安 肖孫 雷黃耀凌王鶴佳徐士新?楊曙明?

（1．中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，國家獸藥殘留基準實驗室，北京100081；2．中國農(nóng)業(yè)科學院，農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，北京100081）

安乃近（Dipyrone，Metamizole）是氨基比林和亞硫酸鈉的絡(luò)合物，屬于吡唑酮類非甾體抗炎藥［1］。因其廉價易得，解熱鎮(zhèn)痛效果確切，并有一定的消炎和抗風濕作用，臨床上廣泛應用于發(fā)熱性疾病、肌肉痛、疝痛及風濕癥等［2］。 在獸醫(yī)領(lǐng)域，安乃近常作為一些嚴重動物疾病的輔助用藥。 由于長期過量使用安乃近可引起粒細胞減少、貧血等不良反應［3］。 美國、加拿大等國已禁止該藥用于食源性動物［4－5］。 但是，該藥在在亞洲、歐洲、南美洲的許多國家和地區(qū)，仍廣泛應用于獸醫(yī)臨床［6］。

本研究開展之前，世界各國和國際組織均未制定安乃近在羊組織中的最大殘留限量標準。 2002年，我國農(nóng)業(yè)部235 號公告規(guī)定了該藥在動物組織（牛、豬、馬）中最大殘留限量為200 μg／kg，以殘留標志物4 －甲氨基安替比林（MAA）計算［7］。 2003年，歐洲藥品管理局（EMA）對該藥進行重新評估，規(guī)定其在牛、豬、馬組織中最大殘留限量為100 μg／kg（以殘留標志物MAA 計算）［8］。

本文依據(jù)安乃近在羊體內(nèi)的代謝和消除規(guī)律研究結(jié)果，分別按照聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織下的食品添加劑聯(lián)合專家委員會（JECFA），美國食品藥品管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）的獸藥最大殘留限量標準制定程序，研究制定安乃近在羊組織中的MRLs，比較討論MRLs 制定程序的差異和共性。 同時，進一步評估依據(jù)中國居民膳食消費水平設(shè)定MRLs 的科學性與局限性，推薦科學合理的MRLs。

1 安乃近在羊組織中代謝和消除實驗結(jié)果

1．1 代謝實驗結(jié)果 應用超高效液相色譜－四級桿－飛行時間質(zhì)譜（UPLC －Q －TOF －MS）建立了羊組織和排泄物中安乃近代謝產(chǎn)物的檢測和鑒定方法，研究了安乃近在羊體內(nèi)的主要代謝物和組織分布情況。 代謝研究結(jié)果顯示：在給藥后24 h 采集的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪和排泄物（尿液、糞便）樣品中，檢測到了安乃近主要代謝物4 －甲氨基安替比林（MAA），4 －氨基安替比林（AA），4 －甲酰氨基安替比林（FAA）和4 － 乙酰氨基安替比林（AAA），并在尿液中新發(fā)現(xiàn)了MAA 和AA 的羥基化產(chǎn)物。 其中，腎臟中安乃近代謝物總殘留濃度最高。

1．2 消除實驗結(jié)果 殘留消除試驗結(jié)果顯示：安乃近主要代謝物在羊體內(nèi)的殘留消除較快，且在腎臟組織中殘留濃度最高且消除時間最長，確定腎臟是安乃近在羊體內(nèi)的靶組織。 代謝物MAA 在腎臟中殘留濃度最高且消除最慢，確定為安乃近在羊體內(nèi)的殘留標志物。

2 安乃近在羊組織中最大殘留限量制定方法

2．1 安乃近的日允許攝入量（ADI）由于本研究涉及的藥物安乃近不屬于抗菌藥物，所以不必考慮微生物學ADI，僅需確定其毒理學ADI。 根據(jù)歐洲藥品管理局（EMA）亞慢性毒理學實驗，確定安乃近的無觀察作用劑量（NOEL）為每天10 mg／kg 體重，將安全系數(shù)設(shè)為1000，則安乃近的日允許攝入量（ADI）為10 μg／kg，即一個60 kg 體重的人每日允許攝入量為600 μg。

2．2 JECFA 方法 JECFA 獸藥殘留風險評估基本程序包括：危害鑒定和危害特征描述，開展毒理學研究，建立每日允許攝入量（ADI），開展暴露評估，依據(jù)以上研究科學推薦動物組織、蛋、奶中的獸藥最大殘留限量（MRLs）。

2．2．1 食物籃模型與ADI 分配 JECFA 在制訂MRLs 時采取WHO 推薦的食物消費系數(shù)。 即：一個60 公斤體重的人，一天動物性食物消費量：哺乳動物或禽肉500 g（其中包括肌肉300 g，肝臟100 g，腎臟50 g，脂肪50 g），或者魚肉300 g；另加1500 g 奶，100 g 雞蛋，50 g 蜂蜜。

2．2． 2 膳食暴露量評估 估計每日攝入量（EDI）：在計算EDI 時，為保守起見，對于測定殘留濃度低于定量限的結(jié)果，將其值設(shè)定為定量限的一半。 基于建立的模型飲食，通過M∶T（殘留標志物與總殘留比值）和分析方法回收率校正的殘留中值，計算得到的安乃近通過動物性食物暴露值也就是估計每日攝入量（EDI）為507 μg／person／d，為每日允許攝入量（ADI） 的84．6%，見表1。

表1 安乃近在羊組織中估計每日攝入量（EDI）評估Tab 1 Estimated Daily Intake of Dipyrone in goat tissues

2．2．3 最大殘留限量 JECFA 的算法與動物實驗的每頭動物每種組織中藥物殘留數(shù)據(jù)相關(guān)，還加入了統(tǒng)計學的置信區(qū)間概念，將總殘留的消除曲線以99%的把握，95%置信區(qū)間進行誤差估算，從而使計算結(jié)果更為可信。

根據(jù)JECFA MRLs Tool 1．1551 計算程序反復迭代計算并擬合的EDI 與ADI 比較。 由圖1 可以看出，總殘留的擬合曲線在ADI 以下，從而驗證了上述關(guān)于EDI 的估算。

圖1 安乃近在羊可食組織內(nèi)消除擬合曲線圖Fig 1 Regression line of Dipyrone intake in goat edible tissues

通過軟件迭代計算，得到的安乃近在羊可食組織中的MRLs 如下：

MRL 肌肉＝456 μg／kg

MRL 肝臟＝406 μg／kg

MRL 腎臟＝1293 μg／kg

MRL 脂肪＝25 μg／kg

2．3 美國FDA 方法 美國FDA 的獸藥安全性評價主要過程包括：無觀察作用劑量（NOEL）→每日允許攝入量（ADI）→安全濃度（safe concentration）→MRLs （FDA，2006）。 首先，通過開展比較代謝研究和總殘留消除研究，鑒定主要代謝物（超過總殘留比例10%或者濃度超過100 μg／kg 的代謝物），確定殘留標志物與總殘留之間的比例，確定靶組織和殘留標志物。 然后，根據(jù)毒理學研究確定動物組織中的殘留安全濃度，再通過代謝和殘留研究確定的殘留標志物與總殘留之間的比例推斷靶組織中殘留標志物的最大殘留限量。

2．3．1 安全濃度 安全濃度（SC）采用標準成年人每天消耗的各種動物性食品的量（食耗值）進行計算：SC ＝ADI×人體重÷食耗值。

美國FDA 規(guī)定的動物性產(chǎn)品食耗值與JECFA一致，為：肌肉（包括魚肉）300 g、肝臟100 g、腎臟50 g、脂肪（或皮脂）50 g、蛋100 g、牛奶1500 g 和蜂蜜50 g，合計2150 g，故總的食耗因子為2150 g。 但FDA 假定：人食用了一種肉品（如肌肉）將不會繼續(xù)食用其他肉品（如肝臟），但可以同時消費禽蛋、牛奶和蜂蜜。 因此，藥物在各組織的ADI 分配與動物品種無關(guān)，僅與組織消費量有關(guān)，可以將藥物的ADI 全數(shù)分配至各種組織中。

因此，安乃近ADI 分配到羊各種可食性組織的安全濃度為：

SC 肌肉＝10 ×60／300 ＝2．0 mg／kg

SC 肝臟＝10 ×60／100 ＝6．0 mg／kg

SC 腎臟＝10 ×60／50 ＝12．0 mg／kg

SC 脂肪＝10 ×60／50 ＝12．0 mg／kg

2．3． 2 最大殘留限量 MRLs 的計算公式是：MRLs ＝SC×RM%（RM 指殘留標志物占總殘留的比例）

根據(jù)安乃近代謝物殘留消除試驗，殘留標志物MAA 在羊的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中的含量與總殘留量的比值為0．13，0．65，0．35，0．56，分析方法回收 率 分 別 為82． 03%，80． 80%，82． 73%、82．30%。 據(jù)此，計算MAA 在羊可食性組織中的MRLs如下：

MRL 肌肉＝2 mg／kg×0．13 ×82．03% ＝213 μg／kg

MRL 肝臟＝6 mg／kg×0．65×80．80% ＝3151 μg／kg

MRL 腎臟＝12 mg／kg×0．35×82．73% ＝3475 μg ／kg

MRL 脂肪＝12 mg／kg×0．56×82．30% ＝5531 μg ／kg

2．4 歐盟EMA 方法 歐盟的風險評估程序與JECFA 基本一致。 危害鑒定階段的毒理學資料包括：繁殖毒性、遺傳毒性、致畸毒性、致癌毒性、發(fā)育毒性和亞慢性毒性（90 d 毒性）等。 暴露評估中所采取的食物消耗因子與JECFA 不同。 此外，歐盟建議對不同種屬動物設(shè)定相同的殘留靶組織、殘留標志物和MRLs，并且可以從主要動物種類及產(chǎn)品外推到次要動物物種及產(chǎn)品。 但是，要保證通過推薦的同一個MRLs 值計算的不同物種的TMDI 均不超過ADI。

歐盟通常為兩個靶組織（一個胴體組織，一個內(nèi)臟組織）設(shè)定MRLs 值包括提供的常規(guī)分析方法來實施殘留監(jiān)控。 出于貿(mào)易保護，對于從第三國進口的動物產(chǎn)品的四種靶組織（肌肉、脂肪、肝臟和腎臟）均需設(shè)定MRLs 值。

2．4．1 安全濃度 歐盟食物消耗因子與JECFA 和FDA 不同，為500 g 肉類或300 g 魚肉（包括自然比例的皮膚），加上1500 g 牛奶，100 g 蛋和20 g 蜂蜜。 其中，500 g 肉類的組成為：哺乳動物是300 g肌肉、100 g 肝臟、50 g 腎臟、50 g 脂肪或皮脂；禽類是300 g 肌肉、100 g 肝臟、10 g 腎臟、90 g 皮脂。 歐盟要求不同物種的最大理論日攝入量（TMDI）均不超過ADI，所以傾向于為所有動物品種和組織設(shè)定相同的MRLs。

據(jù)了解，安乃近未批準用于水產(chǎn)動物養(yǎng)殖。 因此，安乃近ADI 分配到羊中的ADI 與分配到其他陸生動物中（如牛、豬、馬）一致，則該藥在不同動物品種可食性組織的安全濃度相同。

因此，安乃近ADI 分配到羊可食性組織的安全濃度為：

SC 羊＝ADI×人體重÷食耗值＝10 ×60 ÷500＝1．2 mg／kg

2．4．2 最大殘留限量 根據(jù)安乃近代謝物殘留消除試驗，殘留標志物MAA 在羊的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中的含量與總殘留量的比值為0．13，0．65，0．35，0． 56，分析方法回收率分別為82． 03%，80．80%，82．73%、82．30%。 據(jù)此，計算MAA 在羊可食性組織中的MRLs 如下：

MRL 肌肉＝1．2 mg／kg×0．13×82．03% ＝128 μg／kg

MRL 肝臟＝1．2 mg／kg×0．65×80．80% ＝630 μg／kg

MRL 腎臟＝1．2 mg／kg×0．35×82．73% ＝347 μg ／kg

MRL 脂肪＝1．2 mg／kg×0．56×82．30% ＝553 μg ／kg

歐盟建議對不同種屬動物設(shè)定相同的殘留靶組織、殘留標志物和MRLs。 保守起見，根據(jù)歐盟MRLs 制定程序，推薦羊所有可食組織中的MRLs為128 μg／kg。

2．4．3 理論最大日攝入量 根據(jù)上述擬定MRLs，

核算羊組織中的理論最大日攝入量（TMDI），見表2。

表2 羊可食性組織中安乃近最大理論日攝入量（TMDI）Tab 2 TMDI of Dipyrone in goat edible tissues

TMDI ＝420．4 μg／d，不超過ADI 上限（600 μg／d），可以認為此MRLs 設(shè)定有效。

3 討論與結(jié)論

3．1 MRLs 設(shè)定方法比較

3．1．1 計算方法差異 通過比較上述獸藥最大殘留限量制定方法，可知三種方法的MRLs 計算原理不同。

JECFA 的MRLs 建立基礎(chǔ)是，根據(jù)每頭動物的各種組織中的殘留濃度值擬合藥物在各組織中殘留消除規(guī)律，然后運用統(tǒng)計學公式層層迭代，擬合出總殘留的消除曲線，從而獲得各組織的EDI 之和與由ADI 得出的總暴露限量的關(guān)系，利用統(tǒng)計學方法，精確計算出各模擬時間點上暴露量，推導出藥物在動物各組織精確的MRLs。

美國FDA 的MRLs 設(shè)定方法中，動物性食物消費量與動物種類無關(guān)，僅與消費的動物組織相關(guān)，并由此推算出該消費量下的安全濃度，根據(jù)殘留標志物與總殘留的比例關(guān)系，計算出藥物在動物各組織中的MRLs。

應掌握小若蟲高峰期，每百叢蟲量達1500頭以上時施藥防治。藥時應注意先從田的四周開始，由外向內(nèi)，實行圍殲。噴藥要均勻周到，注意把藥液噴在稻株中、下部。使用撲虱靈可濕性粉劑20克-25克，或25%優(yōu)樂得可濕性粉劑20克-25克，或20%葉蟬散乳油150毫升，任選一種，對水75千克-100千克常規(guī)噴霧，或?qū)λ?千克-7.5千克低量噴霧。

歐盟EMA 的MRLs 設(shè)定方法中，暴露評估計算的是動物性食品消費總量，評估結(jié)果僅與動物種類相關(guān)，而與具體消費的動物組織類別無關(guān)，由此推算出該動物品種相應的安全濃度，根據(jù)殘留標志物與總殘留的比例關(guān)系，計算得出藥物在動物各組織中的MRLs。

綜上所述，除JECFA 方法外，美國FDA 和歐盟EMA 的MRLs 算法基本一致，主要差異來源于食物消費量也就是食物籃模型的差異，表現(xiàn)在對安全濃度的設(shè)定不同。

3．1．2 食物籃模型差異 基于美國FDA 的食物籃模型，假設(shè)一個人每天只食用了一種動物組織，不再消費其他組織，實際肉類產(chǎn)品消費量不超過300 g。 由于假定的食物消費量低，所以運算得到的安全濃度較高，MRLs 也相對其他方法寬松。

歐盟EMA 和JECFA 均設(shè)定了全食物籃模型，即假定一個人每天可以消費動物的多種組織，實際肉類產(chǎn)品消費量為500 g 左右。 而且，歐盟傾向于采用最保守的限量值作為每種動物組織的MRLs。所以，運算得到的藥物在動物體內(nèi)安全濃度值相對偏低，MRLs 的設(shè)定也較為保守。

因此，食物籃設(shè)定模型的差異，導致了用美國FDA 和歐盟EMA 方法得到的藥物安全濃度不同，從而反映在最終MRLs 計算結(jié)果的較大差異。

3．2 MRLs 草案比較 按照國際慣例，為便于實際應用，最大殘留限量標準值一般以10 或100 的整數(shù)倍形式表示。 因此，對JECFA、美國FDA、歐盟EMA 三種算法得到的MRLs 結(jié)果進行取整，提出安乃近在羊可食性組織中的MRLs 草案，如表3。

表3 安乃近在羊可食性組織中的最大殘留限量標準草案對比Tab 3 Draft MRLs of Dipyrone in goat edible tissues

3．3 外推法的應用 JECFA 建議：如果比較代謝研究表明，藥物在新靶動物中的代謝與在已有MRL的靶動物中代謝行為（主要代謝物種類及含量，殘留標志物與總殘留的比率）類似，在新靶動物的使用也得到批準，則可以在不同靶動物之間進行MRL的外推。 但這種外推僅限于反芻動物（牛、羊）之間，或非反芻動物之間，以及從雞肉（蛋）到禽肉（蛋）的外推，不能直接將畜禽的MRLs 外推到水產(chǎn)動物。

本研究通過實驗動物代謝和消除規(guī)律的研究，根據(jù)EMA 的評價方法得出的安乃近在羊組織中MRLs 為100 μg／kg，該殘留限量值與歐盟于2003年評估制定的該藥在牛、豬、馬可食組織中的MRLs［8］一致，間接驗證了本研究的科學性，也在一定意義上驗證了外推法的可行性。

但是，外推法目前在國際上僅處于理論研究階段，仍存在不少爭議。 出于對動物性食品消費安全的考慮，MRLs 的建立仍需要以藥物安全性評估作為基礎(chǔ)。

3．4 我國MRLs 的設(shè)定依據(jù)

3．4．1 我國居民膳食暴露評估 從我國自身食物消費安全而言，需進行安乃近在我國居民膳食消費水平下［9］的安全性評估。 由于飲食習慣的差異［10－11］， 中國居民在動物性食品的消費量上遠達不到WHO 推薦食物籃消費水平。 以中國居民平衡膳食寶塔（中國營養(yǎng)學會，2016）為例，中國居民畜禽肉類消費量僅為40 ～75 g，僅為國際組織和歐美發(fā)達國家食物籃的十分之一。 在這么低的消費水平下，如果按歐盟的計算方法，安全濃度和MRLs都應為歐盟標準的10 倍；如果按美國的計算方法，分配到各組織中的安全濃度將更高，從而導致MRLs 比美國更高。 此外，我國居民有消費動物腸、胃等內(nèi)臟的習慣，但暫未發(fā)布相應的消費系數(shù)，且CAC 等國際組織沒有制定除肝、腎外其他內(nèi)臟殘留限量的慣例。 因此，暫不考慮內(nèi)臟中的MRLs 的制定。

但同時也應考慮到，我國少數(shù)民族眾多，羊肉在一些少數(shù)民族特別是游牧民族是主要的動物性食品來源［12］，羊腎和羊肝的消費量也較大，應權(quán)衡人群的消費差異，選擇較為安全保守的膳食消費水平進行MRLs 計算。 所以，依據(jù)中國的動物性食品消費數(shù)據(jù)得到的MRLs 與國際標準差異巨大，且不利于保護本國利益和貿(mào)易訴求。

因此，按照WHO 推薦的膳食消費數(shù)據(jù)，制定的最大殘留限量更具有普適性，國際認可度也更高。

3．4．2 國際標準的統(tǒng)一 我國近年來羊肉進口量較多，主要來自新西蘭、澳大利亞等，但上述國家已于上世紀禁止安乃近用于食品動物，未制定該藥的限量標準。 我國羊肉制品主要出口到我國香港、澳門地區(qū)和一些阿拉伯國家，出口量較少，且這些國家（地區(qū)）也未制定該藥限量標準（數(shù)據(jù)源自中國海關(guān)信息網(wǎng)）。 根據(jù)消除實驗結(jié)果，在現(xiàn)有休藥期管理下，藥物殘留量基本可以忽略不計。 所以，安乃近在羊組織中的殘留限量標準設(shè)定對我國目前的羊肉進出口貿(mào)易影響不大。

隨著全球一體化進程的加快，我國與美國、歐盟等國家（地區(qū)）的動物性產(chǎn)品貿(mào)易呈逐漸增加的趨勢，科學合理設(shè)置該藥在羊組織中的殘留限量標準，有利于保護本國利益，降低生產(chǎn)成本，提高我國動物性產(chǎn)品的市場競爭力。

鑒于我國今后有可能與歐盟等國家進行相關(guān)動物性產(chǎn)品貿(mào)易往來，設(shè)置MRLs 需要考慮進出口國的一致性，避免因肉品中藥物殘留限量不一致而導致貿(mào)易受阻［13］。 同時考慮到對安乃近不良反應的爭議，為了便于國際標準的統(tǒng)一，建議采取較為保守的措施，將安乃近在羊組織中的限量標準與歐盟保持一致。

3．5 結(jié)論 本研究將安乃近在羊組織中的代謝和消除實驗數(shù)據(jù)應用于JECFA、美國FDA 和歐盟EMA 關(guān)于獸藥MRLs 制定的數(shù)據(jù)模型，分析比較三者的食物籃模型和運算方法差異，得出了3 套不同的標準草案。

比較發(fā)現(xiàn)，JECFA 程序制定的幾種組織MRLs數(shù)據(jù)間差異較大；美國食物籃的分配及暴露評估存在差異，制定出的限量值普遍較高；歐盟程序最為保守，總體膳食暴露量較大，導致計算出的限量值較低。 所以，食物籃模型和計算方法的差異是導致JECFA、美國FDA、歐盟EMA 三套標準差異的主要因素。

安乃近作為動物發(fā)熱性疾病的首選用藥，在我國獸醫(yī)臨床應用廣泛。 鑒于目前國際上對于該藥不良反應的爭議，結(jié)合我國居民膳食消費數(shù)據(jù)，本研究認為歐盟MRLs 設(shè)置程序更為保守、安全。 因此，建議參照歐盟EMA 方法設(shè)定安乃近在羊組織中最大殘留限量為100 μg／kg。 2019 年，本研究結(jié)果納入了由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會，國家市場監(jiān)督管理總局聯(lián)合發(fā)布的食品安全國家標準［14］中安乃近最大殘留限量標準，該標準的設(shè)定程序符合國際殘留限量標準制定規(guī)則。