陳 珊，畢鑫屹，劉美玲，李 楠，崔震海，張 敖，阮燕曄

(沈陽農(nóng)業(yè)大學 生物科學技術(shù)學院，遼寧 沈陽 110866)

玉米是世界重要的食物來源之一，同時，也是中國重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物，其產(chǎn)量影響中國的糧食供應(yīng)安全及經(jīng)濟穩(wěn)定發(fā)展。種子萌發(fā)出苗是玉米生活周期的開始階段，出苗率高、苗齊、苗壯是植株健康生長和高額籽粒產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)[1]。玉米種子萌發(fā)至3葉期屬成苗階段，是植株從依靠胚乳的異養(yǎng)生長向依靠葉片光合的自養(yǎng)生長的轉(zhuǎn)變過程，該階段的生長受環(huán)境水勢、溫度和氧氣供應(yīng)等因子影響。這些因子不僅影響胚乳貯存物質(zhì)的分解及向胚的輸送，還影響胚的生長、葉片及光合能力的形成。吸水是玉米種子啟動萌發(fā)的第一步，對萌發(fā)至關(guān)重要[2-3]。雖然玉米對干旱的適應(yīng)能力較強，適度水分限制有利于種子萌發(fā)和產(chǎn)量形成[4-6]，但嚴重的水分虧缺降低細胞膨壓，從而抑制細胞的分裂、擴大和分化[7]進而影響種子萌發(fā)和幼苗生長[8]。干旱是我國玉米減產(chǎn)的主要因素[9]，其中春旱一直是北方玉米種植面臨的嚴峻問題[10-11]。春旱引起播種延遲、播下的種子不萌發(fā)、萌發(fā)不良難以成苗，或成苗質(zhì)量不高等問題，最終可使玉米減產(chǎn)20%～30%，甚至更多[12]。但是，不同玉米基因型萌發(fā)成苗階段對干旱脅迫的敏感性存在顯著差異[13-15]。采用適當?shù)霓r(nóng)藝措施可以提高萌發(fā)成苗期的抗旱性[16]。通過改良玉米品種萌發(fā)成苗期的抗旱性，或改進抗旱栽培措施，可以提高適時播種率和幼苗質(zhì)量，進而提高產(chǎn)量。了解種子萌發(fā)成苗期抗旱性的生理和分子機制將有助于玉米抗旱育種和抗旱栽培措施的研究。而滲透調(diào)節(jié)是種子萌發(fā)成苗階段適應(yīng)干旱環(huán)境的關(guān)鍵機制之一[17]，本文介紹了該方面的研究進展，并對存在問題進行了討論。

1 萌發(fā)成苗期的吸水過程和滲透調(diào)節(jié)

吸水是種子萌發(fā)的第一步，是干種子細胞恢復正常結(jié)構(gòu)和生理功能及幼苗形態(tài)建成的基本條件。玉米種子吸水包括吸脹吸水和滲透吸水2個機制。在初始階段，吸水以吸脹機制為主，由于干種子有非常低的襯質(zhì)勢，因此具有強大的吸水能力，在較低的環(huán)境水勢下也能夠吸收水分，而且吸水迅速[18]。然而，研究發(fā)現(xiàn)，在滲透脅迫下，不同品種之間萌動期的吸水率與發(fā)芽率不存在一致關(guān)系[19-20]，可能的原因是當吸水超過某一閾值之后，種子萌發(fā)不受含水量的影響。種子吸水后，胚細胞開始恢復正常的結(jié)構(gòu)和生理功能。這個階段的關(guān)鍵事件是構(gòu)成生物膜的脂類物質(zhì)從非雙層排布轉(zhuǎn)變?yōu)殡p分子層結(jié)構(gòu)，使膜具有生理功能，細胞內(nèi)可以積累溶質(zhì)產(chǎn)生滲透勢。隨之，細胞襯質(zhì)勢在吸水中的作用降低，其吸水功能逐漸被滲透勢所取代，細胞吸水轉(zhuǎn)變?yōu)橐詽B透機制為主。但需要注意的是，當胚細胞開始以滲透機制吸水時，胚乳可能仍以吸脹機制吸水。但隨著幼苗的生長，滲透吸水占萌發(fā)種子總吸水量的比例逐漸增大。

在滲透吸水階段，細胞需要不斷地降低滲透勢或維持較低的滲透勢以吸收水分。相對于吸脹機制，滲透吸水對環(huán)境水勢降低更為敏感。受滲透脅迫幼苗的含水量與對照相比會劇烈降低[3]，因此，這個時期的干旱對玉米種子萌發(fā)和成苗容易產(chǎn)生較大的不利影響[21]。種子萌發(fā)成苗階段是形態(tài)結(jié)構(gòu)劇烈變化的階段，需要旺盛的細胞分裂、擴大和分化，其基礎(chǔ)是足夠大的細胞膨壓[7]。在干旱脅迫下，萌動的種子或幼苗的滲透勢必須低于環(huán)境水勢才能從外部吸收到水分。在這種逆境條件下，細胞主動增加胞內(nèi)溶質(zhì)或維持較高濃度的溶質(zhì)來調(diào)節(jié)滲透勢的生理機制稱為滲透調(diào)節(jié)(Osmotic Adjustment,OA)。在滲透吸水階段，種子萌發(fā)對干旱的適應(yīng)能力主要決定于細胞的滲透調(diào)節(jié)能力。玉米種子在萌動期受到滲透脅迫，吸水率降低，萌動時間延長，而且不同品種的表現(xiàn)差異很大[20]，其主要原因可能是不同品種滲透調(diào)節(jié)能力存在差異。

在細胞內(nèi)，降低滲透勢的調(diào)節(jié)物質(zhì)包括無機離子和有機小分子兩大類；無機離子主要有鉀、鎂、鈉離子等；有機滲調(diào)物質(zhì)包括可溶性糖、可溶性蛋白、氨基酸及其衍生物，如脯氨酸、甘氨酸和甜菜堿等[22]。有機滲調(diào)物質(zhì)不僅能夠降低滲透勢，還具有保護生物膜、分子伴侶、核酸保護、猝滅金屬離子、清除活性氧等功能[23]。在受到滲透脅迫時，無機滲調(diào)物質(zhì)主要分布在液泡中，有機滲調(diào)物質(zhì)主要分布于細胞漿和除液泡外的細胞器中[24]。

2 鉀離子的吸收和分布

無機離子是植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在玉米種子萌動期細胞無機離子來自自身的貯存，當胚根突破種皮后，胚從外界吸收無機離子。鉀是植物重要的無機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[25]。用0.1～10.0 mmol/L氯化鉀浸泡后，玉米種子在正常條件下的發(fā)芽勢、活力指數(shù)和幼苗干重提高[26]，如果鉀濃度過高則抑制玉米種子萌發(fā)和幼苗生長[27]。但是在干旱條件下，用適量鉀預(yù)處理玉米種子則可以增加幼苗相對含水量和有機滲調(diào)物質(zhì)的含量[28]。隨著生長，幼苗對外界鉀離子的需求量增大，在干旱脅迫下，幼苗對鉀的需求量會更大。此外，在干旱脅迫下，鉀離子在萌發(fā)的種子或幼苗體內(nèi)的分配和再分配將影響種子萌發(fā)和成苗能力。然而，關(guān)于鉀離子在種子萌發(fā)過程的分布變化尚未見報道。研究發(fā)現(xiàn)，在低鉀條件下，玉米體內(nèi)存在鉀的再分配。過表達細胞膜鉀轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)節(jié)蛋白基因ZmCIPK23的玉米植株，在低鉀條件下，莖節(jié)的鉀含量顯著高于對照，而老葉和上部展開葉的鉀含量顯著低于對照[29]。目前尚不清楚在該過程中ZmCIPK23所調(diào)節(jié)的鉀轉(zhuǎn)運蛋白的相關(guān)機制。在擬南芥中，鉀轉(zhuǎn)運蛋白(KUP)對滲透脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，蛋白激酶SNF1相關(guān)蛋白激酶2E(SRK2E)是ABA信號傳導的關(guān)鍵組分，與KUP6相互作用并磷酸化KUP6，這表明KUP的功能受ABA信號傳導復合物調(diào)節(jié)[30]。

玉米根部對鉀的吸收與細胞膜上鉀轉(zhuǎn)運蛋白的活性有關(guān)。目前，玉米根系吸收鉀離子的轉(zhuǎn)運蛋白鑒定及活性調(diào)節(jié)研究已經(jīng)取得重要進展。ZMK1(擬南芥鉀轉(zhuǎn)運蛋白AKT1的同源基因)主要在玉米根部表達，其編碼蛋白具有鉀吸收功能[31]，鈣感受器CBL1/9和蛋白激酶CIPK23復合體共同調(diào)節(jié)擬南芥的AKT1蛋白活性。研究發(fā)現(xiàn)，玉米的擬南芥CIPK23同源蛋白基因ZmCIPK23能夠單獨激活ZMK1的鉀轉(zhuǎn)運活性，而加入CBL1的同源蛋白基因ZmCBL1則進一步增強其活性。ZmCBL1定位于細胞膜上，而ZmCIPK23沒有特異定位，兩者都主要在根部表達[31]。玉米的ZmCIPK23還可能參與鉀離子在體內(nèi)的分配。如前所述，在低鉀條件下，ZmCIPK23過表達促進鉀離子玉米莖中的積累[29]。但是，在干旱脅迫下，玉米幼苗細胞膜鉀轉(zhuǎn)運蛋白基因的時空表達模式以及活性調(diào)控機制尚未見報道。

3 可溶性糖濃度的變化

在植物的生命周期中，種子萌發(fā)和早期幼苗生長的物質(zhì)基礎(chǔ)來自胚乳的貯存物質(zhì)。淀粉是玉米種子的主要貯存物質(zhì)。在種子萌發(fā)成苗過程中，胚乳中貯存的淀粉分解，其產(chǎn)物可溶性糖(如蔗糖、葡萄糖和果糖等)轉(zhuǎn)運到胚的生長部位，供呼吸消耗，以及作為信號分子、代謝前體和滲調(diào)物質(zhì)[32]。在干旱處理下，玉米葉片的可溶性糖含量增加，是細胞重要的滲調(diào)物質(zhì)，隨著脅迫時間的延長，其含量持續(xù)降低，如干旱脅迫增加了玉米幼苗葉片和根部可溶性糖的含量[33]。復水后，葉片中的可溶性糖含量較復水前有所降低。在干旱條件下，不同玉米基因型的淀粉分解和轉(zhuǎn)運存在差異。干旱脅迫還降低胚乳貯存物質(zhì)向胚和幼苗的轉(zhuǎn)運數(shù)量，而且玉米干旱敏感基因型下降的比例大于非敏感型[34]。在滲透脅迫下，萌發(fā)率受影響較小的鄭單958和遼單565有較高的貯存物質(zhì)轉(zhuǎn)運率，而萌發(fā)受影響較大的品種則有非常低的轉(zhuǎn)運率[19,35]。胚乳貯存物質(zhì)的轉(zhuǎn)出率無疑將影響胚和幼苗中的可溶性糖濃度，進而影響滲透勢。

種子胚乳中物質(zhì)的運出率與淀粉酶的活性有關(guān)[20]，也與蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活性密切相關(guān)[32]。在干旱條件下，萌發(fā)種子的淀粉酶活性減低[20]。比較6個玉米雜交組合，在水分脅迫下仍然保持較高的發(fā)芽勢和發(fā)芽率的組合，有較高的貯存物質(zhì)轉(zhuǎn)運率和較高的淀粉酶活性[20]。玉米胚乳中的糖向胚中的運輸受質(zhì)膜蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白(Sucrose Transporters,SUCs或SUTs)的調(diào)節(jié)。玉米苗期早期應(yīng)答干旱的基因ZmERD6，屬于MFS家族的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白亞族，其表達受干旱脅迫和外源ABA處理的誘導[36]。屬于蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白低親和、高轉(zhuǎn)運能力SUT4亞族的玉米ZmSUT4基因也已被克隆[37]，磷酸蔗糖合成酶也參與葉片中可溶性糖含量的調(diào)節(jié)[38]，但是這些基因在種子萌發(fā)期滲透調(diào)節(jié)中的調(diào)節(jié)和作用還有待研究。

4 可溶性蛋白、游離氨基酸、脯氨酸和甜菜堿

的積累

可溶性蛋白、游離氨基酸、脯氨酸和甜菜堿均屬于氨基酸或氨基酸的衍生物質(zhì)。它們是細胞的相容溶質(zhì)。在短期嚴重干旱的情況下，它們不是植物的主要滲調(diào)物質(zhì)，但隨著干旱期的延長，它們對于植株抗旱性的貢獻逐漸加大，不僅作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，而且起保護和穩(wěn)定其他蛋白和細胞膜、清除活性氧的作用[23]。

在玉米種子的萌發(fā)成苗階段，干旱脅迫誘導可溶性蛋白和氨基酸類物質(zhì)的積累。3葉期玉米幼苗停水處理12 d，葉片可溶性蛋白達13 mg/g[39]；在聚乙二醇(PEG)脅迫下，葉片可溶性蛋白與對照相比增加41.6%[40]。但是較長時間的干旱脅迫將導致可溶性蛋白含量下降。在干旱脅迫時積累的可溶性蛋白中，包括胚胎發(fā)育后期豐富蛋白(Late Embrygenesis Abundant Protein,LEA)[41]。LEA蛋白是一大類耐熱可溶性、親水性小分子蛋白質(zhì)，具有滲透調(diào)節(jié)、保護生物膜、猝滅金屬離子、清除活性氧等功能，它們基本上位于細胞質(zhì)和細胞核區(qū)域。根據(jù)氨基酸序列和相應(yīng)的mRNA同源性，可將LEA蛋白分為6組(家族)，其中第一組的Emb564[41]、第二組的Rab17[42]、第三組的Mlg3[42]和ZmLEA3[43]、第四組的LEA 4[44]、第五組的ZmLEA5C[45]蛋白都在干旱脅迫下的玉米中表達。在滲透脅迫下，玉米幼苗根系中還產(chǎn)生63.5 kDa的熱穩(wěn)定蛋白[46]，其具體類別和功能還有待研究。

在干旱脅迫下，正在萌發(fā)的種子中的游離氨基酸含量增大[47]。隨著干旱脅迫程度的加重和時間的延長，玉米幼苗根系的脯氨酸含量呈現(xiàn)出先升后下降的趨勢[48]。3葉期玉米幼苗干旱處理12 d，葉片脯氨酸含量可達414 μg/g，比停水前增加約4倍[39]。在PEG脅迫下，3葉期玉米幼苗葉片脯氨酸含量增加51.63%，含量約達1.9 μg/g[40]。有研究表明，滲透脅迫下脯氨酸的產(chǎn)生與積累有ABA依賴型和非ABA依賴型2種途徑[49]。在干旱脅迫下，抗旱性強的玉米葉片中甜菜堿含量隨著干旱脅迫的加強，其增加的幅度較大，而抗旱性弱的品種增加幅度較小[50]，而且，外源噴施0.5 mmol/L的甜菜堿溶液能緩解玉米幼苗的干旱傷害，增大葉片相對含水量[51]。

目前已經(jīng)從玉米中鑒定到細胞膜中轉(zhuǎn)運氨基酸和寡肽的轉(zhuǎn)運蛋白，如氨基酸/生長素通透酶(AAAP)[52]、ZmPOT[53]、寡肽轉(zhuǎn)運蛋白基因(ZmOPT0212)[54]。不過，這些轉(zhuǎn)運蛋白在干旱脅迫下的表達情況及與游離氨基酸積累的關(guān)系尚未見報道。

5 滲透調(diào)節(jié)的ABA調(diào)節(jié)

ABA是影響植物滲透調(diào)節(jié)能力的重要激素，外施ABA可以提高玉米葉片的水勢，增大脯氨酸和甜菜堿含量[55]；在滲透脅迫下,外施ABA可顯著提高脯氨酸含量，對可溶性糖含量有一定的影響，對游離氨基酸總量[56]和K+的影響不大[57]。

外源ABA誘導玉米V-ATPase亞基A(ZmVHA-A)和亞基B(ZmVHA-B)基因的表達[58]，而V-ATPase促進溶質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運。磷脂酶D/C(PLD/PLC)、Ca2+/CAM可能參與了外源ABA促進脯氨酸積累的信號傳遞。其中，磷脂酶D(PLD)也可水解磷脂產(chǎn)生磷脂酸(PA)，后者通過影響蛋白激酶和蛋白磷酸化酶等調(diào)控ABA信號轉(zhuǎn)導途徑[59]。ABA還促進受滲透脅迫和水楊酸(SA)誘導的玉米幼苗根系中的63.5 kDa熱穩(wěn)定蛋白基因的表達[46]。

ABA的合成、分解和信號通路影響植物的滲透調(diào)節(jié)能力。玉米的ZmNCED1是ABA生物合成過程中的關(guān)鍵基因，而ZmCYP707A2是ABA分解代謝的重要基因[60]。在玉米種子低溫萌發(fā)過程中，外源水楊酸和H2O2的協(xié)同處理下調(diào)ZmNCED1基因的表達，上調(diào)ZmCYP707A2的表達[60]，前者和ZmAO2(擬南芥AAO3的同源物)在滲透脅迫下玉米幼苗的冠根和種子根中顯著上調(diào)[61]，促進ABA的生物合成。

ABA可直接調(diào)節(jié)的PYR1/PYL/RCARs相關(guān)基因也是滲透調(diào)節(jié)能力形成的關(guān)鍵因子。研究表明，玉米含有13個PYL家族成員(ZmPYL1-13)，利用368個玉米自交系的關(guān)聯(lián)分析確定ZmPYL8和ZmPYL12與抗旱性具有顯著相關(guān)性[62]。ABA的信使蛋白編碼基因ZmSnRK2.1和ZmCPK11分別編碼蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶和鈣依賴性蛋白激酶，在滲透脅迫下被上調(diào)表達[63]。SNF1相關(guān)蛋白激酶2(SnRK2)是ABA信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者[64]，另有研究表明，在玉米幼苗期，14個SnRK2s中的ZmSnRK2.7和ZmSnRK2.11在由高鹽引起的滲透脅迫下相對上調(diào)[61]。一些轉(zhuǎn)錄因子，包括MYB/MYC、NAC、WRKY和鋅指蛋白也被鑒定為植物滲透脅迫響應(yīng)因子，這些轉(zhuǎn)錄因子已被證實在鹽脅迫下上調(diào)表達[61]。在干旱脅迫下，這類轉(zhuǎn)錄因子參與ABA的信號轉(zhuǎn)導途徑[65-67]。

6 滲透調(diào)節(jié)的相關(guān)基因

在干旱脅迫下，玉米蛋白激酶基因ZmPtil、ZmPtil-1、ZmCIPK2的表達上調(diào)，轉(zhuǎn)ZmPtil基因的玉米植株相對含水量、可溶性糖和脯氨酸含量分別比對照高7.3%、2.5%和22.7%[68]。腺苷甲硫氨酸合成酶基因ZmSAMS1在玉米幼苗的根、莖、葉中的表達，在干旱和高溫脅迫下表達量有較大幅度的上調(diào)[69]，從而合成較多的多胺和亞精胺，參與環(huán)境脅迫的防御[70]。植物中廣泛存在的一種C2H2型鋅指蛋白參與植物的脅迫應(yīng)答反應(yīng)和生長發(fā)育調(diào)控過程，玉米中的該類轉(zhuǎn)錄因子ZmC2H2-1基因表達受干旱和ABA等抑制，過表達該基因的擬南芥葉片失水速率更快，可能是玉米滲透調(diào)節(jié)的負調(diào)控基因[71]，其在種子萌發(fā)過程中的表達行為尚不清楚。

同源異型-亮氨酸拉鏈(HD-Zip)轉(zhuǎn)錄因子和C2H2在植物中的功能相似，調(diào)節(jié)植物的發(fā)育過程和脅迫響應(yīng)[72]。玉米中HD-Zip家族的大部分基因序列與擬南芥和水稻的具有很大的相似性。Mao等對玉米中HD-Zip蛋白基因進行表達分析，結(jié)果表明：55個該基因隨機分布在10條染色體上，具有15個節(jié)段重復和4個串聯(lián)重復事件，這表明節(jié)段重復是玉米HD-Zip家族結(jié)構(gòu)差異的主要貢獻者。而且，這4個類別的蛋白基因在不同組織和干旱條件下表達水平和模式存在差異[73]。對玉米、水稻、擬南芥、葡萄和葡萄球菌的HD-Zip蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析表明，可以分為四類(Ⅰ～Ⅳ)，其中Ⅰ類和Ⅲ類蛋白的拷貝數(shù)相對保守[73]。其中，HD-Zip Ⅰ在玉米中有17個，絕大部分的啟動子區(qū)域均含有一至多個抗逆相關(guān)順式作用元件，12個HD-Zip Ⅰ在干旱脅迫下表達顯著上調(diào)，其余5個表達下調(diào)。從中鑒定到的Zmhdz10基因表達受鹽脅迫和ABA誘導，在滲透脅迫下該轉(zhuǎn)基因水稻有較高的脯氨酸含量[74]。然而，這類基因在玉米種子萌發(fā)過程中的表現(xiàn)尚未見研究。

7 問題與展望

滲透調(diào)節(jié)是玉米種子在干旱脅迫下萌發(fā)成苗的關(guān)鍵生理過程。研究表明，玉米幼苗不同部位對干旱脅迫的敏感性不同，葉片最容易受到干旱脅迫的影響，根系次之，中胚軸再次之，莖最不敏感[75]，但是，對于這些部位滲透調(diào)節(jié)能力的差異研究還不夠深入。研究表明：不同玉米基因型的滲透調(diào)節(jié)能力存在顯著差異，但是過去我們更多地關(guān)注了是具體滲調(diào)物質(zhì)含量的差異，而不是產(chǎn)生這種差異的原因。在玉米萌動種子和幼苗中，參與滲透調(diào)節(jié)的物質(zhì)有無機離子、可溶性糖、可溶性蛋白、游離氨基酸、脯氨酸和甜菜堿等。其中對于無機離子的研究還比較薄弱，我們還需要更多地了解萌動期無機離子的轉(zhuǎn)運和再分配的機制，以及與有機滲調(diào)物質(zhì)的平衡。對于有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在種子萌發(fā)成苗階段，它們都主要來自胚乳貯存的物質(zhì)，因此其含量受這些有機物質(zhì)之間相互競爭和轉(zhuǎn)化的影響。不同類別滲調(diào)物質(zhì)之間的比例對抗旱性的影響，這種比例變化與干旱脅迫程度和進展，以及與萌發(fā)成苗的階段、不同部位的關(guān)系，受何種機制的調(diào)節(jié)也值得研究。對于某一類滲調(diào)物質(zhì)，其合成、降解、運輸都影響其在局部的含量，這些過程涉及到的酶和轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因，盡管已經(jīng)有一些了解，但是還缺乏系統(tǒng)性的認識。