橙紅色DyLight594對(duì)第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體熒光標(biāo)記，HRCEC胞膜與胞漿特異性染色呈橘紅色，非特異性染色法對(duì)細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色（圖1B），陽(yáng)性著色細(xì)胞94.6%，對(duì)照組未見(jiàn)明顯著色，表示在外培養(yǎng)的HRCEC成功存活。

2.2 ?CCK8法檢測(cè)LBP對(duì)體外HRCEC增殖的影響

不同時(shí)間組間比較，HRCEC細(xì)胞增殖差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。組間兩兩比較：與低糖對(duì)照組相比，高糖對(duì)照組、各濃度LBP組的HRCEC數(shù)目增多（P<0.05）;與高糖對(duì)照組相比，各濃度LBP組的HRCEC數(shù)目減少（P<0.05）;與A1組相比，A2組和A3組HRCEC數(shù)目減少（P<0.05）;與A2組相比，A3組HRCEC數(shù)目減少（P<0.05）。同組不同時(shí)間比較差異具體統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），36 h時(shí)各濃度LBP組HRCEC數(shù)目低于12 h與24 h，差異具體統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 ?LBP對(duì)體外HRCEC中 VEGF的表達(dá)影響

采用免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中VEGF表達(dá)情況，不同時(shí)間組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。組間兩兩比較：與低糖對(duì)照組相比，高糖對(duì)照組、各濃度LBP組的VEGF表達(dá)增多（P<0.05）;與高糖對(duì)照組相比，各濃度LBP組的VEGF表達(dá)減少（P<0.05）;與A1組相比，A2組和A3組VEGF表達(dá)減少（P<0.05）;與A2組相比，A3組VEGF表達(dá)減少（P<0.05）。同組不同時(shí)間比較，VEGF表達(dá)差異具體統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），36 h時(shí)各濃度LBP組VEGF表達(dá)低于12 h與24 h，差異具體統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2、圖2。

3 討論

DM屬于中醫(yī)學(xué)“消渴癥”范疇，DR被稱為“消渴內(nèi)障”[6]。李傳課等[7]認(rèn)為DR是在脈絡(luò)瘀滯與陰虛燥熱的基礎(chǔ)上發(fā)病，其主要病機(jī)為血瘀、燥熱、陰傷，發(fā)病的關(guān)鍵是臟腑功能失調(diào)、陰陽(yáng)失衡。

西醫(yī)學(xué)認(rèn)為胰島β細(xì)胞分泌功能障礙可導(dǎo)致DM的發(fā)生，其與遺傳、自身免疫、遺傳等因素相關(guān)。高血糖導(dǎo)致眼視網(wǎng)膜血管發(fā)生病變，早期DR無(wú)自覺(jué)癥狀，很大一部分患者就診是DR病程已進(jìn)展到PDR，眼底出現(xiàn)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管閉塞無(wú)灌注、基底膜增厚、細(xì)胞增殖和遷移、視網(wǎng)膜纖維化、黃斑水腫、RNV形成、視網(wǎng)膜前出血等，而PDR眼致盲率非常高，其中Ⅰ型DM導(dǎo)致高達(dá)86%、Ⅱ型DM達(dá)33%[8-9]。

RNV形成是PDR最具特征的病理性改變，在發(fā)病過(guò)程中VEGF、IGF-1、TNF、PEDF等細(xì)胞因子相互作用破壞血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retinai barrier，BRB）、引發(fā)RNV形成，其中VEGF升高可促進(jìn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖[10]，增加血管通透性、促進(jìn)視網(wǎng)膜出血、滲出、水腫[11]，生成蛋白酶及推進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和移動(dòng)[12]，VEGF在一定程度上可促進(jìn)缺血性視網(wǎng)膜疾病黃斑水腫的發(fā)生[13]。PDR患者視網(wǎng)膜、玻璃體、房水中VEGF濃度增高，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管滲漏及視網(wǎng)膜、虹膜、房角新生血管形成，加速PDR進(jìn)程，繼發(fā)新生血管性青光眼等可能，VEGF在PDR發(fā)病過(guò)程及引發(fā)的并發(fā)癥中起著重要作用。

DR常見(jiàn)西醫(yī)治療：視網(wǎng)膜激光光凝、抗VEGF藥物、激素、手術(shù)，但這些方法均不能糾正DR病理改變[14-15]，且存在不同的缺點(diǎn)：激光治療可能出現(xiàn)黃斑水腫、玻璃體積血、視野缺損、視力下降等并發(fā)癥[16];激素可造成繼發(fā)性青光眼、白內(nèi)障加速形成;手術(shù)費(fèi)用高、硅油乳化、繼發(fā)青光眼等;而DR屬于中醫(yī)優(yōu)勢(shì)病種，銀杏軟膠囊、雙丹明目膠囊、和血明目片等在防治DR方面取得了很好的療效。

LBP[17]由枸杞成熟果實(shí)經(jīng)過(guò)脫脂、水提、反復(fù)醇沉獲取，由6種單糖組成的蛋白多糖，易溶于稀酸、稀堿溶液或熱水，可被丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑析出，存在多種生物活性。在傳統(tǒng)祖國(guó)醫(yī)學(xué)中，DR被稱為消渴目病，早有記載LBP對(duì)消渴目病存在治療的功效。在《本草通玄》中記載：“枸杞子補(bǔ)腎益精，水旺則骨強(qiáng)，而消渴目昏，腰疼、膝痛無(wú)不愈矣”，枸杞既可降低血糖又可補(bǔ)肝明目，成為補(bǔ)腎益精首選。

LBP（200 μg/mL）可明顯降低血清中臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）生長(zhǎng)因子的含量、縮短血管內(nèi)皮細(xì)胞周期，加速其凋亡，從而抑制HUVECs細(xì)胞新生血管形成[18];LBP可抑制炎癥因子產(chǎn)生，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)等，減輕LPS對(duì)HUVECs增殖的抑制作用，且LBP濃度為100 μg/mL的中劑量組為最佳治療濃度[19]。而HRCEC細(xì)胞與HUVEC細(xì)胞具有同源性，但人視網(wǎng)膜血管屬于微血管，因此，此實(shí)驗(yàn)選擇較低濃度（20、40、80 μg/mL）LBP處理高糖（葡萄糖4.5 g/L）環(huán)境下HRCEC，對(duì)照組低糖環(huán)境（葡萄糖1 g/L）。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)MHRCEC在高糖環(huán)境下的增殖以及VEGF表達(dá)作用，觀察發(fā)現(xiàn)LBP對(duì)HRCEC增殖及VEGF表達(dá)具有明顯的抑制作用，HRCEC在高糖環(huán)境下增殖速度較低糖環(huán)境下明顯加快，且VEGF的表達(dá)量顯著增加，這與目前DM患者血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、新生血管形成相符合。視網(wǎng)膜VEGF升高促進(jìn)RNV形成對(duì)DR的病程進(jìn)展起到推進(jìn)作用，因此，我們實(shí)驗(yàn)研究選擇VEGF作為目的蛋白，觀察并檢測(cè)了LBP對(duì)高糖環(huán)境下HRCEC增殖及VEGF表達(dá)的影響。CCK8及WB實(shí)驗(yàn)顯示：LBP對(duì)高糖環(huán)境下培養(yǎng)的HRCEC的增殖及VEGF的表達(dá)具有抑制作用，且80 μg/mL LBP組干預(yù)36 h抑制作用最強(qiáng)。因此，LBP可能通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)來(lái)抑制HRCEC增殖。

LBP通過(guò)降低血糖、膽固醇和甘油三酯，逆轉(zhuǎn)因高糖造成的視網(wǎng)膜滲漏從而保護(hù)血-視網(wǎng)膜屏障，抑制ROCK1蛋白表達(dá)及P-MLC信號(hào)通路來(lái)維持細(xì)胞緊密連接，降低大鼠DM視網(wǎng)膜血管VEGF表達(dá)來(lái)降低基底膜增厚、減輕周細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的水腫、減少對(duì)視細(xì)胞的損害，降低大鼠DM視網(wǎng)膜氧化損傷[17]。我們推測(cè)LBP可能是通過(guò)抑制ROCK1蛋白表達(dá)及P-MLC信號(hào)通路來(lái)降低VEGF表達(dá)，從而降低基底膜增厚、減輕周細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫，減輕視網(wǎng)膜滲漏、降低DM視網(wǎng)膜氧化損傷，LBP可抑制VEGF、Ang及受體表達(dá)，從而抑制糖尿病RNV形成[18]。

此實(shí)驗(yàn)表明，LBP具有抑制高糖環(huán)境下HRCEC增殖及VEGF表達(dá)的作用，但未進(jìn)一步對(duì)LBP抑制VEGF表達(dá)的作用機(jī)制深入研究，因此，我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步研究LBP抑制VEGF表達(dá)及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。

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