羅修鑫張華偉郝根喜曾小燕周明光徐高原

（武漢科前生物股份有限公司，武漢430070）

豬藍(lán)耳?。≒RRS）能夠引起母豬流產(chǎn)、木乃伊胎、死產(chǎn)和所有豬呼吸系統(tǒng)疾?。?］。 從20 世紀(jì)80 年代傳播以來(lái)給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2］。 豬藍(lán)耳病毒（PRRSV）是引起PRRS 的病原，屬于正鏈RNA 病毒，動(dòng)脈炎病毒科［3］。 PRRSV基因組大概有15 kb，至少有八個(gè)ORF：ORF1a、ORF1b 和ORFs2 －7［4］。 ORF1a 和ORF1b 編碼多聚蛋白，可以裂解成非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsps）：Nsp1α，Nsp1β 和Nsp2 －12［5］，ORFs2 － 7 編碼結(jié)構(gòu)蛋白GP2、GP3 －5、M 和N［6］。 PRRSV 分成兩個(gè)基因型：歐洲型（代表毒株Lelystad virus，LV）和美洲型（代表毒株VR－2332），可以引起相似的臨床癥狀和病理變化［7－8］。

自從1996 年我國(guó)分離出PRRSV，該病毒就廣泛存在我國(guó)豬場(chǎng)并引起PRRS，2006 年變異的高致病性PRRSV（HP－PRRSV）在中國(guó)南方爆發(fā)PRRS，引起高熱、高發(fā)病和高死亡［9－10］。 該病毒的典型特征是在Nsp2 區(qū)域有30 個(gè)氨基酸缺失。 盡管有減毒活疫苗控制HP － PRRSV，但仍有不同的HP －PRRSV 變異毒株被發(fā)現(xiàn)［11］。 2008 年美國(guó)國(guó)家動(dòng)物疾病研究中心（NADC）首次分離并命名NADC30毒株，其病毒基因組特征與VR －2332 毒株相比，Nsp2 存在131 個(gè)不連續(xù)的氨基酸缺失，缺失模式為“111 ＋1 ＋19”。 2012 年開(kāi)始，我國(guó)分離到了與美國(guó)NADC30 毒株同源性很高的毒株，到2014 年，NADC30 毒株呈現(xiàn)加劇的趨勢(shì)，我國(guó)東北和華中地區(qū)分離到了NADC30 毒株［12］，增加了我國(guó)PRRSV的復(fù)雜性和遺傳多樣性。 目前，我國(guó)PRRSV 基因突變率高引起更多新的突變毒株產(chǎn)生，主要流行的美洲型毒株可以分成以JXAI、CH － 1a、GM2、NADC30 和VR －2332 為代表的5 個(gè)亞型［13－16］。我國(guó)PRRSV 的重組可以在野毒之間或者野毒和活疫苗毒株之間發(fā)生，進(jìn)一步增加了病毒的多樣性。目前這樣的重組毒株有NADC30 類和JXA1 類重組（HENAN－HEB、JL580、HNhx、TJnh1501 和FJ140）等。 本研究從湖北某免疫過(guò)HP －PRRSV 疫苗的發(fā)病豬場(chǎng)采集病豬肺組織分離出病毒（CH－WH－19），通過(guò)設(shè)計(jì)12 對(duì)引物測(cè)出其全基因組序列并進(jìn)行生物學(xué)特征分析。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)病料 采自疑似豬繁殖與呼吸綜合征的湖北某豬場(chǎng)發(fā)病豬的血液及淋巴結(jié)、肺臟、脾臟、腎臟等組織。

1．2 主要材料和試劑 Marc －145 細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室凍存。 DMEM 購(gòu)自Gibco 公司；胎牛血清購(gòu)自金源康公司；rTaq DNA 聚合酶Mix 和反轉(zhuǎn)錄酶均購(gòu)自寶生物。

1． 3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 上已發(fā)表的PRRSV 全基因序列設(shè)計(jì)12 對(duì)引物（表1）用于交叉擴(kuò)增CH－WH－19 株全基因組。

表1 CH－WH－19 株全基因組擴(kuò)增引物表Tab 1 Full－length genomic sequencing primers of CH－WH－19

1．4 病毒的分離與培養(yǎng) 采集病豬的肺臟用滅菌的生理鹽水進(jìn)行研磨，－80 ℃反復(fù)凍融3 次，12000 r／min 離心5 min，取上清，用0．22 μm 的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌。 將已長(zhǎng)成單層的Marc －145 細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS 緩沖液清洗一次，接種1 mL 已融化的濾液，同時(shí)設(shè)正常Marc －145 細(xì)胞為空白對(duì)照，置培養(yǎng)箱中吸附1 ～2 h 之后取出培養(yǎng)瓶棄濾液，加5 mL 含2%胎牛血清的DMEM 維持液，于37 ℃5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每天觀察細(xì)胞的狀態(tài)，及時(shí)收集病變細(xì)胞。

1．5 RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄 RNA 的提取按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。 反轉(zhuǎn)錄體系為：5 × PrimeScript RT Master Mix 4 μL，模板16 μL，37 ℃15 min。 通過(guò)12 對(duì)重疊的引物擴(kuò)增CH－WH－19 全基因組序列。

1．6 全基因組的測(cè)序比對(duì)分析及進(jìn)化樹分析 通過(guò)BioEdit 和MegAlign 軟件比對(duì)分析序列，用MEGA7 中的N－J 法制作進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2．1 病毒的分離結(jié)果 從臨床收集疑似PRRSV 的56 份病料分離17 株P(guān)RRSV，擴(kuò)增GP5基因測(cè)序并進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明PRRSV－17處于NADC30 － like 毒株分支（圖1），將其命名CH－WH－19，測(cè)其TCID50為106．5／mL。

圖1 分離的17 株P(guān)RRSV GP5 基因進(jìn)化樹分析Fig 1 Phylogenetic analysis of 17 isolated PRRSV based on GP5

病毒分離過(guò)程中，盲傳第三代出現(xiàn)病變，細(xì)胞圓縮，聚集，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞聚集成堆，最后細(xì)胞破碎，脫落，用間接免疫熒光檢測(cè)出現(xiàn)特異的綠色熒光（圖2）。

圖2 CH－WH－19 株的細(xì)胞病變及間接免疫熒光結(jié)果Fig 2 CPE and immunofluorescence of CH－WH－19

2．2 基因組特征及同源性分析 CH－WH－19 基因組全長(zhǎng)14993 bp，包括5’UTR 189 bp，3’UTR 152 bp 和8 個(gè)ORF。 與NADC30、JXA1、CH －1a、VR － 2332 和GM2 的 同 源 性 分 別 為91． 9%、84．3%、83．9%、83．3%和80．5%，但是與歐洲型的毒株Lelystad virus 相似性僅有58．9%（表2），說(shuō)明分離的毒株屬于美洲型。 為了分析分離的新毒株的基因特征，我們分別比較了CH － WH － 19與NADC30、JXA1、CH －1a、VR －2332、GM2 和LV毒株的5’UTR、3’UTR 和8 個(gè)ORF 的同源性，結(jié)果顯示與NADC30 和JXA1 毒株不同ORF 同源性較高，分別是88． 6% ～97． 4%和81． 8% ～94． 7%，與CH－1a 的同源性是80． 5% ～91． 9%，而與GM2 和VR－2332 毒 株 的 同 源 性 較 低 分 別是74．9% ～90．0%和79． 6% ～90． 7% （表2）。CH－WH－19 ORF1a 和ORF1b 的大小分別是7095 bp 和4383 bp，分別與美洲型毒株的同源性是74．9% ～88．6%和86．2% ～94．7%，但與歐洲型LV 毒 株 同 源 性 僅53． 9% 和63． 3% （表2）。CH－WH－19 ORF2 ～ORF7 大約占全基因組的1／4，編碼結(jié)構(gòu)蛋白（GP2 ～GP7），其中變異最大的結(jié)構(gòu)蛋白基因ORF2、ORF3 和ORF5 與美洲型毒株的同源性分別是84．3% ～93．9%，82．1% ～94．6%和84．3% ～93．5%（表2）。

表2 CH－WH－19 與其他毒株的同源性比較Tab 2 Nucleotide identity of CH－WH－19 compared with other strains

2．3 Nsp2 基因分析 NADC30 基因型毒株的基因組特征主要表現(xiàn)為Nsp2 存在“111 ＋1 ＋19”個(gè)氨基酸缺失，CH －WH －19 毒株與參考毒株的Nsp2 基因氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示，CH －WH －19 與NADC30毒株一樣分別在322 ～432、481 和530 ～549 的位置出現(xiàn)了“111 ＋1 ＋19”個(gè)氨基酸缺失（圖3）。

圖3 CH－WH－19 與參考毒株部分Nsp2 基因氨基酸比對(duì)Fig 3 Alignment of the partial Nsp2 amino acid sequence of CH－WH－19 with reference strains

2．4 ORF5 基因分析 CH －WH －19 毒株與參考毒株ORF5 氨基酸序列比對(duì)存在一定的差異（圖4）。 CH －WH －19 毒株與參考毒株ORF5 氨基酸序列1 ～26 位置的26 個(gè)氨基酸是信號(hào)肽，63 ～83、95 ～102 和110 ～127 分別是三個(gè)跨膜區(qū)（TM1、TM2 和TM3）的位置。 在GP5 蛋白的第13 和151位與毒力相關(guān)的氨基酸處，CH －WH －19 在第13位與JXA1、CH－1a 和VR－2332 保持一致（R13），但151 位與NADC30 和GM2 保持一致（K151）。A137 是疫苗株VR － 2332 的標(biāo)志，但分離的CH－WH－19毒株突變成了S。 N30、N34、N44 和N51 是四個(gè)潛在的N －糖基化位點(diǎn)，一些研究表明與病毒感染和抗原特征有關(guān)系，CH－WH－19 毒株N34 突變成了D，其他的三個(gè)位點(diǎn)很保守。

圖4 CH－WH－19 與參考毒株GP5 基因氨基酸序列比對(duì)Fig 4 Alignment of GP5 amino acid sequence of CH－WH－19 with reference strains

2．5 進(jìn)化樹分析 為進(jìn)一步研究CH －WH －19與其他PRRSV 毒株的基因關(guān)系制作了全基因組序列的進(jìn)化樹（圖5），結(jié)果顯示所有的全基因組分成兩個(gè)大分支美洲型和歐洲型，本研究的CH－WH－19和NADC30 處于同一分支，表明CH－WH－19屬于NADC30 型毒株。

圖5 CH－WH－19 和參考毒株全基因組進(jìn)化樹分析Fig 5 Phylogenetic analysis of complete genome of CH－WH－19 and reference strains

3 討論與結(jié)論

自從1996 年中國(guó)分離到第一株藍(lán)耳病毒CH1a，豬藍(lán)耳病毒引起豬嚴(yán)重疾病也給我國(guó)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。 2006 年，我國(guó)南方大面積暴發(fā)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，至今該病已在全國(guó)大范圍存在，對(duì)我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)來(lái)說(shuō)更是雪上加霜。 本實(shí)驗(yàn)室從湖北某發(fā)病豬場(chǎng)分離到1 株P(guān)RRSV，命名為CH － WH －19，進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并分析它們的基因特征。 同源性分析顯示CH－WH－19 與美洲型標(biāo)準(zhǔn)毒株（VR－2332）和歐洲型標(biāo)準(zhǔn)毒株（LV）的相似性分別為83． 3% 和58．9%，說(shuō)明該毒株屬于美洲型毒株。 該毒株與NADC30 型PRRSV 毒株基因序列同源性高達(dá)91．9%，且進(jìn)化樹結(jié)果顯示與NADC30 毒株處于一個(gè)分支這都說(shuō)明CH －WH －19 屬于NADC30 型毒株。 CH－WH－19 與參考毒株Nsp2 基因的氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與NADC30 毒株一樣分別在322 ～432、481 和530 ～549 的位置出現(xiàn)了“111 ＋1 ＋19”的氨基酸缺失，也可以推測(cè)CH － WH － 19 株屬于NADC30 型毒株。

由于PRRSV 引起免疫抑制導(dǎo)致宿主很難徹底清除病毒。 在免疫應(yīng)答的過(guò)程中，PRRSV 為了抵抗機(jī)體產(chǎn)生的抗體，就會(huì)產(chǎn)生越來(lái)越多的變異。 盡管現(xiàn)在有變異的毒株制備的疫苗預(yù)防豬藍(lán)耳病，但豬藍(lán)耳病仍然在不同的豬場(chǎng)流行，可能是由于PRRSV 易突變引起PRRSV 致病性的改變，因此藍(lán)耳病毒的分離與基因分析仍然很重要。 本研究分離的CH －WH －19 株屬于NADC30 型PRRSV，目前還沒(méi)有出現(xiàn)NADC30 型的變異株疫苗，因此，本研究可為豬藍(lán)耳病新疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)材料。