鄭欣

【摘要】 目的 探究葡萄籽提取物（GSE）對(duì)高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞肥大的抑制作用。方法 將大鼠系細(xì)胞膜分為常規(guī)組（NG組）、高糖組（HG組）和高糖聯(lián)合GSE（高、中、低）組， 對(duì)蛋白/細(xì)胞數(shù)量比值、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期變化和P21與P27表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果 將NG組為比較對(duì)象， 其他組在系膜通過高糖連續(xù)性培養(yǎng)2 d 后， 蛋白/細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)， HG聯(lián)合中劑量GSE組和HG聯(lián)合大劑量組的細(xì)胞蛋白/細(xì)胞數(shù)比值呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。將NG組為比較對(duì)象， 其他組經(jīng)高糖培養(yǎng)48、72 h后， 系膜細(xì)胞的增值水平減弱， HG聯(lián)合中劑量GSE組和HG聯(lián)合大劑量組明顯高于HG組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。系膜細(xì)胞經(jīng)過D-葡糖連續(xù)刺激2 d后， 兩種物質(zhì)的蛋白質(zhì)水平顯著提升， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)高糖聯(lián)合GSE處理后， 以單獨(dú)高糖組為研究對(duì)象， 證明GSE可全面對(duì)P21和P27起到抑制上升， 濃度存在依賴性， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。系細(xì)胞膜經(jīng)過高糖連續(xù)刺激48 h后， 細(xì)胞G0/G1期的比例顯著上升， 和S期相比顯著減少， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HG聯(lián)合中量GSE組和HG聯(lián)合高粱GSE組細(xì)胞的G0/G1比例下降， S期細(xì)胞明顯提升， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 GSE可全面抑制高糖誘導(dǎo)系細(xì)胞膜肥大， 證明該物質(zhì)能夠全面緩解DN的疾病進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】 高糖；系膜細(xì)胞肥大；葡萄籽提取物

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.17.195

糖尿病腎?。―N）發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜， 值得說明的是， 對(duì)1型和2型糖尿病患者的腎臟組織標(biāo)本實(shí)施形態(tài)學(xué)分析可見， DN細(xì)胞在表型轉(zhuǎn)化先期主要特征為細(xì)胞異常肥大[1]， 其中又以系膜細(xì)胞肥大最為顯著， 且在DN病理后期和系細(xì)胞膜肥大之間存在關(guān)聯(lián)性。對(duì)高糖誘導(dǎo)系細(xì)胞膜肥大進(jìn)行全面干預(yù)， 對(duì)于先期干預(yù)DN疾病進(jìn)展、延長(zhǎng)DN患者的生存時(shí)間有著非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。GSE有著差異化生物活性， 有相關(guān)研究證實(shí)， 對(duì)于糖尿病大鼠使用一定劑量的GSE， 可提升腎臟功能水平。出現(xiàn)這種情況的原因和減少糖尿病小鼠糖基化參數(shù)、腎組織生長(zhǎng)因子和提升腎臟抗氧化水平密切相關(guān)， 且當(dāng)前鮮有文獻(xiàn)對(duì)葡萄籽提取物對(duì)DN的分子和細(xì)胞作用加以闡述。為了全面探究葡萄籽提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞肥大的抑制情況， 本文聯(lián)系實(shí)際， 對(duì)該命題進(jìn)行全面研究， 重點(diǎn)在于分析其作用分子機(jī)制， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 原青花素含量≥95%的 GSE， 大鼠系膜細(xì)胞， RIPM1640培養(yǎng)基， 胎牛血清（FBS）， D-葡糖， 兔來源抗P21CIP和P27KIP。

1. 2 方法 在培養(yǎng)液內(nèi)加入青霉素， 濃度為10%的 FBS溶液， 鏈霉素溶液， 劑量均為100 U/ml， 將大鼠系膜細(xì)胞放置于上述培養(yǎng)液中， 混合完畢后， 將樣本放在37℃， 5%體積分?jǐn)?shù)二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱。在細(xì)胞出現(xiàn)單層貼壁生長(zhǎng)后， 每2天實(shí)施傳代1次， 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞作為本實(shí)驗(yàn)原料。

1. 2. 1 分組原則 選擇適當(dāng)密度對(duì)系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)種， 在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以前， 使用FBS培養(yǎng)液1640進(jìn)行同步培養(yǎng)， 在16 h后， 加入劑量不相同的GSE在FBS培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。本次實(shí)驗(yàn)將所有樣本分成高糖組（HG組）， 正常組（NG組）， 高糖聯(lián)合GSE（高、中、低）組。實(shí)驗(yàn)前， 將GSE分成1.5、10 mmol/L溶液， 實(shí)驗(yàn)中以1∶1000為比例， 稀釋為1.5、10 μmol/L的GSE。

1. 2. 2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 將對(duì)數(shù)系膜細(xì)胞加以收集， 調(diào)配好懸濁液濃度， 細(xì)胞種植在孔板內(nèi)， 貼壁， 經(jīng)16 h后， FBS同步， 更換新的培養(yǎng)液。將0、24、48、72 h視為觀察點(diǎn)， 對(duì)增殖情況進(jìn)行觀察， 在此過程中， 吸去清液， 洗滌PBS， 棄置上清液。在每個(gè)小孔中加入新的培養(yǎng)液。后加入MTT液， 連續(xù)培養(yǎng)3 h， 后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。完畢后在孔內(nèi)加入二甲基亞砜， 在恒溫環(huán)境下培養(yǎng)15 min， 等到晶體溶解后， 使用監(jiān)測(cè)設(shè)備測(cè)量吸光值， 計(jì)算活細(xì)胞數(shù)量。

1. 2. 3 蛋白/細(xì)胞數(shù)計(jì)算 各組細(xì)胞在刺激48 h后， 胰酶消化細(xì)胞， 計(jì)算各個(gè)小組總細(xì)胞數(shù)量。離心， 置入Ep管內(nèi)， 增加裂解液， 0℃環(huán)境留置30 min， 離心， 上清液為蛋白量。

1. 2. 4 細(xì)胞周期檢測(cè) 在各組細(xì)胞刺激48 h后， 洗滌PBS行雙重洗滌， 消化完畢后， 離心收集， 放置在離心管內(nèi)， 選擇一定數(shù)量細(xì)胞， 使用酒精在4℃環(huán)境下固定， 連續(xù)12 h。計(jì)算前離心， 去掉乙醇， PBS雙重洗滌， 將上述物品碘化丙啶， 暗處染色， 時(shí)長(zhǎng)為7.5 min， 使用細(xì)胞儀收集樣本， 經(jīng)專業(yè)軟件進(jìn)行相關(guān)分析。

1. 2. 5 P21CIP和P27KIP蛋白量檢測(cè) 選擇濃度為0.25%胰酶消化細(xì)胞， 離心， PBS雙重漂洗， 轉(zhuǎn)入EP管， 混合RIPA裂解液， 以0℃環(huán)境冰浴。共計(jì)0.5 h， 離心， 上清液為蛋白。

使用二喹甲酸（BCA）法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。蛋白電泳， 后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜， 使用麗春紅染色處理， BSA/TBST封閉， 溫度為4℃ ， 在60 min后， 加入經(jīng)稀釋的P21CIP和P27KIP孵育12 h， 后使用TBST三重漂洗， 稀釋， 標(biāo)記好的羊抗兔孵育1 h， 使用TBST行三重漂洗， 顯影， 膠片記錄。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 各組系膜細(xì)胞膜蛋白/細(xì)胞數(shù)情況 將NG組（2.31± 0.15）μg×104為比較對(duì)象， 在系膜通過高糖連續(xù)性培養(yǎng)2 d 后， HG組蛋白/細(xì)胞數(shù)（3.20±0.19）μg×104呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)， HG聯(lián)合中劑量GSE組和HG聯(lián)合大劑量組的細(xì)胞蛋白/細(xì)胞數(shù)比值（2.82±0.13）、（2.61±0.12）μg×104呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2. 2 系膜細(xì)胞的周期改變情況 將NG組為比較對(duì)象， 其他四組經(jīng)高糖培養(yǎng)48、72 h后， 系膜細(xì)胞的增值水平減弱；HG聯(lián)合中劑量GSE組和HG聯(lián)合大劑量組明顯比HG組要高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2. 3 各組P27和P21蛋白質(zhì)表達(dá)情況 將NG組為對(duì)比對(duì)象， 其他四組系膜細(xì)胞經(jīng)過D-葡糖連續(xù)刺激2 d后， 兩種物質(zhì)的蛋白質(zhì)水平顯著提升（P<0.05）。經(jīng)高糖聯(lián)合GSE處理后， 以單獨(dú)高糖組為研究對(duì)象， 證明GSE可全面對(duì)P21和P27起到抑制上升， 濃度存在依賴性， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

2. 4 各組系細(xì)胞膜周期變化詳情 將NG為比較對(duì)象， 系細(xì)胞膜經(jīng)過高糖連續(xù)刺激48 h 后， 細(xì)胞G0/G1期的比例顯著上升， 和S期相比顯著減少， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HG聯(lián)合中量GSE組和HG聯(lián)合高量GSE組細(xì)胞的G0/G1比例下降， S期細(xì)胞明顯提升， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

既往研究證實(shí)， DN細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的先期特征為細(xì)胞異常肥大， 以系膜細(xì)胞為顯著， 這種情況和DN后期病理存在較為顯著聯(lián)系[2]。由此能夠看出， 對(duì)肥大的系細(xì)胞膜進(jìn)行處理， 對(duì)于暫緩DN的進(jìn)展均有十分顯著的現(xiàn)實(shí)意義。

GSE有著生理和藥理雙重活性， 目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種疾病臨床治療中。但值得說明的是， 當(dāng)前關(guān)于GSE保護(hù)DN細(xì)胞和分子機(jī)制方面有待考察。在本次實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研究結(jié)果中能夠看出， 經(jīng)30 mmol/L刺激之后， 系細(xì)胞膜體現(xiàn)出肥大， 且細(xì)胞的增殖能力明顯下降， G0/G1細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)明顯提升， 而S期內(nèi)的百分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。值得說明的是， 系細(xì)胞膜之所以出現(xiàn)肥大， 其主要原因和利用誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性酶抑制物表達(dá)， 令系細(xì)胞膜再一次進(jìn)入新的細(xì)胞周期時(shí)無法通過G1到達(dá)S期， 進(jìn)而令細(xì)胞出現(xiàn)肥大現(xiàn)象。本次研究的另一項(xiàng)結(jié)果證實(shí)， 系細(xì)胞膜經(jīng)高糖處理后， P27和P21的表達(dá)量明顯提升。葡萄籽提取物呈現(xiàn)為依賴濃度性， 高糖誘導(dǎo)系細(xì)胞膜肥大， 進(jìn)而令細(xì)胞總蛋白/細(xì)胞數(shù)量下降， 提升系細(xì)胞膜的增值水平， 令S期細(xì)胞比例上調(diào)， G0/G1比例下降。推進(jìn)細(xì)胞膜會(huì)順利通過G1期， 進(jìn)而能夠證明， GSE可全面抑制P27和P21的表達(dá)， 推進(jìn)G1期， 對(duì)高糖誘導(dǎo)系細(xì)胞膜肥大起到拮抗作用。

綜上所述， GSE可全面抑制高糖誘導(dǎo)系細(xì)胞膜肥大， 證明該物質(zhì)能夠全面緩解DN的疾病進(jìn)展。

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[收稿日期：2016-01-25]