高 強(qiáng)薛瑞林李守湖柳紀(jì)省唐德富?

目前，中國畜禽養(yǎng)殖業(yè)中流行的細(xì)菌性傳染病主要由條件致病菌和耐藥菌引起［1］。 在家禽養(yǎng)殖中最為常見的致病性細(xì)菌有大腸桿菌和沙門氏菌，發(fā)病的形式主要有單發(fā)、混合感染及與其他疾病并發(fā)［2］。 雞源大腸桿菌不僅會引起雞只腹瀉、氣囊炎、滑膜炎等疾病，而且可因繼發(fā)感染導(dǎo)致生長緩慢、產(chǎn)蛋下降［3］。 雞白痢沙門氏菌極易引起雛雞下痢、急性敗血癥等，死亡率較高，成年雞主要呈現(xiàn)慢性感染或隱形感染，長期帶毒且經(jīng)卵垂直傳播［4］。雞副傷寒沙門氏菌可感染大多數(shù)溫血?jiǎng)游锖屠溲獎(jiǎng)游铮?全世界范圍內(nèi)已分離到雞副傷寒沙門氏菌有90 多個(gè)血清型，其中鼠傷寒、海德堡和腸炎沙門氏菌是主要血清型［5］。 作為條件致病菌，大腸桿菌和沙門氏菌都具有水平傳播和垂直傳播的特點(diǎn)，四季均可發(fā)病，不但對家禽業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且威脅到人類的健康［6］。 加強(qiáng)生物安全防控、疾病凈化、病原菌疫苗免疫、抗生素預(yù)防與治療等措施，可以有效預(yù)防控制雞病原菌病的發(fā)生［7］。肉仔雞生長發(fā)育尚未健全，機(jī)體抵抗力較弱，易受大腸桿菌和沙門氏菌的感染。 常用抗生素因長期不合理的使用，致使病原菌的耐藥性越來越強(qiáng)。 本試驗(yàn)采集甘肅省民勤縣某雞場7 日齡病死肉雞肝臟、脾臟、心臟進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、16S rDNA 分子鑒定，確認(rèn)引起肉仔雞腹瀉、死亡的病原菌，之后通過復(fù)方中草藥及常用抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)分析抑菌效果，對此次病情的預(yù)防控制和科學(xué)用藥及復(fù)方中藥應(yīng)用于肉雞生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1．1 病料來源 2019 年6 ～8 月，甘肅省民勤縣勤峰灘某肉雞飼養(yǎng)場前期幼雞出現(xiàn)腹瀉、精神萎靡、厭食并出現(xiàn)死亡癥狀，無菌采集10 只患病雞心臟、肝臟、脾臟帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)及檢測。

1．1．2 主要試劑及儀器 普通瓊脂培養(yǎng)基、血平板培養(yǎng)基，購自北京索萊寶科技有限公司。 DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒，購自美國紐英倫生物技術(shù)（NEB）；DL 2000 Marker，購自寶生物（Takara）工程（大連）有限公司；濃度為1 g／mL 復(fù)方中草藥制劑由蘭州威特森生物科技有限公司自主研發(fā)，主要成分為女貞子、板藍(lán)根、當(dāng)歸、柴胡、丹參、黃芪；其他化學(xué)試劑均購自美國SIGMA 生物科技有限公司。 實(shí)驗(yàn)所用主要儀器PCR 儀、電泳儀、凝膠成像儀（Bio－Rad）；離心機(jī)（德國赫默）；水浴鍋、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海，一恒）；恒溫培養(yǎng)搖床（上海，南榮）；超凈工作臺（蘇州，安泰）。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察 將無菌采集患病雞心、肝、脾分別劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。 挑取典型優(yōu)勢菌落繼續(xù)接種培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢菌落進(jìn)行涂片，將鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性短桿菌進(jìn)一步劃線純化，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1．2．2 16S rDNA 分子鑒定 制備分離純化后的細(xì)菌菌液，根據(jù)細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書提取DNA。 以細(xì)菌16S rDNA 通用引物擴(kuò)增提取DNA，預(yù)期擴(kuò)增長度1400 bp 左右。 反應(yīng)體系50 μL：DNA 模板5 μL、Mix 25 μL、通用引物27F（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG － 3′）和1492R（5′ －GGTTACCTTGTTACGACTT－3′）各2 μL、無菌雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共進(jìn)行31 個(gè)循環(huán)，最后70 ℃延伸10 min。 擴(kuò)增產(chǎn)物用1．5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

根據(jù)PCR 產(chǎn)物純化試劑盒說明書將所得產(chǎn)物純化，純化產(chǎn)物送至武漢金開瑞生物工程有限公司進(jìn)行測序。 將所得測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，分別選取其中同源性較高菌株的16S rDNA 序列，使用Mega 7． 0 軟件基于鄰接法（NeighborJoining，NJ 法） 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹， Bootstraps重復(fù)檢驗(yàn)1000 次，以確定各菌株在分類學(xué)上的定位。

1．2．3 菌液及藥敏紙片的制備 利用平板計(jì)數(shù)法將菌液濃度調(diào)至1．0 ×106CFU／mL。 無菌采用二倍稀釋法，將原濃度的復(fù)方中草藥制劑依次稀釋至最低濃度為31．25 mg／mL。 10 片滅菌6 mm 小紙片依次平鋪與無菌培養(yǎng)皿，每紙片滴加30 μL 中草藥制劑，密封培養(yǎng)皿，烘干4 ℃保存。

1．2．4 體外抑菌 將調(diào)制后菌液200 μL 均勻涂抹于普通瓊脂培養(yǎng)基，取4 片不同濃度中草藥藥敏紙片置于上述涂有菌液培養(yǎng)基，倒置37 ℃恒溫24 h，測定抑菌圈直徑。 判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑≥20 mm 為高敏，15 mm≤抑菌圈直徑＜20 mm 為中敏，10 mm≤抑菌圈直徑＜15 mm 為低敏，10 mm 以下的為不敏感［8］。 同時(shí)用10 種常用抗生素藥敏紙片做對照，藥敏試驗(yàn)采用Kirby －bauer 瓊脂擴(kuò)散法并參照參考文獻(xiàn)［9］進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2．1 菌株的分離與鏡檢 經(jīng)分離純化培養(yǎng)，在10 只病雞心、肝、脾臟中分離得到三株病原菌，依次編號G1、G2、G3。 如圖1 所示，在血瓊脂平板上，G1 為灰白色、不透明菌落，未見明顯溶血環(huán)。 G2、G3 菌落呈針尖大小“露珠狀”，圓形，微隆起，光滑濕潤、半透明，邊緣整齊。 革蘭氏鏡檢發(fā)現(xiàn)三株菌均為革蘭氏陰性短桿菌，G1 菌珠多以單個(gè)存在，無芽孢、是兩端鈍圓的短桿菌。 G2、G3 菌兩端鈍圓，短桿狀，單個(gè)、成對或成叢排列。 通過鏡檢得知G1菌與大腸桿菌的形態(tài)特征相似；G2、G3 與沙門氏菌的形態(tài)特征相似。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)與革蘭染色圖Fig 1 Colony morphology and Gram staining ofisolated strains

2．2 16S rDNA 基因序列及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

2．2．1 PCR 結(jié)果 PCR 結(jié)果如圖2 所示，測序結(jié)果顯示G1 擴(kuò)增長度1406 bp，G2 擴(kuò)增長度1386 bp，G3 擴(kuò)增長度1394 bp，各菌株序列均與預(yù)期擴(kuò)增長度結(jié)果一致。

圖2 16S rDNA PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig 2 16S rDNA PCR electrophoresis

2．2．2 同源性比較和進(jìn)化樹 將PCR 測序結(jié)果提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 同源性搜索，發(fā)現(xiàn)G1 菌株與GenBank 已登錄的大腸桿菌基因序列同源性高達(dá)98%以上，G2、G3 與沙門氏菌菌株同源性達(dá)99%以上。 分別選取同源性最高菌株的16S rDNA 序列，使用Mega 7．0 軟件基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。 圖3 可得，所有菌株形成2 個(gè)主要分支，分離菌G1 與GenBank 已登錄的大腸桿菌Nbrc 102203 聚為一支，置信度為100。 圖4 可得，G2 與GenBank 已登錄的腸沙門氏菌亞種小腸漿液白痢株S09629 序列聚為一支，置信度為100。 從圖5 可得，G3 與GenBank 已登錄的沙門氏菌腸桿菌亞種甲型副傷寒腸桿菌GZ9A00052 序列聚為一支，置信度為98。

圖3 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的大腸桿菌種群鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig 3 Phylogenetic tree ofE． colipopulation adjacency method based on 16S rDNA sequence

圖4 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的沙門氏菌種群鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig 4 Phylogenetic tree ofSalmonellapopulation based on 16S rDNA sequence construction

圖5 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的沙門氏菌種群鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig 5 Phylogenetic tree ofSalmonellapopulation based on 16S rDNA sequence construction

2．3 抑菌結(jié)果

2．3．1 復(fù)方中草藥制劑 由表1 可知，復(fù)方中草藥制劑抑菌效果與其濃度呈正相關(guān)。 其最小抑菌濃度（MIC）為62．5 mg／mL。 濃度為1 g／mL 時(shí)三株菌均為高度敏感，抑菌效果最好。

表1 復(fù)方中草藥制劑抑菌試驗(yàn)Tab 1 Antibacterial test of compound Chinese herbal medicine preparations

2．3．2 抗生素 由圖6 可知，此次分離雞大腸桿菌對慶大霉素、阿米卡星2 種藥物敏感，對頭孢曲松、鏈霉素、氨芐西林、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟和恩諾沙星7 種藥物耐藥；而雞白痢沙門氏菌對鏈霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟3 種藥物敏感，對慶大霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、恩諾沙星5 種藥物表現(xiàn)耐藥；雞副傷寒沙門氏菌對頭孢曲松、鏈霉素、頭孢噻肟3 種藥物敏感，對慶大霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、恩諾沙星5 種藥物耐藥。

圖6 分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Fig 6 Isolate drug sensitivity test results

3 討論與結(jié)論

禽大腸桿菌病和沙門氏菌病混合感染的情況越來越嚴(yán)重，在衛(wèi)生狀況差、消毒不徹底、空氣流通不足、雞群抵抗力下降時(shí)極易發(fā)生［10］。 大腸桿菌為條件性致病菌，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降時(shí)，大腸桿菌與宿主的生態(tài)平衡被打破，形成生態(tài)失調(diào)，細(xì)菌的致病性便會表現(xiàn)出來，引起感染肉雞腹瀉、嘔吐、出血性結(jié)腸炎等疾?。?1］。 大腸桿菌與沙門氏菌既可單獨(dú)感染肉雞，也可與其他病原菌混合感染致發(fā)病，實(shí)際生產(chǎn)中，大腸桿菌和沙門氏菌混合感染的病例尤為突出。 安慧慧等［12］在固原區(qū)檢測出引起雞輸卵管炎癥的病原菌為大腸桿菌。 李蘊(yùn)玉等［13］從采集的秦皇島地區(qū)患病死亡育成雞38 份肝臟病料組織中分離鑒定出20 株大腸桿菌。 宋欣媛等［14］在昆明地區(qū)發(fā)病雞的肝臟和脾臟病料中分離出沙門氏菌。 陳培培等［15］在即墨地區(qū)從病樣中分離出大腸桿菌和沙門氏菌。 李志紅［16］在寧夏某商品蛋雞養(yǎng)殖場病料中分離鑒定出兩株雞白痢沙門氏菌。 宋海霞等［17］在河南省地區(qū)腹瀉雞群中檢測出主要致病菌為雞大腸桿菌和沙門氏菌。 上述結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

大腸桿菌和沙門氏菌都易產(chǎn)生對抗生素的耐受性，而且多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，尤其是大腸桿菌和沙門氏菌混合感染的病例［18］。 混合感染時(shí)，雞的死亡率較高，用藥難度較大，其發(fā)病率、死亡率顯著增高。 兩種細(xì)菌血清型種類較多，不同地區(qū)差別較大；不同菌株之間不產(chǎn)生交叉保護(hù)作用，極易產(chǎn)生耐藥性［19］。 中草藥具有毒副作用小、促進(jìn)生長、促進(jìn)動(dòng)物新陳代謝、無耐藥性、提高飼料報(bào)酬、預(yù)防疾病等優(yōu)點(diǎn)［20］。 關(guān)于雞大腸桿菌和沙門氏菌分離鑒定及抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)報(bào)道較多，但以復(fù)方中藥代替抗生素做體外抑菌實(shí)驗(yàn)報(bào)道少見。 尹姣姣等［21］在晉中地區(qū)分離出雞致病性大腸桿菌做藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示耐藥率極高。 宋健等［22］分離出雞白痢沙門氏菌對環(huán)丙沙星、恩諾沙星高度敏感。 其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)不一致可能是地理和養(yǎng)殖環(huán)境所不同造成，此結(jié)果也提示肉雞生產(chǎn)中要合理使用抗菌藥物，避免經(jīng)驗(yàn)用藥。 中草藥中的生物活性物質(zhì)能夠促進(jìn)動(dòng)物健康生長，使畜禽機(jī)體內(nèi)環(huán)境保持平衡狀態(tài)［23］。 女貞子所含的路類及苯芒醇巧類等具有補(bǔ)肝補(bǔ)腎、清虛熱的作用；板藍(lán)根當(dāng)中所含有的黃酬類和三瞄皂巧類具有清熱解毒的作用；當(dāng)歸中含有的當(dāng)歸多糖和揮發(fā)油具有補(bǔ)血活血、潤燥滑腸作用；柴胡中所含的皂苷能抑制各種炎癥因子引起的踝關(guān)節(jié)腫脹和結(jié)締組織增生性炎癥［24］。 本試驗(yàn)復(fù)方中藥抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將1 g／mL 復(fù)方中草藥制劑濃度稀釋至62．5 mg／mL（MIC）時(shí)依然對3 株菌均有抑菌作用。 劉永波等［25］以云南10 種中草藥水煎劑對豬源大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示中藥材水煎液對豬源大腸桿菌皆有不同程度的體外抑菌效果。 林炎權(quán)等［26］對四種中草藥對致病菌的抑菌作用測試結(jié)果顯示，在藥液pH 值調(diào)至中性后，五倍子和石榴皮能有效抑殺四種弧菌。 綜上結(jié)果所述，中草藥對致病菌有抑制作用。

根據(jù)大腸桿菌與沙門氏菌的流行特點(diǎn)，要有效控制和預(yù)防疾病的發(fā)生，除改善環(huán)境衛(wèi)生條件外，還需提高機(jī)體的抵抗力，從而有效抵御病原的侵襲。 由于人們對抗生素的濫用，導(dǎo)致常見病原菌對很多藥物產(chǎn)生了耐藥性，因此，治療效果十分不明顯。 本試驗(yàn)結(jié)果顯示大腸桿菌和沙門氏菌耐藥性極高，復(fù)方中藥抑菌效果較好。 故雞場發(fā)生此類型病情時(shí)應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)科學(xué)用藥，才能獲得良好的治療效果。

本實(shí)驗(yàn)條件下，研究發(fā)現(xiàn)常用抗生素的殺菌效果并不理想，復(fù)方中草藥制劑殺菌效果良好。 建議生產(chǎn)中應(yīng)采用藥敏試驗(yàn)，根據(jù)其結(jié)果選擇敏感藥物，且應(yīng)注意交替用藥，以收到良好的治療效果。可以考慮在生產(chǎn)中使用復(fù)方中草藥制劑代替部分常用抗生素。