浙江中醫(yī)藥大學藥學院 杭州 310053

失眠是指對睡眠質(zhì)量或睡眠時間不滿意的一種主觀體驗，并伴有一種或者多種癥狀（入睡困難、難以維持睡眠或早醒）[1]。失眠癥是最常見的睡眠障礙，目前失眠癥的患病率約為10%，并且一直呈上升趨勢，大約6%的人被診斷為慢性失眠[2]。研究表明失眠與慢性疼痛相關(guān)，對心血管和精神疾病的發(fā)展造成一定的風險[3-4]。藥物是治療失眠的一個重要手段，雖然很多新藥成為入睡及睡眠維持困難患者的新選擇，但是目前常用于治療失眠的西藥仍然存在較多的不良反應(yīng)，如藥物耐受和依賴、停藥復發(fā)等[5]，因此，療效好而副作用小的失眠治療藥物有待進一步開發(fā)研究。失眠屬于中醫(yī)“不寐”的范疇，研究表明中醫(yī)藥辨證論治在改善睡眠質(zhì)量方面療效確切[6-7]。中藥的作用溫和而安全，被大眾所廣泛接受，而且有著多靶點、多環(huán)節(jié)、多通路的特性，祖國歷代醫(yī)家對不寐病機的辨識和遣藥組方又略有不同，故中醫(yī)治療失眠的作用機制有待進一步明確。

本研究運用數(shù)據(jù)挖掘結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，發(fā)掘多個數(shù)據(jù)庫中治療失眠中藥潛在的配伍規(guī)律及其作用機制。通過構(gòu)建“中藥成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型[8]，對藥物潛在作用靶點進行基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，以期闡明治療失眠常用中藥的分子機制，為臨床合理用藥、中藥新藥開發(fā)和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 數(shù)據(jù)和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與數(shù)據(jù)庫 本研究以《中國知網(wǎng)中藥方劑知識庫》《中國方劑數(shù)據(jù)庫》《方劑現(xiàn)代應(yīng)用數(shù)據(jù)庫》（2020-05-20）為中藥方劑來源；在中國期刊全文數(shù)據(jù)庫中，通過計算機檢索關(guān)鍵詞“失眠”“中藥”，獲得失眠相關(guān)主題詞“失眠、不寐、不得眠、不得臥、不得睡、目不瞑”[9]，然后分別在《中國知網(wǎng)中藥方劑知識庫》《中國方劑數(shù)據(jù)庫》《方劑現(xiàn)代應(yīng)用數(shù)據(jù)庫》中以主治功能進行檢索，錄入編號、方名及藥物組成信息，刪除單味藥和組成重復的處方，在Excel 2019中建立數(shù)據(jù)庫。為確保數(shù)據(jù)準確性，對數(shù)據(jù)錄入進行雙人核查。

1.2 數(shù)據(jù)標準化 依據(jù)《中國藥典》2020版第一部和全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材《中藥學》第10版對中藥名稱和功效分類進行規(guī)范化處理，例如“桂圓肉”統(tǒng)一為“龍眼肉”，“黃耆”統(tǒng)一為“黃芪”。因中藥炮制后其功效和性味等發(fā)生改變，故統(tǒng)計時將不同炮制品分開統(tǒng)計，如甘草和炙甘草、生地黃和熟地黃分開統(tǒng)計。

1.3 用藥規(guī)律統(tǒng)計分析 通過Excel 2019進行用藥頻次分析，將中藥按照功效不同進行歸類；通過SPSS Modeler 18.0以Apriori算法建模，建立 “數(shù)據(jù)源→類型→Apriori→網(wǎng)絡(luò)”的關(guān)聯(lián)規(guī)則數(shù)據(jù)流，根據(jù)支持度和置信度，對核心中藥（頻數(shù)≥40次）進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析[10]；運用SPSS Statistics 25.0對核心中藥進行聚類分析。

1.4 高頻中藥作用機制研究 結(jié)合中藥頻數(shù)統(tǒng)計、關(guān)聯(lián)規(guī)則和聚類分析結(jié)果，以分析得到的高頻藥對和藥組為研究目標，利用中藥分子作用機制生物信息學分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of TCM，BATMAN-TCM） （http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php），設(shè)定預測候選目標（包括已知目標）的得分不小于每個成分得分分界的20%[8，11-12]，收集高頻中藥所含化合物和相對應(yīng)的靶點。運用BATMAN-TCM將核心高頻藥組的活性成分及其作用的靶點和疾病作為節(jié)點（node），成分和潛在靶點的相互關(guān)系作為邊（edge），構(gòu)建“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型圖。此外，采用BATMAN-TCM對核心高頻藥組進行GO和KEGG通路富集分析，對藥物作用靶點或差異表達基因進行信號通路分析，闡明核心高頻藥組治療失眠疾病的作用機制，并利用Image GP在線繪圖工具（http://www.ehbio.com/ImageGP/）依次繪制“高頻藥組治療失眠涉及的細胞組分”分析圖、“高頻藥組治療失眠涉及的分子功能”分析圖、“高頻藥組治療失眠的生物學過程”分析圖、“高頻藥組治療失眠的通路富集”分析圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物頻次分析 共篩選出有效處方853首，涉及469味中藥，藥物總頻數(shù)7 467次，核心中藥（頻數(shù)≥40次）共有46味，使用頻數(shù)排名前10味中藥為人參、茯苓、酸棗仁、當歸、甘草、麥冬、炙甘草、生地黃、遠志和白芍，并計算頻率（即每味中藥頻數(shù)與處方總數(shù)之比）。見表1。

2.2 常用中藥類別分析 按中藥功效分類為標準，將頻數(shù)≥5的中藥進行分類，治療失眠的中藥類別主要有補虛藥、安神藥、清熱藥、化痰止咳平喘藥、解表藥、活血化瘀藥、收澀藥、平肝息風藥、理氣藥、溫里藥。計算頻率（即每一類別中藥頻數(shù)與中藥總頻數(shù)之比）與累計頻率（即每一類別中藥頻率與其所有前項中藥類別的頻率之和）。見表2。

表1 頻率≥10%的常用中藥Tab.1 Herbs used with frequency greater than 10%

2.3 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 基于SPSS Modeler 18.0軟件，以Apriori算法建模，設(shè)置支持度＞8，置信度＞60，最大前項5，得到藥對關(guān)聯(lián)規(guī)則6條，3味中藥藥組關(guān)聯(lián)規(guī)則13條。見表3、4。支持度表示數(shù)據(jù)出現(xiàn)的頻率，置信度表示數(shù)據(jù)的可信程度。按照出現(xiàn)頻數(shù)大小排序，常用藥對有遠志→酸棗仁、白芍→當歸、茯神→酸棗仁、茯神→人參，其中出現(xiàn)頻次最高的為遠志→酸棗仁，出現(xiàn)148次，同時支持度最大。30種藥藥組以遠志、當歸→酸棗仁的置信度最大，支持度最高的為遠志酸棗仁→當歸。提升度則表示數(shù)據(jù)前項出現(xiàn)的同時數(shù)據(jù)后項出現(xiàn)概率的提高倍數(shù)，所有中藥組合規(guī)則的提升度＞1，表明各個規(guī)則前后項之間存在關(guān)聯(lián)，并且提升度越大，關(guān)聯(lián)性越強。

表2 治療失眠核心中藥類別Tab.2 Categories of herbs frequently used for treatment of insomnia

表3 藥對關(guān)聯(lián)規(guī)則分析Tab.3 Association rules of drug pairs

表4 3味中藥藥組關(guān)聯(lián)規(guī)則分析Tab.4 Association rules of three drug pairs

2.4 聚類分析 使用SPSS Statistics 25.0對頻數(shù)≥40的核心中藥進行聚類分析，基于系統(tǒng)聚類法中的Ochiai算法，結(jié)合中醫(yī)藥理論分析最終得到15個方劑，并繪制中藥聚類樹狀圖。見表5、圖1。

2.5 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的治療失眠高頻藥物作用機制探討

2.5.1 高頻中藥成分-靶點-疾病的構(gòu)建 結(jié)合中藥頻數(shù)統(tǒng)計、關(guān)聯(lián)規(guī)則和聚類分析結(jié)果，確定遠志、酸棗仁、當歸為治療失眠的常用藥組，而且三者為高頻中藥，遠志→酸棗仁為最常用藥對。根據(jù)BATMAN-TCM在線分析結(jié)果可知，遠志、酸棗仁、當歸共涉及271個化合物，其中有結(jié)構(gòu)信息的化合物187個，可用于目標預測分析。遠志59個化合物，28個無結(jié)構(gòu)信息；酸棗仁51個化合物，14個無結(jié)構(gòu)信息；當歸163個化合物，43個無結(jié)構(gòu)信息。設(shè)置調(diào)整P值＜0.05，繪制遠志、酸棗仁、當歸三者成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。潛在靶點涉及的疾病共7種，包括神經(jīng)退化性疾病、心腦血管疾病、乳腺癌、疼痛等相關(guān)疾病，結(jié)果與遠志、酸棗仁和當歸治療的疾病較為符合。

表5 失眠方劑聚類分析樹狀圖中藥提取Tab.5 Results of herbs extracted from the tree diagram of cluster analysis

2.5.2 GO和KEGG通路富集分析 對靶點進行GO分析（P＜0.05）得到30個細胞組分（cellular component，CC）、40個分子功能（molecular function，MF）、68個生物過程（biological process，BP）。CC主要包括細胞器、細胞質(zhì)、細胞膜、細胞核、線粒體、細胞骨架、細胞質(zhì)膜囊泡、核染色體等。見圖3A。MF主要富集在離子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和活性等功能等方面。見圖3B。BP富集所得結(jié)果與細胞氮化合物的代謝過程、生物合成過程、信號轉(zhuǎn)導、小分子代謝過程、應(yīng)激反應(yīng)、細胞分化、增殖、凋亡、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)過程等密切相關(guān)。見圖3C。

進一步對靶點進行KEGG富集分析得到通路205條，排名前25條通路見圖3D。KEGG通路富集分析提示，遠志、酸棗仁、當歸可能作用于包括神經(jīng)活動配體-受體相互作用，鈣信號通路、磷酸肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信號通路、環(huán)鳥苷酸-蛋白激酶G（cyclic guanosine-protein kinase G，CGMP-PKG）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、催產(chǎn)素信號通路、甲狀腺激素信號通路、叉頭盒O類（Forkhead box protein O，F(xiàn)oxO） 信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路、內(nèi)源性大麻素信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate-activated protein kinase，AMPK）信號通路等涉及調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的通路；以及調(diào)節(jié)多巴胺（dopamine，DA）能突觸、血清素能突觸、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能突觸、心肌收縮、晝夜節(jié)律；調(diào)控肌動蛋白細胞骨架、心肌細胞中的腎上腺素信號傳導、細胞因子-細胞因子受體相互作用、細胞內(nèi)噬作用、細胞周期，還包括嘌呤、碳、精氨酸和脯氨酸代謝等多種基礎(chǔ)代謝過程，與提高機體的免疫功能相關(guān)。

3 討論

圖1 治療失眠中藥聚類樹狀圖Fig.1 Tree diagram of TCM cluster analysis for treating insomnia

現(xiàn)階段，失眠癥患者基數(shù)大，失眠還可誘發(fā)多種嚴重疾病，因此有效的藥物治療和控制顯得尤為重要。祖國醫(yī)學治療失眠癥有著悠久的歷史，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》上便有相關(guān)記載，并積累了大量的文獻資料、醫(yī)案處方以及豐富的經(jīng)驗[13]。各醫(yī)家對失眠癥的病因病機有著深入的認識，卻又不盡相同，主要觀點有情志不暢、肝失疏泄、邪氣致病、體質(zhì)因素等，認為失眠的基本病機為臟腑陰陽失調(diào)、氣血不和、陰陽不交、陽難入陰而致心神不寧[14]。失眠之病位主要在心，與肝、脾、胃、腎、膽等密切相關(guān)，臟腑失調(diào)，皆可導致不寐。五臟涵養(yǎng)五神，神明不安則病發(fā)[15]。中醫(yī)通過辨證論治將失眠分為虛、實兩類，多為虛實夾雜證，根據(jù)辨病調(diào)整適宜患者的處方用藥，從而準確治療不同病因引起的失眠癥，并取得較好的療效。鑒于失眠病機復雜，中醫(yī)臨床診治過程中所形成的中藥方劑略有不同，且作用機制有待進一步研究，故本研究主要探討了三個數(shù)據(jù)庫中治療失眠方劑的用藥規(guī)律及高頻中藥潛在的作用機制，旨在為防治失眠中藥新藥的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供研究思路。

根據(jù)頻次統(tǒng)計分析可知，治療失眠的中藥以補虛藥（人參、當歸、甘草、麥冬），安神藥（酸棗仁、遠志、朱砂）和清熱藥（生地黃、黃芩）為主。其中補虛藥主要針對氣血、陰陽兩虛的失眠患者，例如人參養(yǎng)榮湯（《太平惠民和劑局方》）、炙甘草湯（《傷寒論》）。有研究表明人參糖蛋白通過調(diào)控大腦代謝，顯著改善小鼠的睡眠質(zhì)量[16]。酸棗仁的抗失眠作用已經(jīng)被廣泛研究，發(fā)現(xiàn)酸棗仁可通過突觸界面靶向多種神經(jīng)遞質(zhì)受體，從而發(fā)揮鎮(zhèn)靜和催眠的功效[17]。茯苓為雙五茯苓膏的主藥之一，運用茯苓治療失眠的用藥頻數(shù)位居第二位，其有利水滲濕、健脾寧心之功效，既往研究表明能改善小鼠睡眠質(zhì)量且安全性良好[18]。

基于核心中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則分析發(fā)現(xiàn)，藥對遠志→酸棗仁出現(xiàn)的頻數(shù)最大，支持度最高，說明其為治療失眠癥的最基本藥對，其余為白芍→當歸、茯神→酸棗仁、茯神→人參、黃芪→人參。有研究證明，酸棗仁-遠志藥對中提取所得總黃酮和總皂苷可以明顯增加小鼠30min的入睡率，并縮短其睡眠潛伏期，延長睡眠持續(xù)時間，并可能是通過調(diào)控大腦神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、GABA、DA在腦組織中的比例和纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成從而發(fā)揮鎮(zhèn)靜安神作用[19]。治療失眠的3味中藥藥組有遠志、酸棗仁→當歸，酸棗仁、當歸→遠志，酸棗仁、茯苓→人參等，主要以補虛藥為主，重用安神藥，并佐以利水滲濕藥，通過補益心氣、安神益智、交通心腎等治療失眠癥，如開心散（《備急千金要方》）。聚類分析共得到15個方劑，主要治則為調(diào)理臟腑陰陽，包括寧心安神、益智、交通心腎、補脾益氣、清熱涼血等，治法有虛者補之、實者瀉之、逸者行之。如C4藥組由茯苓、半夏、陳皮、枳實和甘草組成，是溫膽湯（《三因極一病證方論》）的主要成分?！秲?nèi)經(jīng)》曰：“胃不和則臥不安?！庇衷唬骸瓣枤鉂M不得入于陰，陰氣虛故目不得瞑。”半夏能和胃而通陰陽，茯苓補益心脾而寧心安神，從而發(fā)揮抗失眠作用。C8藥組以補虛藥（人參、麥冬）配伍安神藥（酸棗仁、遠志），佐以利水滲濕藥（茯神），有安神益智、交通心腎、養(yǎng)心補肝之功效，如天王補心丹（《攝生秘剖》）。

基于生物信息學方法研究發(fā)現(xiàn)，常用高頻藥組遠志、酸棗仁→當歸配伍所富集的疾病中，神經(jīng)退化性疾病、心腦血管疾病、乳腺癌、疼痛等與失眠都具有相關(guān)性。研究表明睡眠不足會加速神經(jīng)退化性疾病的進展，兩者之間存在著復雜的雙向關(guān)系[20-21]。GO和KEGG富集分析表明，遠志、酸棗仁、當歸3味中藥可以參與多種生物學過程，作用于多個靶點，同時在不同的信號通路中發(fā)揮治療疾病作用，符合中藥多成分、多靶點、多途徑的特性。

圖2 高頻中藥成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)Fig.2 High-frequency use of TCM ingredients-targets-diseases network

圖3-1 GO和KEGG通路富集分析Fig.3-1 Enrichment analysis of GO and KEGG pathway

圖3-2 GO和KEGG通路富集分析Fig.3-2 Enrichment analysis of GO and KEGG pathway

綜上所述，本研究基于數(shù)據(jù)挖掘結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學手段發(fā)現(xiàn)中藥治療失眠的配伍用藥規(guī)律與中醫(yī)臨床辨治失眠基本一致，分析了失眠的基本病因病機，并深入探討了高頻藥組遠志、酸棗仁和當歸配伍可能的作用靶點和信號通路，表明了中藥復方通過合理配伍，主要通過調(diào)節(jié)機體的氨基酸等基礎(chǔ)代謝和免疫系統(tǒng)，涉及調(diào)控DA能突觸和GABA能突觸等與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)的功能，多成分、多靶點、多通路共同作用從而發(fā)揮治療效果，所得結(jié)果有助于治療失眠中藥的開發(fā)研究和作用機制的闡明，為中醫(yī)臨床實踐提供參考，并為進一步開展細胞或動物驗證實驗提供理論依據(jù)。