李元曦夏應(yīng)菊徐 璐趙啟祖胡永浩王 琴?張乾義?

（1．中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州730000）

豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）屬于黃病毒科瘟病毒屬，是一種有囊膜的單股正鏈RNA 病毒［1］。 基因組包含約12300 個(gè)堿基對(duì)，編碼4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（C，Erns，E1，E2）及8 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（Npro，P7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B）。

其在自然條件下只感染豬，家豬和野豬是該病毒常見宿主。 通常認(rèn)為豬瘟（Classical swine fever，CSF）于1810 年首次出現(xiàn)于美國［2］，后來傳至世界各地，現(xiàn)美洲、亞洲、歐洲等地區(qū)都有流行，目前僅有少數(shù)國家如美國、加拿大、澳大利亞等得以根除CSF 并宣布為無CSF 區(qū)。 我國CSF 流行范圍廣泛，目前CSF 多呈點(diǎn)狀散發(fā)流行， 流行規(guī)模較小， 強(qiáng)度較輕， 但這種散發(fā)流行見于全國各地［3］。 雖然我國進(jìn)行了豬瘟的強(qiáng)制免疫，全國各地區(qū)豬群免疫密度達(dá)到95%以上，使豬群具有了一定程度的免疫保護(hù)率，在很大程度上控制了CSF 在全國范圍內(nèi)的流行，但近年來，我國很多地區(qū)的C 株疫苗免疫豬場頻繁出現(xiàn)免疫失敗［4］及持續(xù)性感染等問題，給CSF的防控和凈化工作帶來許多困難［5］。 CSFV 通過入侵宿主細(xì)胞并利用其物質(zhì)和能量在宿主體內(nèi)增殖。因此，對(duì)CSFV 侵入宿主并在體內(nèi)增殖過程進(jìn)行研究是了解其致病機(jī)理從根本上控制疫病的途徑之一，在病毒RNA 水平上研究CSFV 的感染及復(fù)制機(jī)制具有重要的科學(xué)價(jià)值。 隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，新一代高通量測序已成為轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的重要手段，在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用日趨廣泛。轉(zhuǎn)錄組廣義上是指細(xì)胞在某一階段內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的所有RNA 的總和，有時(shí)也僅指信使RNA（mRNA）的集合。 其不僅僅是連接基因組遺傳信息與功能蛋白質(zhì)組的紐帶，還反映了某一特定的發(fā)育或生理階段特定的細(xì)胞或組織基因的表達(dá)情況。 其不僅能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，同時(shí)還可以揭示特定生物學(xué)過程以及疾病發(fā)生過程中的分子機(jī)理。 所以對(duì)機(jī)體感染病原后轉(zhuǎn)錄組的解讀，就是對(duì)該病原與宿主相互作用及其發(fā)展過程的解讀。 因此，利用RNA －seq 技術(shù)對(duì)CSFV 不同毒力毒株感染后宿主與病毒間的相互作用進(jìn)行分析與研究，可以找到關(guān)鍵的差異表達(dá)基因和其在宿主與病毒互作中發(fā)揮的作用，揭示更多豬瘟病毒致病的分子機(jī)理。 本文主要介紹了RNA － seq 技術(shù)特點(diǎn)及其發(fā)展以及在豬瘟病毒感染中應(yīng)用的研究進(jìn)展，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 RNA－seq 技術(shù)概述

1．1 RNA－seq 技術(shù) 生物體在其生長發(fā)育過程中，因外部環(huán)境的影響及內(nèi)部調(diào)節(jié)的不同，轉(zhuǎn)錄組信息的變化也會(huì)呈多樣性［6］。 目前，針對(duì)轉(zhuǎn)錄組的研究方法主要可分為以下三類：一是基于cDNA 雜交熒光檢測的高通量基因表達(dá)芯片（Gene Chip）；二是基于測序技術(shù)的基因表達(dá)系列分析（Serial analysis of gene expression，SAGE）和表達(dá)序列標(biāo)簽（Ex－pressed sequence Tag，EST）；三是基于新一代高通量測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA － sequence，RNA－seq）［7］。 此外，還有生物信息學(xué)等諸多數(shù)據(jù)處理和分析的研究方法。

RNA－seq 是對(duì)各種類型的轉(zhuǎn)錄樣本進(jìn)行高通量測序的統(tǒng)稱，該技術(shù)在近十多年間迅速發(fā)展起來［8］，成為分子生物學(xué)研究中重要的工具，深刻影響了人類對(duì)于基因組功能的理解［9］。 其主要以非編碼小RNA（Small non －messenger RNA， sRNA）、信使RNA（messenger RNA，mRNA）、長鏈非編碼RNA（Long non－coding RNA， LncRNA）測序?yàn)橹?。通過高通量測序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，全面、快速地獲得特定細(xì)胞或組織在某一狀態(tài)下幾乎所有轉(zhuǎn)錄本的序列及表達(dá)信息［10］，系統(tǒng)、準(zhǔn)確地探究從DNA向RNA 轉(zhuǎn)錄這一復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控層次，是揭示復(fù)雜生物過程和解析轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要方面。對(duì)于有參考基因組的測序分析，是將短序列映射到基因組相應(yīng)的位置上去，對(duì)映射的結(jié)果進(jìn)行基因水平、外顯子水平、以及轉(zhuǎn)錄組水平的拼接，最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和生物信息學(xué)分析，獲得差異表達(dá)基因［11］、新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測、非翻譯區(qū)的分析等［12］。 而對(duì)于無參考基因組的測序分析，則進(jìn)行新基因組組裝（de novo assembling）形成全基因組范圍的轉(zhuǎn)錄譜，然后進(jìn)行基因預(yù)測與GO 分析及代謝通路分析等［13］。 目 前RNA － seq 平 臺(tái) 主 要 是Illumina 測序［14］，另外常見的還有Pacific Biosciences（PacBio）和Oxford Nanopore Technologies（ONT），其特點(diǎn)見表1。

表1 幾種主要測序平臺(tái)的特點(diǎn)Tab 1 Features of several major sequencing platforms

1．2 新興RNA － seq 技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用 近年來，隨著RNA－seq 技術(shù)的不斷應(yīng)用和得益于技術(shù)的進(jìn)步，該技術(shù)已經(jīng)逐漸向單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（Single cell RNA－seq，scRNA－seq）和互作轉(zhuǎn)錄組測序（Dual RNA－seq）發(fā)展。 傳統(tǒng)RNA －seq 的研究主要是在器官或者組織水平上，往往忽略了單個(gè)細(xì)胞在遺傳方面的特殊性。 ScRNA －seq 是在單個(gè)細(xì)胞水平對(duì)mRNA 進(jìn)行高通量測序的一項(xiàng)新技術(shù)，可將分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全轉(zhuǎn)錄組RNA 擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測序［23］。 2009 年，Tang 等首次報(bào)道深度scRAN－seq 分析，并于2010 年再次發(fā)表相關(guān)研究工作［24－25］。 Qi 等［26］利用ScRNA－seq 研究分析了包括13 種人類組織共119 種細(xì)胞類型的單細(xì)胞基因表達(dá)圖譜，并分析了51 種RNA 病毒受體和400 種其他膜蛋白的單細(xì)胞共表達(dá)譜。 結(jié)果證實(shí)了SARS －CoV －2 感染人體細(xì)胞的宿主受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）主要在肺AT2、肝膽管細(xì)胞、結(jié)腸結(jié)腸結(jié)腸細(xì)胞、食管角質(zhì)形成細(xì)胞、回腸ECs、直腸ECs、胃上皮細(xì)胞和腎臟近端小管中表達(dá)。 并且發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)候選的共受體ANPEP、DPP4和ENPEP。 其中，ANPEP 和DPP4 是已知的人類cov 受體，提示ENPEP 是人類cov 的另一個(gè)潛在受體。 在另一項(xiàng)研究中，Wang 等［27］利用ScRNA －seq 研究了ACE2 在成人睪丸中的表達(dá)模式。 結(jié)果表明，ACE2 主要富集于精原細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞。 基因集富集分析（GSEA）表明，與病毒繁殖和傳播相關(guān)的基因在ACE2 陽性精原細(xì)胞中出現(xiàn)上調(diào)，而與雄配子生成相關(guān)的基因表達(dá)則出現(xiàn)下調(diào)，這提示人類睪丸是SARS －CoV－2 感染的潛在靶點(diǎn)，對(duì)理解這種快速傳播疾病的病理生理學(xué)有重要影響。

2012 年，Westermann 等提出了術(shù)語“dual RNA－seq”，指的是對(duì)病原體及其感染的宿主同時(shí)RNA－seq 分析［28］，即同時(shí)捕獲病原體和宿主中的所有類別的編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄物。 不同于先前的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究通常需要分離相互作用的宿主和病原體，dual RNA －seq 不需要設(shè)計(jì)特異性探針的優(yōu)勢(shì)，在不了解物種基因信息的情況下，也可對(duì)其轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行檢測分析，并發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，檢測到未知基因，因此，一經(jīng)面世，該技術(shù)很快被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究。 Dual RNA－seq 不僅可以更好地了解病原體和宿主在感染過程中的生理變化，還揭示了在以往檢測中不可見的與毒力相關(guān)的小非編碼RNA 的隱藏分子表型［29］，而這得益于高通量RNA 測序靈敏度的增加。 Th?nert R 等用金黃色葡萄球菌感染兩種不同的小鼠品系并使用dual RNA －seq 分析感染過程中不同品種的小鼠作為宿主及其體內(nèi)病原的相關(guān)基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)宿主本身固有的變異性會(huì)影響細(xì)菌毒力因子的表達(dá)［30］。 在另一項(xiàng)研究中，對(duì)檢出高呼吸道病毒感染和僅攜帶病毒的兩組兒童的呼吸道細(xì)胞進(jìn)行dual RNA －seq 分析后，發(fā)現(xiàn)不發(fā)病的呼吸道病毒感染并非無害，其感染可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞在呼吸道的浸潤、纖毛細(xì)胞基因表達(dá)的下調(diào)及致哮喘基因的表達(dá)，這些影響最終會(huì)改變呼吸道的功能［31］。

可以看出，較之前的基因芯片技術(shù)和基于二代測序的轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)而言，這兩種技術(shù)具有著靈敏度高、信號(hào)數(shù)字化、易于分析和不需要設(shè)計(jì)特異性探針的優(yōu)勢(shì)，對(duì)于分析宿主與感染病原間的生物過程具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。 因此，使用新一代的RNA－seq 技術(shù)對(duì)CSFV 入侵宿主后及宿主對(duì)CSFV 的防御與抵抗中的基因差異表達(dá)的情況進(jìn)行研究和進(jìn)一步分析，將有助于進(jìn)一步揭示CSFV 的致病機(jī)制。

2 RNA－seq 對(duì)CSFV 感染宿主相互作用的研究進(jìn)展

CSFV 感染宿主細(xì)胞后利用宿主細(xì)胞的物質(zhì)和能量在宿主體內(nèi)增殖并逃避了宿主的免疫系統(tǒng)。但宿主對(duì)病毒的清除和防御反應(yīng)一刻也沒有停止。宿主的天然免疫系統(tǒng)與獲得性免疫應(yīng)答在CSFV感染及其復(fù)制過程中均發(fā)揮著重要作用［1］。 尤其是免疫C 株后機(jī)體能迅速建立起有效的免疫保護(hù)，在免疫后5 d 攻毒即可達(dá)到完全保護(hù)［32］。 因此，CSFV 與宿主的免疫應(yīng)答是一個(gè)互相博弈的復(fù)雜過程［33］。 而CSFV 與宿主相互作用的過程可在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄組及蛋白組的表達(dá)變化有所體現(xiàn)。 所以在轉(zhuǎn)錄組的水平上對(duì)CSFV 入侵宿主及宿主對(duì)CSFV 的防御抵抗進(jìn)行研究，即在病毒RNA 水平上研究其感染及復(fù)制機(jī)制，對(duì)揭示CSFV 入侵并在宿主體內(nèi)復(fù)制和宿主免疫系統(tǒng)防御抵抗CSFV 的分子機(jī)制很有意義。

目前已有科研人員利用RNA－seq 對(duì)CSFV 感染后宿主基因表達(dá)的變化情況進(jìn)行了研究。 侯玉臻等［34］基于RNA －seq 技術(shù)對(duì)感染CSFV C 株后不同時(shí)間的家兔脾臟組織進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，感染后30 h內(nèi)的前10 個(gè)差異基因只有少數(shù)與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡等相關(guān)；感染后第36 小時(shí)開始，機(jī)體與免疫相關(guān)的基因出現(xiàn)差異表達(dá)，且第36 小時(shí)和第48 小時(shí)的前10 個(gè)差異基因完全相同，其中β2微球蛋白（beta －2 microglobulin，B2M）、II 型跨膜糖蛋白CD74（MHC class II invariant chain， Ii）、人類白細(xì)胞抗原－DR －α（humanleukocyteantigens －DR －α，HLA－DR－α）和免疫球蛋白J 鏈（immunoglobulin J，IGJ）等參與機(jī)體抗病毒免疫的基因均顯著下調(diào)。GO 功能注釋結(jié)果和KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，感染后各時(shí)間點(diǎn)的差異基因都和宿主的免疫與代謝調(diào)控緊密相關(guān)，其中和免疫應(yīng)答相關(guān)的最多，這說明病毒的感染激發(fā)了家兔持續(xù)恒定的免疫反應(yīng)。寧蓬勃使用CSFV 石門株及CSFV C 株感染豬靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（SUVEC）及巨嗜細(xì)胞后對(duì)宿主細(xì)胞基因表達(dá)的差異進(jìn)行了研究［35］，通過對(duì)感染后宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平的基因調(diào)控應(yīng)答特征的分析，發(fā)現(xiàn)CSFV 石門株早期感染中PDIA3 和AXL 基因發(fā)生上調(diào)，NAMPT 與PDGF 基因發(fā)生下調(diào)。 DGE 檢測數(shù)據(jù)庫、GO 和KEGG 富集顯著性分析CSFV 石門株與C 株感染SUVEC 后72 h 轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)答差別，發(fā)現(xiàn)CSFV 石門株感染豬靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞后SRPX2、TYMS、HMGB1、SOD2 基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，這些基因在誘導(dǎo)血管上皮細(xì)胞遷移、血管網(wǎng)絡(luò)的生成和維持血管結(jié)構(gòu)和功能中具有重要作用。 VEG?FC 和CAV1 基因則在CSFV 石門株感染后出現(xiàn)了表達(dá)的上調(diào)，且VEGFC 基因是CSFV 石門株感染后特異上調(diào)表達(dá)的基因。 CAV1 活性或表達(dá)升高時(shí)，對(duì)PDGF 等多種關(guān)鍵生長因子的活性有抑制作用，VEGF 則與血管通透性密切相關(guān)，其對(duì)血管通透性具有強(qiáng)烈的增強(qiáng)作用［36］，是組胺的數(shù)百倍，且其與機(jī)體出現(xiàn)彌漫性出血、血管病變、組織臟器損害為特征性疾病的發(fā)病機(jī)制也密切相關(guān)。 這些結(jié)果顯示，CSFV 石門株的感染將會(huì)對(duì)宿主機(jī)體血管功能、生長代謝、氧化應(yīng)激、炎性出血等產(chǎn)生影響和損傷，以達(dá)到逃避炎性清除、破壞血管結(jié)構(gòu)等一系列作用，而CSFV C 株的感染則完全不會(huì)產(chǎn)生出血病變。 初步揭示了CSFV 石門株引起血管通透性增加而導(dǎo)致廣泛性出血的引發(fā)急性CSF 的分子機(jī)制。龔小程基于CSFV 石門株侵染豬肺泡巨噬細(xì)胞和豬血管內(nèi)皮細(xì)胞差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，深度挖掘這兩種宿主細(xì)胞被CSFV 感染后均出現(xiàn)顯著表達(dá)的關(guān)鍵基因［37］，發(fā)現(xiàn)真核生物起始因子4A3、蛋白酶體β 亞基3 型等關(guān)鍵基因在感染后48 h 均出現(xiàn)下調(diào)，而它們的異常表達(dá)可能影響宿主細(xì)胞的凋亡、周期調(diào)控等生理進(jìn)程。 此外還發(fā)現(xiàn)CSFV 的侵染造成了NF － κB 等相關(guān)調(diào)控的改變，并且DNA復(fù)制等信號(hào)通路出現(xiàn)顯著性應(yīng)答，這提示NF －κB調(diào)控及其相關(guān)通路與CSFV 侵染有著的密切聯(lián)系。王競晗使用CSFV 石門株及CSFV C 株對(duì)8 周齡的SPF 豬進(jìn)行了攻毒并進(jìn)一步分離感染豬只的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，以篩選差異轉(zhuǎn)錄的宿主分子［38］。 結(jié)果顯示：在病毒感染后3 d，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯上調(diào)的基因有3205 個(gè)，而下調(diào)的基因有377 個(gè)；在病毒感染后5 d，明顯上調(diào)的基因有83 個(gè)，而下調(diào)的基因有7373 個(gè)。 在顯著富集的前30 個(gè)信號(hào)通路中，與免疫和病毒感染相關(guān)的信號(hào)通路包括NF －κB、RIG －I 樣受體、Toll 樣受體和JAK－STAT 信號(hào)通路。 結(jié)合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)IL－10、VLDLR 和USP18 的下調(diào)能夠顯著抑制CSFV石門株的復(fù)制，而HES4（Hairy and enhancer of split 4）、 Stefin A1、 CYSLTR2、 LGASL1、 IFIT1、 ISG15、CASP1、MOV10、USP25、Trim5、DDX58 和ISG20 下調(diào)后能夠明顯促進(jìn)CSFV 的復(fù)制，且HES4 可以與CSFV IRES 相互作用并抑制其活性以拮抗CSFV 的復(fù)制。

這些研究說明CSFV 能有效的逃避宿主免疫監(jiān)控，其感染會(huì)直接或者間接影響宿主體內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)，引起宿主的免疫細(xì)胞凋亡及出血性炎癥反應(yīng)。 這些研究雖然揭示了部分CSFV 與宿主相互作用的復(fù)雜分子機(jī)制，并為更好地開展CSFV 與宿主的互作機(jī)制研究提供了有價(jià)值的信息，但是，這些研究有些是基于體外模型，不能完全反映動(dòng)物感染的真實(shí)情況，甚至感染病毒后，相同的基因在不同的細(xì)胞中的表達(dá)情況相反。 例如，Bensaude 等在感染了CSFV 的血管內(nèi)皮細(xì)胞中檢測到NF －κB的表達(dá)升高［39］，而石子學(xué)則在感染了CSFV 豬的外周血白細(xì)胞中檢測到NF － κB 抑制劑α（Nuclear Factor－α，NFKBIA）的表達(dá)升高，抑制了該細(xì)胞中NF－κB 的表達(dá)［25］。 有些研究雖然開展了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但僅是經(jīng)典強(qiáng)毒株的感染，不能反映目前流行毒株感染后的情況。 此外，同種宿主的不同品系感染同一毒株后也會(huì)產(chǎn)生不同反應(yīng)，如Ning 等用RNA－seq 分析了CSFV 弱毒疫苗免疫后的豬外周血單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)疫苗免疫的地方豬和雜交品種豬分別有5222 和6037 種基因的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)了顯著變化，兩種品系的豬有677 個(gè)基因的表達(dá)不同［40］。 因此，要想進(jìn)一步闡明CSFV 的致病機(jī)理，還需要更多更全面地針對(duì)CSFV 感染后宿主細(xì)胞調(diào)控的關(guān)鍵性基因進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。

3 展 望

雖然目前在轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)CSFV 的感染機(jī)理的研究取得了一定的進(jìn)展，但CSFV 感染后與宿主間的相互作用并不完全清楚，仍存在以下問題：（1）之前的研究工作主要針對(duì)CSFV 的部分基因?qū)δ撤N宿主細(xì)胞的致病作用；（2）其大多是用CSFV 在體外感染宿主細(xì)胞，對(duì)其免疫、細(xì)胞凋亡等相關(guān)的基因進(jìn)行表達(dá)差異的分析，而且宿主的遺傳背景也各不相同；（3）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究目前僅限于對(duì)經(jīng)典強(qiáng)毒株感染的研究，對(duì)流行毒株感染后情況的參考價(jià)值有限；（4）這些研究雖然揭示了一部分CSFV 的致病機(jī)理，但是由于CSFV 不同致病力毒株感染對(duì)宿主轉(zhuǎn)錄組的影響各不相同，且不同遺傳背景的宿主對(duì)CSFV 感染產(chǎn)生的相關(guān)反應(yīng)也會(huì)有所不同，所以缺乏全面系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組水平表達(dá)差異的研究，無法確定CSFV 感染宿主后致病或者產(chǎn)生免疫應(yīng)答的關(guān)鍵所在。 隨著測序技術(shù)的不斷更新和進(jìn)步，新一代的RNA － seq 技術(shù)：如scRNA － seq 和Dual RNA－seq 能夠在感染期間同時(shí)測定宿主和病原體的基因表達(dá)情況，這對(duì)于深入研究CSFV 的致病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的致病基因與作用蛋白提供了有力工具。 因此，針對(duì)CSFV 不同毒力毒株感染來源清晰、相同遺傳背景的宿主，使用新一代RNA － seq技術(shù)對(duì)CSFV 與其宿主間的相互作用進(jìn)行分析研究，不僅能詳細(xì)、直觀的揭示CSFV 的致病機(jī)理及其分子機(jī)制，也將有助于解釋C 株的免疫保護(hù)機(jī)制，為CSF 的防治及新型CSF 疫苗的研制提供新的方向，并為從根本上控制和凈化CSF 提供更多科學(xué)數(shù)據(jù)的支持。