郭子霞 安子璇 張健美 張丹參

1 河北北方學院藥學系，張家口，075000，中國

2 河北科技大學，石家莊，050018，中國

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）與克羅恩病臨床表現(xiàn)比較相似，兩者均屬于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）。病程漫長，可分為活動期和緩解期，常反復發(fā)作。臨床表現(xiàn)為體重減輕、腹痛、腹瀉、黏液膿血便等。雖然我國發(fā)病率低于歐美地區(qū)，但現(xiàn)有逐年上升趨勢。病因尚未明確，與遺傳、免疫、腸道菌群、環(huán)境、精神心理多因素相關。環(huán)境因素作用于遺傳易感者，在腸道菌群的參與下，啟動免疫或非免疫系統(tǒng)，導致免疫炎癥反應。此外，疾病反復發(fā)作、病程漫長也對病人心理產生影響從而又促使復發(fā)。多個因素相互交叉，共同促使疾病發(fā)生。病理機制大致為內外因素使腸道上皮屏障受損，使得腸道菌群易通過屏障并啟動抗原識別，經(jīng)多條炎癥通路引發(fā)免疫反應異常，最終造成UC。幾條炎癥通路涉及多種細胞、蛋白、細胞因子，同時還與基因相關。其中免疫細胞包括抗原提呈細胞、T 輔助細胞（T help，Th）、調節(jié)性T 細胞（regulatory T，Treg）、自然殺傷T 細胞（natural killer T，NK-T）等［1］。細胞因子，如白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、IL-24、IL-31、IL-34和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），被認為是UC 免疫發(fā)病機制中的關鍵介質，這些分子驅動免疫和非免疫細胞的激活，從而促進結腸上皮損傷誘發(fā)疾?。?］。

現(xiàn)今，UC 的治療手段主要為藥物治療。中藥方面主要為復合方劑，西藥方面主要為5-氨基水楊酸、免疫抑制劑等。目前用于治療UC 的藥物并不是對所有患者均有效，并且長期服用具有較大的副作用，因此大量研究用于探究新藥物或活性物質對UC 的療效，以期為該病的治療提供更多、更好的選擇。新藥研究需要動物模型，因此選擇合適的造模方法對于疾病的研究和治療也至關重要。因此本文介紹評價常用的造模方法，并綜述藥物在動物模型或人體UC 的治療機制。

1 造模方法

將造模方法根據(jù)作用機制進行分類，并介紹最常用的幾種方法的特點。研究者可根據(jù)研究目的選擇合適的造模方法。

1.1 化學損傷法

化學損傷法以化學刺激的方式損傷腸道，破壞機械屏障引發(fā)炎癥，主要制備急性模型，用于治療UC 新藥的篩選。最常用的化學損傷法包括：葡聚糖硫酸鈉法和乙酸法，此外還有角叉菜膠法、過氧化亞硝酸鈉法和主要用于研究尼古丁或肝素治療機制的碘代乙酰胺法等。

1.1.1 自由飲葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）法

實驗動物多為大鼠、小鼠。造模方法多為實驗動物自由飲用一定濃度DSS 溶液，也有研究者采用灌胃的方法。衡宇等［3］使用DSS 對小鼠實施灌胃，與自由飲組相比，疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）和組織學損傷評分均較高但差異無統(tǒng)計學意義，灌胃組的兩項指標的變異系數(shù)均小于自由飲組。兩組結腸鏡下均可見多灶性小潰瘍、黏膜缺失、隱窩受損變形、杯狀細胞減少。灌胃可避免動物攝取DSS 過量致死，并且可根據(jù)小鼠體重調整給藥劑量，給藥方案靈活，所需試劑也比自由飲少，但操作相對自由飲復雜，實驗中不常用。多采用3%～5% DSS 溶液自由飲7～9 天的方法制備急性UC 模型，一般所用濃度越高造模所需天數(shù)越少。與乙酸法造模1～2 天動物便出現(xiàn)稀便、體重減輕現(xiàn)象不同，DSS 法隨著自由飲天數(shù)的增加，小鼠的DAI、病理變化逐漸加重，第3 天才出現(xiàn)腹瀉，第4 天才出現(xiàn)體重下降，并且病癥維持時間較長［4］。慢性UC 造模時間較長，多令實驗動物交替自由飲DSS 溶液與無菌水，要經(jīng)歷多個周期。也有研究者［5］將三硝基苯磺酸（trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS）與DSS 聯(lián)用，先用TNBS 灌腸首次誘導，之后再自由飲DSS 兩次誘導復發(fā)制備慢性模型。兩次用DSS 后，DAI 均較之前升高，可模擬人類疾病復發(fā)的現(xiàn)象。造模第21 天，單用TNBS 組：之前損傷的黏膜得到修復，炎癥細胞由浸潤至肌層到局限于黏膜層，并且無明顯潰瘍；而加用DSS組：結腸黏膜存在瘢痕、肉芽腫，仍可見潰瘍并且腸壁增厚，形成了慢性炎癥。而且該法比單純使用DSS 制備慢性模型所需時間短，但該實驗未繼續(xù)觀察此慢性模型病理情況能維持多久，是否容易自愈。

該法多用于新藥的篩選，探究活性物質治療UC 的機制，動物實驗模型中較為常用。可單獨使用，也可與其他試劑聯(lián)用，同時通過調整使用方案既可用于急性造模又可用于慢性造模。所造模型具有：結腸明顯縮短、黏膜層及黏膜下層有大量炎癥細胞浸潤、黏膜糜爛有潰瘍、杯狀細胞減少、隱窩受損但仍可見等特點，與人類UC 結腸病變特點類似。操作簡單，模型易復制，但飲用劑量不可控，模型病理學差異較大，且試劑價格較貴。

1.1.2 乙酸法

實驗動物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、犬等。其中多用大小鼠及家兔，大鼠和家兔因體型相對較大，灌腸造模操作上更方便。一般與其他試劑或方法聯(lián)用，病變維持時間相對較長。有研究者［6］將異體抗原乳化液與乙酸聯(lián)用，所制備模型的DAI、結腸黏膜損傷指數(shù)（colon mucosal damage index，CMDI）、病理組織學評分（histological score，HS）等在造模后14 天與正常對照組相比均仍有顯著差異。王海強［7］將二硝基氯苯（dinitrochlorobenzene，DNCB）與乙酸聯(lián)用所制得的模型的DAI 在造模后14 天也與正常對照組相比有顯著差異，并且仍有腸黏膜病變，如潰瘍、炎癥細胞浸潤、杯狀細胞減少等存在。以上提示乙酸可考慮與其他方法聯(lián)用，以延長病變時間制備慢性模型。另外，也可單用乙酸灌腸制備急性模型，適用于只需短期觀察的研究。因結腸滴注乙酸引起的炎癥反應強烈，所以病變出現(xiàn)快、所需造模時間短，灌腸24 h 后便可觀察到模型腸黏膜明顯壞死，黏膜及黏膜下層有炎性細胞浸潤，并且DAI 和宏觀評分及結腸組織髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量也顯著升高［8］。使用的乙酸濃度為3%～10%不等，濃度過高會造成腸黏膜壞死剝落，甚至導致死亡。孫茂慶［9］發(fā)現(xiàn)8%的乙酸對新西蘭兔腸黏膜損傷嚴重，10%的乙酸致死率高，但有研究者使用8%、10%乙酸對大、小鼠灌腸成功造模，并未觀察到致死現(xiàn)象，因此猜測可能與物種及給藥量或操作等有關。

乙酸是一種有機弱酸，可破壞腸道黏膜屏障，影響炎癥因子釋放，最終誘發(fā)潰瘍。該法是篩選具有抗結腸炎活性藥物的有益工具［8］。與DSS 相比，乙酸可導致較嚴重的炎癥反應，使結腸黏膜上皮細胞大量壞死脫落、黏膜彌漫性出血、伴有糜爛潰瘍、隱窩結構消失，并且炎癥細胞浸潤可達肌層。多與其他方法聯(lián)合使用構建UC 模型，也可單獨使用。單獨使用操作簡單，造模時間短，重復性好，但炎癥維持時間短，動物易自愈，不適合構建慢性模型。

1.2 抗原免疫法

該類方法主要使用半抗原性化學試劑或異體抗原，這些半抗原性化學試劑可與組織大分子結合形成抗原誘發(fā)模型的免疫反應異常導致UC。該類模型比化學損傷類病變維持時間長，可考慮用來制備慢性模型。半抗原性化學試劑主要有TNBS、二硝基苯磺酸（dinitrobenzene sulfonic acid，DNBS）、噁唑酮（oxazolone，OXZ）、DNCB 等，異體抗原法主要有同種異體抗原種植法及兔結腸黏膜組織致敏法，前者需手術操作，不常用。

1.2.1 TNBS 法

實驗動物多為大小鼠。TNBS 法對動物的損傷比較嚴重，有出現(xiàn)動物死亡的現(xiàn)象，原因主要可能為腸梗阻或腸穿孔［10］。多用50%乙醇的TNBS 溶液（100 mg·kg-1）灌腸一次制備急性模型，結腸肉眼可見黏膜充血水腫、糜爛、形成潰瘍；鏡下觀察少數(shù)動物的潰瘍甚至可達肌層，上皮細胞壞死脫落，黏膜下層炎癥細胞浸潤，隱窩受損有膿腫形成。且病變維持時間比化學誘導法長，灌腸后14 天組織病理學評分、結腸黏膜評分及促炎因子TNF-α和IL-1β仍均顯著高于正常組［11］。有研究者分別用TNBS 和DSS 誘導大鼠造模，發(fā)現(xiàn)前者損傷可很快達結腸肌層，使其厚度顯著增加并存在大量巨噬細胞浸潤，但炎癥組織中的IL-4 濃度基本無變化；而DSS 誘導的病變局限于黏膜及黏膜下層，雖最后外肌層也可見巨噬細胞但顯著低于TNBS 組，但炎癥組織中IL-4、TNF-α顯著升高［12］。這些提示與DSS 不同，TNBS 誘導模型的機制與IL-4 介導的Th2 反應無關，更類似于克羅恩病的發(fā)病機制。TNBS 溶液多次灌腸可制備慢性模型。李燕舞［13］10 周內用TNBS 對大鼠多次灌腸，雖稀便血便情況較造模第3 天有所改善，但10 周后，病理檢查模型結腸仍有炎癥存在，有炎癥細胞浸潤，體質量也低于正常組，該模型可模擬炎癥轉向慢性的過程。

該法誘發(fā)的模型無需預先致敏動物，操作簡便，造模時間短，病變持續(xù)時間相對較長，可體現(xiàn)急性轉向慢性的過程，實驗花費較少。但TNBS 有毒且易爆，使用時危險性較高，動物死亡率高，并且病理改變及機制更類似于克羅恩病。

DNBS 法與上述方法類似，但DNBS 比TNBS 毒性小、價廉、臨床病理表現(xiàn)與人類UC 相似，主要用于UC 免疫學的研究。

1.2.2 OXZ 法

該法造模相對TNBS 較復雜，分兩個階段，先背部或腹部皮膚涂抹致敏，數(shù)天后灌腸制得［14］。與TNBS法相比，OXZ 可誘發(fā)快速起病的結腸炎，可使動物血清中Th2 細胞因子IL-4、IL-13 明顯升高，并且受影響的區(qū)域主要為遠端結腸，直腸病變較嚴重。主要累及黏膜層、黏膜下層而非TNBS 法誘導的泛結腸炎，可見零散的潰瘍點及糜爛，黏膜充血、水腫，病變呈連續(xù)性分布，病理改變及發(fā)病機制與人類UC 相似［15］。TNBS 造模動物毛色、精神狀態(tài)、大便形態(tài)比OXZ 法差，但結腸出現(xiàn)充血、潰瘍等病癥較輕。OXZ 法同樣有致死現(xiàn)象，Zhang［16］發(fā)現(xiàn)在給予OXZ 3 天后動物開始發(fā)生死亡，最后死亡率高達41.7%。將OXZ 與TNBS 聯(lián)用可制得慢性模型，有研究者［17］先用OXZ 涂抹致敏，之后分別用OXZ、TNBS 灌腸，結果顯示模型維持時間長，2 個月后肉眼仍可觀察到彌漫性潰瘍，能模擬人類UC 發(fā)病特點，可考慮用于UC 的治療研究。

1.3 菌群法

菌群法模型用于研究菌群對UC 的影響，或藥物對UC 患者腸道菌群的作用。該法主要使用大腸桿菌破壞腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)誘發(fā)UC，也有人使用真菌白色念珠菌誘發(fā)模型研究藥物在UC 中的抗真菌作用［18］。

大腸桿菌法比一般方法需要的造模時間長，開始出現(xiàn)稀便血便的時間長，可導致黏膜充血水腫形成淺表潰瘍，并且很少出現(xiàn)致死情況。丁潔［19］比較TNBS法和大腸桿菌法發(fā)現(xiàn)，兩者雖DAI、CMDI 等評分無顯著性差異，但菌群法誘導的模型精神狀態(tài)、大便情況逐漸加重，癥狀持續(xù)至動物處死前，黏膜形成淺表潰瘍、腸壁增厚、并可見假息肉樣微隆起性病變、腸壁增厚，潰瘍形成率隨時間而增加。該法病理發(fā)展過程、病變情況更類似自然發(fā)生。此法操作簡單，抗原來源方便，成本低，成功率高，模型癥狀和菌群失調引起的發(fā)病機制與人類相似，可用于病因及機制以及治療藥物的研究。但實驗周期長，需制備細菌懸液［20］。

1.4 基因法

有基因敲除和轉基因兩種方式，該類模型可研究特定基因的影響，使研究更具針對性，便于研究病因及用于新藥研究。但模型造模要求高，不易操作，成本高，不適用于藥物的篩選，目前實驗研究中使用不廣泛。

2 信號通路

通過總結近幾年來關于中西藥及有關活性物質的療效及機制研究，篩選出其中較為重要的幾種信號通路。下面闡述它們與UC 的關系，并介紹影響相關通路的藥物研究進展。

2.1 JAK/STAT 信號通路

JAK/STAT 信號通路包括酪氨酸激酶相關受體、酪氨酸激酶（tyrosine kinase，JAK）和信號傳導及轉錄激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）。JAK 是一種非跨膜的酪氨酸蛋白激酶，既可催化相結合的細胞因子受體被酪氨酸磷酸化，又可磷酸化激活含特定SH2 區(qū)的信號分子。蛋白家族包括JAK1～JAK3 和TYK2，其中JAK3 表達局限于造血系統(tǒng)細胞，其他成員普遍表達。STAT 為JAK 的底物，包括STAT1～STAT6。該信號通路的基本過程為：相關細胞因子、生長因子等與細胞膜上相關受體結合后可使其發(fā)生二聚化，之后JAK 與受體結合，JAK 經(jīng)過自磷酸化和轉磷酸化將相關受體鏈磷酸化，形成STAT 對接位點以磷酸化STAT，后者在胞質內配對形成同源或異源二聚體并轉至細胞核內，在核內與DNA 中特定的STAT 結合序列結合而發(fā)揮轉錄因子的作用，實現(xiàn)將信號從胞外轉至核內［21］。根據(jù)配體和受體的不同，不同組合JAKs 和STATs 被高度特異性激活，并調節(jié)基本的生物學過程，包括各種細胞類型（T 細胞、B 細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、上皮細胞）的凋亡、增殖、遷移、發(fā)育和分化。超過50 種細胞因子和生長因子是通過JAK/STAT 途徑介導發(fā)揮生物學效應的［22］，因此，抑制一個或多個JAKs 或STATs 可能導致多種細胞因子途徑被抑制，產生多種影響。

該通路的許多途徑與腸內穩(wěn)態(tài)和炎癥性腸病有關。轉錄組數(shù)據(jù)分析表明［23］與非炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）研究對象比，活動性UC 患者腸黏膜四種JAK 轉錄體均顯著上調，此外有研究［24］表明敲除JAK3 基因的小鼠對DSS 誘導的UC 易感性增加。IBD 發(fā)病的重要特征為炎癥通路被過度激活或自我耐受能力受損，如效應T 細胞增強、Treg 細胞調節(jié)功能受損［22］。促炎因子IL-6、IL-23、IL-12 和IL-21 等可增強效應T 細胞轉錄，故這些因子對IBD 有重要影響，而這些因子的激活需要通過JAK/STAT 信號通路。IL-12和IL-23 共同受體鏈（IL-12R）與細胞膜表面糖蛋白130（glycoprotein 130，gp130）受體鏈高度同源，并通過JAK2 和TYK2 發(fā)出信號，隨后IL-12 主要通過誘導STAT4 同型二聚體發(fā)揮作用；IL-23 通過STAT3 和STAT4 發(fā)揮作用［22］。IL-6 與IL-12、IL-23 類似，先與細胞表面IL-6 受體結合形成復合物后，活化gp130，激活JAK 并與STAT3 結合，調控炎癥因子表達，阻止炎癥細胞凋亡，促進其增殖引發(fā)炎癥［25］。STAT3 在UC中較為重要，小鼠體內過度激活會引起嚴重的結腸炎，將其抑制可誘導固有層細胞凋亡改善結腸炎。研究表明許多中藥或其活性成分通過影響IL-6/JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮治療UC 的作用，如黃芩湯、馬齒莧多糖、山姜素。理論上，JAK 抑制劑、STAT 抑制劑均可影響JAK/STAT 通路用于治療IBD，但由于此通路涉及的細胞因子及調控的生理功能較多，抑制劑可能會對機體產生其他影響，如JAK 抑制劑會影響血液系統(tǒng)，使肌酸激酶、肌酐等升高，有潛在致畸性。托法替尼（tofacitinib）是目前唯一批準用于臨床治療UC 的JAK抑制劑，用于治療中重度UC，通過抑制JAK1/JAK3二聚體受體信號，從而抑制TNF、IFN-γ，減少IL-6 和趨化因子生成、T 細胞增殖，達到治療的目的［26］。關于STAT 抑制劑，迄今無針對IBD 治療的實驗研究，因STAT3 參與一些維持腸道穩(wěn)態(tài)的因子的信號傳遞，故以STAT3 為靶點會帶來與疾病相關的風險。STAT4 與IL-12、IFN-γ和IL-23 有關，STAT4 過度激活導致小鼠Th1 細胞介導的自發(fā)性結腸炎，STAT4 的缺失部分緩解了實驗性結腸炎的發(fā)生，因此STAT4 可能為治療UC的理想靶點。

2.2 TLRs/MyD88 信號通路

在免疫反應中，Toll 樣受體（toll-like receptor，TLR）作為一種模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）十分重要，由胞外段、跨膜區(qū)、胞內段組成，胞內段為Toll/IL-1 同源結構域，其結構與人IL-1 受體（IL-1R）胞內結構相似。它們可識別表達在微生物上的病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），如細菌細胞壁的脂磷壁酸、脂多糖。髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）為TLR 的接頭蛋白，有三個功能區(qū)，分別為與IL-1R 相關激酶（IL-1R-associated kinase，IRAK）死亡區(qū)結合的N端死亡區(qū)、與TLR 結合的羧基末端、類似于IL-1R 胞質區(qū)的Toll 區(qū)的C端。TLR識別并與PAMPs 結合后發(fā)生二聚化，與MyD88 羧基末端結合，招募絲氨酸激酶IL-1 受體相關激酶IRAK1、IRAK2 導致其磷酸化，之后IRAK 與MyD88 分離而與腫瘤壞死因子相關受體6（tumor necrosis factor associated receptor 6，TRAF6）結合，在TAK-1 結合蛋白-1（TAK-1 binding protein，TAB-1）和TAB-2 介導下結合并激活MAP3K家族的TAK-1?；罨腡AK-1 經(jīng)MPAK 通路可磷酸化MPAK，激活轉錄因子進核，調控TNF-α、IL-1 等炎癥因子轉錄；經(jīng)NF-κB 通路使NF-κB 抑制蛋白激酶（inhibitory protein kinase，IPK）磷酸化導致I-κB 磷酸化并與NF-κB 解離，促使NF-κB 從胞內轉至核內與DNA 結合位點結合誘導產生促炎因子、生長因子、趨化因子等。多種miRNA 的表達依賴于NF-κB，可為該通路的調節(jié)因子，如miR-146a 和miR-21 在TLR 信號傳導中發(fā)揮負反饋調節(jié)，而miR-155 正反饋調節(jié)而促炎。

TLRs/MyD88 通路是UC 進展過程中一個重要的炎癥信號通路，參與免疫、結腸炎癥、氧化應激、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生等多種生物學過程［27］。其中TLR 在UC發(fā)病及藥物作用機制中十分重要，它最先識別腸道致病菌表面的PAMP，從而引起一系列炎癥反應。最近研究表明TLR 在UC 發(fā)病過程中被過度激活，可促使IL-2、IL-4、IL-5、IL-12 和IL-13 表達增強導致疾病發(fā)生［28］，但有些研究表明TLR 信號在腸道中也可限制炎癥反應并維持結腸內穩(wěn)態(tài)，如TLR9，它可能通過誘導Ⅰ型干擾素（即IFN-α/β）產生減輕炎癥，參與益生菌對實驗性結腸炎的保護機制。CD4+T 細胞在IL-12、IFN-γ作用下分化為Th1 細胞并分泌IFN-γ、IL-2，參與細胞免疫；在IL-4 作用下分化為Th2 細胞，分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13，參與體液免疫。研究發(fā)現(xiàn)UC 大鼠血清IFN-γ、IL-2 水平升高，IL-4、IL-10 水平降低，說明UC的發(fā)生可能與Th1/Th2 細胞失衡有關。沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）可通過TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路維持Th1/Th2 平衡，減輕DSS 誘導的UC［29］。Zhang 等人發(fā)現(xiàn)丁香葉環(huán)烯醚萜苷可降低8-OHdG、NOX1 和NOX2 等氧化物和促炎因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-12p40 的表達，劑量依賴性地抑制TLR2、TLR4、MyD88 和NF-κB p65 的蛋白和mRNA 水平，對DSS 誘導的實驗性結腸炎起到保護作用［27］。目前，尚無直接靶向TLRs、MyD88 的藥物，藥物可間接影響該通路發(fā)揮治療作用，如吲哚胺2,3-雙加 氧 酶1（indolylamine 2,3-dioxygenase 1，IDO1）。它在色氨酸代謝的第一步和速率限制步驟中催化L-色氨酸合成犬尿氨酸。IDO1 在全身廣泛表達，尤其在結腸腸組織中高表達。Shon 等［30］人發(fā)現(xiàn)IDO1 基因缺失或使用其抑制劑與對照組相比，可緩解DSS 誘導的實驗性UC 嚴重程度，并且IDO1-/-或IDO1+/+小鼠的基因表達譜有明顯差異。通過確定差異表達基因主要上游分子發(fā)現(xiàn)IDO1 缺乏導致TLR 和NF-κB 信號通路的下調，表明TLR-MyD88 信號通路在IDO1 對DSS誘導的結腸炎的發(fā)展起著至關重要的作用。Muc1 編碼黏蛋白，是宿主抵御入侵細菌的第一道防線，可能是TLR 信號的負調節(jié)因子，Muc1 表達減少嚴重影響上皮屏障功能，Shon 還發(fā)現(xiàn)IDO1 缺陷小鼠的Muc1 表達更高，提示IDO1 的缺失可能導致黏蛋白表達增加，進而下調TLR/MyD88/NF-κB 信號傳導。因此，IDO1可能是一個有望干預治療腸道疾病新靶標。Shon 認為IDO1 可能以不依賴于T 細胞的方式發(fā)揮炎癥作用，TNBS 誘導實驗性UC 主要是引發(fā)T 細胞依賴性的遲發(fā)性過敏反應，如使Treg 細胞反應下調，所以抑制IDO1 對TNBS 誘導的UC 無緩解作用，反而加重病情。有研究者［31］發(fā)現(xiàn)IDO1 抑制劑Epacadostat 參與T 細胞介導的炎癥反應，可使UC 小鼠Foxp3 活性升高，這提示其減輕UC 可能與Th17 細胞及Tregs 細胞的轉化平衡有關，并且提示Epacadostat 緩解UC 不只是簡單地抑制IDO1，還可能通過影響其它因子來發(fā)揮作用。所以IDO1 抑制劑有望成為治療UC 的新藥物。

2.3 PI3K/AKT 信號通路

磷酸化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）的肌醇環(huán)上有5 個可被磷酸化的位點，一般多磷酸化第4、5 位點，但PI3K 可轉移一個磷酸基團至位點3，將磷脂酰肌醇2 磷酸（phosphatidylinositol 2 phosphate，PIP2）轉化成磷脂酰肌醇3 磷酸（phosphatidylinositol 3 phosphate，PIP3），對細胞功能具有重要影響。絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（serine threonine protein kinase，AKT）對細胞存活及凋亡有重要影響，是PI3K 重要的下游分子，可通過N 端的PH 結構域與PIP3 結合。一些細胞因子如成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、胰島素等可激活受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK），使其自磷酸化，為PI3K 的調節(jié)亞基提供一個結合位點，并且募集一個接頭蛋白促進RTK 與PI3K 的結合。激活后的PI3K 可產生PIP3，作為第二信使與含有PH 結構域的AKT 結合。AKT在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（3-phosphoinositoldependent protein kinase 1，PDKI）和3-磷酸 肌 醇 依賴性蛋白激酶2（2-phosphoinositol-dependent protein kinase 2，PDK2）介導下，其蘇氨酸磷酸化位點（Thr308）和絲氨酸磷酸化位點（Ser473）被磷酸化而被激活，激活后的AKT 可經(jīng)多種途徑調節(jié)細胞的增殖、分化、遷移及凋亡。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其激活與多種復雜的信號通路有關。PI3K/AKT/mTOR 信號通路在調節(jié)細胞活化、炎癥反應、存活和凋亡中起著十分重要作用。據(jù)報道，抑制PI3K/AKT/mTOR 通路可能與結腸炎的治療有關［32］。研究表明，UC 患者體內mTOR 的異常激活，并且其抑制劑能緩解DSS 誘導的結腸炎。AKT 還可激活IκB 激酶（IκB kinase，IKKα）阻止I-κB 與NF-κB 解離，抑制NF-κB 從胞內轉至核內，從而減少IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子產生，緩解UC［33］。

許多天然物質中含有多酚，該類化合物具有抗氧化和抗炎活性，被廣泛用于研究治療自身免疫性疾?。?4］，可考慮用于UC 的研究。臨床上比較丹參多酚酸鹽與柳氮磺吡啶腸溶片對UC 患者的療效，發(fā)現(xiàn)前者治療效率高于后者，并且在常規(guī)治療基礎上加用丹參多酚酸鹽有利于提高UC 患者臨床療效［35］。關于丹參多酚的治療機制，Peng［36］等人發(fā)現(xiàn)其抑制TLR、PI3K、AKT、mTOR、NF-κB 發(fā)揮抗炎作用，使炎癥因子表達水平下調。此外，食物芒果中也含大量多酚。芒果多酚上調miRNA-126 的表達，而miRNA-126 可靶向PI3K 的調節(jié)亞基，抑制細胞因子對PI3K 的激活，調節(jié)該通路，減輕炎癥反應［37］。miRNA-126 能維持血管穩(wěn)態(tài)，在血管生成和修復中發(fā)揮重要作用。UC 患者易出現(xiàn)血液高凝的情況形成血栓，血小板聚集會引起血管微循環(huán)異常，因此，miRNA-126 應該可以改善UC 患者血小板聚集、病變組織淤血情況，促進潰瘍愈合。其他一些中藥活性成分如黃芩苷、黃芪多糖和中藥方劑也可通過PI3K/Akt 通路治療UC。

Rigosertib（RGS）是PI3K 和polo 樣激酶1（PI3K and polo like kinase 1，PLK1）的雙重抑制劑，通過抑制PI3K/Akt 通路誘導細胞凋亡，誘導細胞周期中的G2/M期停滯，抑制細胞增殖。RGS 具有抗腫瘤特性，已被證明通過下調人癌細胞系Ras/PI3K/AKT 信號軸誘導細胞凋亡［38］，目前用于研究治療骨髓增生異常綜合征。之前已有研究通過使用PI3K 抑制劑Wortmannin 證實了抑制PI3K/Akt 信號通路對于UC 的治療效果［39］。研究者［40］發(fā)現(xiàn)RGS 對UC 也有治療效果，通過抑制PI3K/AKT 通路下游的促炎癥和促纖維化靶基因（Col1a1、Col1a2、Acta 2），減輕炎癥反應和結腸纖維化，同時預防結腸炎相關結直腸癌的發(fā)生。因此，PI3K 抑制劑有望用于治療UC。

2.4 IL-33/ST2 軸

細胞因子白細胞介素33（interleukin-33，IL-33）又稱IL-1F11，與IL-1 和IL-18 同屬IL-1 家族，在多種細胞中表達，參與調節(jié)免疫應答反應。IL-33 是Th2 細胞的趨化劑，用IL-33 刺激Th2 細胞可誘導典型的Th2細胞因子IL-4、IL-5 和IL-13 產生。IL-33 參與Th2 反應，而后者被認為在UC 的免疫反應中起關鍵作用，提示IL-33 可能參與UC 疾病進程。Seidelin［41］等發(fā)現(xiàn)與靜止期患者和對照組相比，活動期UC 患者結腸上皮細胞中IL-33 在mRNA 和蛋白質水平上均顯著上 調。ST2 又稱IL-1 受 體樣1（IL-1 receptor-like 1，IL1RL1），是Toll 樣/IL-1 受體（TLR/IL-1R）超家族成員。ST2 有兩種形式，分別為跨膜受體形式（ST2L）和缺乏跨膜結構的可溶性形式（sST2），前者為IL-33 的受體，后者是前者的誘餌受體，可調節(jié)IL-33 介導的活性，從而阻斷IL-33 信號通路傳導。IL-33 通過與由ST2 和共受體IL-1 受體輔助蛋白（IL-1 receptor helper protein，IL1RAcP）組成異二聚體受體形成復合物發(fā)揮作用。該復合物可募集MyD88 和TRAF6，從而激活炎癥因子NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）p38、信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和JUN N-末端激酶（jun N-terminal kinase，JNK）、PI3K/AKT、JAK2和SYK。這些炎癥因子及信號通路均參與UC，因此IL-33/ST2 軸可能也與UC 有關。

UC 患者體內IL-33、ST2 的表達與正常人有所不同。健康結腸中，IL-33、ST2 主要由黏膜上皮細胞產生。但在炎癥情況下，黏膜上皮細胞和固有層細胞均表達IL-33，而上皮細胞不表達ST2，只有固有層細胞表達。TNF-α能誘導結腸上皮細胞產生IL-33，并且有實驗證明抗TNF-α治療后可明顯改善UC 患者血清IL-33 升高的情況［42］。Sedhom［43］發(fā)現(xiàn)經(jīng)DSS 處理，與野生型小鼠相比，ST2 缺失的小鼠UC 發(fā)病率低，病癥較輕，這說明ST2 通路的參與導致結腸炎加重，阻斷IL-33/ST2 途徑可以促進小鼠黏膜愈合，并且黏膜傷口愈合也可限制微生物移位，共同改善實驗性結腸炎。以上均提示抑制該通路可緩解UC 病癥。并且多項研究表明IL-33/ST2 軸可被多種阻斷抗體調控，因此可作為治療IBD 的理想靶點，但目前缺乏針對性的藥物。茯苓多糖通過調控IL-33/ST2 通路，抑制其激活從而減少肥大細胞活化，降低炎癥細胞浸潤程度達到治療UC 的效果［44］。黃芩苷也可通過抑制IL-33，減輕DSS 誘導的小鼠UC。此外，一些中藥復方如化濁解毒方、四君子湯、益氣愈潰湯等也可通過調控IL-33 來治療UC。

2.5 Notch 信號通路

Notch 信號通路經(jīng)相鄰細胞間的相互作用來調節(jié)細胞、組織、器官的分化，主要由DSL 蛋白（Notch 配體）、Notch 受體、CSL-DNA 結合蛋白組成。在哺乳動物中Notch 配體主要有5 種，Notch 受體共有4 種，為Notch 1～Notch 4。每個受體可分為三部分，分別為膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內區(qū)，其中膜外區(qū)負責與配體結合啟動Notch，有S1、S2 兩個裂解位點；跨膜區(qū)有一個裂解位點S3 位點，斷裂為胞內區(qū)ICN 和一個短的跨膜片段；胞內區(qū)主要分為：可與DNA 結合蛋白結合的RAM 區(qū)、介導Notch 與其他蛋白結合的Notch 增強子（ANK）、核定位信號（nuclear localization signal，NLS）、翻譯啟動區(qū)（translation start-up area，TAD）、和與Notch 降解有關的富含脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸殘基序列的區(qū)域。這些Notch 受體在細胞外和細胞質末端有細微的差異，這使得不同類型的Notch 受體功能也不同。Notch 1 胞內結構域（Notch 1 intracellular domain，N1ICD）是Hes1 啟動子的有效激活劑，而Notch 3 胞內結構域（Notch 3 intracellular domain，N3ICD）則是一種很弱的激活劑，在某些情況下甚至可以抑制N1ICD 介導的Hes 激活［45］。Hes1、Hath1 基因分別促使腸上皮細胞向吸收細胞分化和分泌細胞分化，兩者均為該通路的靶基因。當配體與相鄰細胞的受體結合后，在金屬蛋白酶（metalloproteinase，ML）或腫瘤壞死因子-α轉換酶（tumor necrosis factor-α converting enzyme，TACE）作用下將受體裂解為兩個片段，其中N 端胞外區(qū)被表達配體的細胞吞噬，C 端繼續(xù)經(jīng)γ-分泌酶裂解，形成活化形式NICD（ICN）并且進入核內，在Jκ位點（RBP-J）與CSL 蛋白結合，并招募核轉錄激活蛋白家族MAML，三者形成RBP-J-NICD-MAML 復合物，促進靶基因轉錄，使下游基因表達，促進細胞增殖抑制細胞分化。

UC 患者由于腸上皮細胞穩(wěn)態(tài)和再生受到破壞，所以引起腸內壁黏膜持續(xù)潰瘍。因此促進腸上皮細胞再生、恢復腸黏膜穩(wěn)態(tài)，對于治療UC 十分重要。而Notch 信號通過調節(jié)分泌和吸收細胞系的平衡，以及促進上皮細胞的增殖，在維持上皮完整性方面起著關鍵作用，提示UC 與該通路有關。有研究表明，Notch 通路抑制劑可抑制腸上皮細胞再生，甚至會使健康小鼠自發(fā)形成潰瘍性結腸炎。Notch 通路適度活化對于維持腸道免疫平衡十分重要，過度激活會使細胞分化失衡，分泌細胞減少，也不利于UC 的治療。葛根芩連湯是臨床上公認的治療潰瘍性結腸炎的中藥，研究［46］發(fā)現(xiàn)該復方可雙向調節(jié)Notch 信號，使信號通路適度活化，參與結腸黏膜修復的機制：抑制急性UC 模型中高度活躍的Notch 信號，下調轉錄因子Hes-1 表達，抑制Hes-1 與PTEN 啟動子結合，促進杯狀細胞分化和分泌更多保護性肽；又可增強慢性模型中信號活性，上調慢性UC 小鼠Hes-1、RBP-J 和MAML 蛋白，降低杯狀細胞分化促進上皮細胞增殖。此外惠毅等人［47］發(fā)現(xiàn)小檗堿和6-姜烯酚也可抑制該通路過度活化，抑制Hes-1蛋白表達，促進腸道上皮細胞向杯狀細胞分化，促進黏蛋白Muc2 分泌，利于黏膜損傷修復。關于Notch 通路與UC 的聯(lián)系的研究目前尚處于基礎研究階段，尚未發(fā)現(xiàn)干預該通路治療UC 的靶向藥物。

2.6 Keap1/Nrf2/ARE 信號通路

Keap1/Nrf2/ARE 信號通路是抗氧化的重要通路。主要由核因子-E2 相關因子2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）、Kelch環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（kelch epichlorohydrin associated protein 1，Keap1）及順式抗氧化反應元件（antioxidation reaction element，ARE）組成。Nrf2 有6 個高度保守的同源結構域，為Neh1～Neh6。Keap1 有5個結構域，為NTR 區(qū)、IVR區(qū)、BTB 區(qū)、DGR 區(qū)、CTR 區(qū)。正常生理情況下，Nrf2的Neh2 中兩個保守區(qū)域DLG 和ETGE 區(qū)與Keap1 的DGR 區(qū)結合形成閉合的Keap1-Nrf2 結構，同時Keap1的BTB 區(qū)結合CUL3，可使Nrf2 被泛素化進而被降解，使Keap1 游離，而游離的Keap1 二聚體準備在下一個循環(huán)中與新生成的Nrf2 結合。然而在氧化應激情況下，Nrf2 的Neh2 區(qū)中低親和力DLG 與Keap1 的分離，只有高親和力的ETGE 區(qū)與Keap1 結合，無法形成閉合結構，與Keap1 結合的Nrf2 無法被降解，進而Keap1無法游離，使得新生成的的Nrf2 不能與Keap1 結合，從而解離出來進入細胞核內，其Neh1 區(qū)的bZip 結構與細胞核內小Maf 蛋白（small Maf proteins，Maf）形成二聚體，使Nrf2 可識別并結合ARE，在Neh4、Neh5 及一些因子作用下啟動靶基因轉錄，促進靶基因編碼的抗氧化酶、Ⅱ相代謝酶的表達，如血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、醌氧還原酶1（quinone oxygen reductase 1，NQO1）、谷胱甘肽s-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等，以維持體內穩(wěn)態(tài)平衡。

該通路可通過多種抑制劑或誘導劑來調控。抑制Nrf2 信號通路，具有抗腫瘤細胞增殖、轉移和抗血管生成的作用，而激活該通路可發(fā)揮抗氧化損傷的作用。鏈霉素產生的K-563 是該通路抑制劑，可抑制Keap1/Nrf2 途徑下游靶基因或靶蛋白的表達，從而抑制A549細胞谷胱甘肽的產生，促進活性氧的產生。K-563 還可抑制Keap1 或Nrf2 突變的癌細胞中下游靶基因的表達，具有抗增殖活性，該抑制劑可與肺癌化療藥聯(lián)合作用［48］。該通路有多種激活劑，研究發(fā)現(xiàn)［49］高血糖狀態(tài)下，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活劑、p38MAPK 抑制劑或糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）抑制劑均可激活Nrf2/ARE 通路，激活機制可能為磷酸化Nrf2，使其構象改變，阻止泛素降解。前文提到多酚類化合物可通過影響PI3K/AKT 通路用于治療UC，因該類化合物具有抗氧化性，故除此之外還可通過Nrf2 信號通路發(fā)揮作用。多酚類不僅能抑制活性氧自由基（reactive oxide species，ROS）的產生，還抑制Keap1-Nrf2 蛋白與蛋白質的相互作用，降解Keap1，使Nrf2 磷酸化將其激活，調節(jié)Nrf2 相關途徑［50］。P21（也稱p21Waf1/Cip1）是一種多功能細胞周期調節(jié)分子，是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族的典型成員，可負性調節(jié)細胞周期進程并阻止DNA 復制，它也可影響Nrf2 通路活性。Han［51］發(fā)現(xiàn)p21 通過激活Nrf2/HO-1 信號通路改善了地塞米松誘導的細胞死亡和ROS 的產生，而siRNA 可耗盡p21 阻斷Nrf2/HO-1 通路的激活。大多Nrf2 活化劑的化學結構中包含親電子基團，但可能帶來毒副作用。

氧化應激反應在UC 疾病進程中發(fā)揮重要作用，與黏膜屏障、上皮細胞凋亡有關。有研究者［52］制備出了敲除Nrf2 基因的UC 小鼠模型，該基因缺失小鼠病變更嚴重，對化學誘導劑更敏感。馬濤等人實驗發(fā)現(xiàn)UC 患者體內Nrf2 及一些抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT 的mRNA 表達量均顯著高于正常人，但這些抗氧化酶的實際含量顯著低于正常人［53］，這可能由于在UC 患者氧化應激情況下，會引起機體代償性抗氧化應激，但實際因氧自由基消耗大量抗氧化酶，所以導致所測酶的含量顯著降低。影響此通路的藥物大多通過促進Nrf2 從Keap1 解離，使其進入核內與ARE 結合促進抗氧化酶生成發(fā)揮治療UC 的作用。如方靜等人［54］在研究薏苡附子敗醬散對UC 的治療作用時發(fā)現(xiàn)：關于Nrf2mRNA，模型組因氧化應激跟正常組相比升高，藥物組跟模型組顯著高，并且藥物可升高總超氧化物歧化酶活性，降低MDA 活性。近年，國內研究者確定了一種新的Nrf2 激活劑DDO7232，它可通過磷酸化激活細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulatory protein kinases，ERK1/2）使Nrf2 Ser40 磷酸化，促進后者進入核內啟動抗氧化蛋白表達，對DSS 誘導的結腸炎發(fā)揮保護作用［55］，這也提示MAPK 信號通路和Nrf2 通路可交互作用。

除上面列舉的6 條通路外，還有多條通路與UC 有關。MAPK 和NF-κB 通路在UC 中較為常見，它們是多條通路下游共有的通路調控炎癥因子的表達，前文有所提及，并且國內外研究者已做大量實驗證實許多藥物通過作用這兩個通路治療UC。臨床上常用于治療UC 的藥物美沙拉嗪便通過抑制NF-κB 活性減弱炎癥反應發(fā)揮作用。Wnt/β-catenin 信號通路被激活后通過促進炎癥反應、破壞細胞外基質誘發(fā)UC，藥物抑制該通路達到治療目的。例如，劉鑫［56］等通過動物及細胞實驗發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可能通過下調miRNA-31 抑制Wnt/β-catenin 通路，下調β-catenin 及相關蛋白表達以緩解UC 癥狀。6-姜辣素可通過抗炎和抗氧化機制以及抑制Wnt/β-catenin 信號通路來預防DSS 誘導的慢性UC［57］。此外，轉化生長因子β（TGF-β）/Smad 信號通路激活可抑制炎癥因子分泌，對UC 有保護作用［58］。鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine 1-phosphate，S1P）通路也參與UC，并且近期一種口服的S1P1 受體抑制劑Etrasimod（APD334）已用于治療中度至重度UC 患者的安全性及有效性的臨床Ⅱ期試驗，它可選擇性抑制S1P 受體亞型1、4 和5，減少不良反應，其安全性及有效性高于之前同類藥物［59］。

3 結語

UC 是一種多因素共同作用的免疫性疾病，其發(fā)病機制與多條信號通路有關，并且各通路之間相互交聯(lián)。有些藥物可同時作用于多條通路發(fā)揮作用，使治療效果更佳。但通路或因素間的相互聯(lián)系及同一通路在機體不同部位的作用有所差異，可能使得藥物對機體影響變復雜，易引起一系列不良反應，因此選擇合適的作用靶點尤為重要。深入了解該病機制及有關信號通路，消除不利影響利用有益作用，對于新藥開發(fā)意義重大。