楊玉蘭，梁俊青，郭偉春，臧智超，王浩然

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院科研部，內(nèi)蒙古 呼和浩特）

0 引言

根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的最新《全球癌癥報告》顯示，2018年全球乳腺癌發(fā)病率達24.2%，死亡率達15%，在女性惡性腫瘤中仍位列首位，同時也是女性因癌癥死亡的首要原因，嚴重危害女性健康[1]。乳腺腫瘤微環(huán)境具有免疫抑制作用，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。隨著對惡性細胞和免疫細胞之間相互作用的深入了解，使研究人員能夠利用新的免疫治療策略來控制免疫系統(tǒng)。關(guān)于乳腺癌免疫治療的研究也越來越受到重視，其中許多策略已經(jīng)在乳腺癌方面顯示出了前景。

快速發(fā)展的嵌合抗原受體（chimeric antigen re-ceptor，CAR）修飾T細胞在治療惡性腫瘤，特別是血液系統(tǒng)惡性腫瘤方面取得了巨大的成就[2-5]。近幾年，研究人員通過不斷探索優(yōu)化CAR-T細胞療法，在臨床各類型腫瘤治療上取得了良好效果。與此同時，同樣源于強大免疫系統(tǒng)的NK細胞也不容小覷。目前，也已經(jīng)有很多基礎(chǔ)和臨床實驗人員在研究如何構(gòu)建高效的CAR-NK，CAR-NK細胞過繼免疫治療的潛力正逐漸被挖掘?，F(xiàn)將 CARNK 細胞療法的發(fā)展及其在治療乳腺腫瘤方面的一些相關(guān)研究進展作一綜述。

1 CAR-NK 細胞概述

1.1 CAR 修飾的T 細胞和NK 細胞概述

CAR的概念最早是由 Gross 等[6]在1989年提出，之后利用CAR構(gòu)建的T細胞研究得到了迅速發(fā)展，特別是在血液腫瘤方面。美國食品和藥物管理局（Food and Drug Adminis-tration，F(xiàn)DA）已經(jīng)批準其作為某些白血病和淋巴瘤的治療手段應(yīng)用于臨床[7-8]。此外，美國食品藥物監(jiān)督管理局分別在2017 年 8 月、10 月批準將 tisagenlecleucel[9]和 axicabtageneciloleucel[10]兩項CAR-T療法用于腫瘤治療，這兩項研究成果的成功應(yīng)用，使2017年在CAR-T 發(fā)展進程中具有了重大意義。

據(jù)報道CD19靶向的CAR-T細胞在急性淋巴細胞白血病患者中的完全應(yīng)答率為70%至90%[11]。然而，CAR修飾的T細胞對實體瘤的治療效果比較差[12-14]。此外，CAR-T 細胞治療也存在著一些如細胞因子風暴、脫靶效應(yīng)、CAR-T 細胞的制備周期長以及基因突變等風險[15,16]。由于CAR-T 臨床應(yīng)用的限制和各種副作用，用CAR模式構(gòu)建的NK細胞被認為是更有治療惡性腫瘤的潛力[17],特別是對于治療一些實體腫瘤，有可能比CAR修飾的T細胞治療效果更好。

與表達CAR的T細胞相似，CAR修飾的NK細胞在體外和體內(nèi)都表現(xiàn)出了更好的腫瘤特異靶向性和對癌細胞的細胞毒性[18-19]。NK細胞在基于CAR的免疫療法中具有許多優(yōu)勢，例如，由于異基因NK細胞不會引起移植物抗宿主反應(yīng)（GVHD），也無需人類白細胞抗原（HLA）匹配[20]，所以也可被用作效應(yīng)細胞。此外，因為CAR-NK細胞通常不會誘導(dǎo)細胞因子風暴且較少引起脫靶效應(yīng)，因此可能比CAR-T細胞更安全。CAR-NK細胞除了CAR介導(dǎo)的靶向殺傷之外，還可以通過NK細胞自身的抗腫瘤特性，識別并殺傷CAR靶標下調(diào)或缺失的腫瘤細胞，提高免疫治療效果。另外，NK細胞有許多不同的來源，如外周血（PB）、人類胚胎干細胞(HESCs)、臍帶血(UCB)、誘導(dǎo)多能干細胞(IPSC)，NK-92細胞系[20]等。在最新的一項研究中，小組人員在卵巢癌異種移植小鼠模型中測試了源自人類IPSC的CAR-NK細胞，并比較了它們與其他來源NK細胞、CAR-T細胞的抗腫瘤活性。結(jié)果表明，IPSC來源的CAR-NK細胞CAR4-iPSNK具有與CAR-T細胞相似的殺傷活性，但毒性較低。由此可推測，包括乳腺癌在內(nèi)的實體腫瘤和白血病等血液腫瘤也可能是其潛在的治療目標[21]。同時，最近由IPSC衍生的靶向多種抗原的CAR-NK細胞藥物FT596已經(jīng)被FDA批準進行臨床研究，這表明CAR-NK免疫療法對于腫瘤治療的安全性和可靠性。

1.2 CAR 的結(jié)構(gòu)

經(jīng)過CAR構(gòu)建的NK細胞，可以提高免疫細胞的靶向性，高效的識別腫瘤細胞，并通過釋放殺傷介質(zhì)、誘導(dǎo)細胞凋亡等多種方式殺傷腫瘤細胞。CAR結(jié)構(gòu)主要是由三個功能域組成，即胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域由識別并結(jié)合抗原的單克隆抗體的單鏈可變片段（scFv）及一段起連接作用的鉸鏈區(qū)構(gòu)成?？缒そY(jié)構(gòu)域可以將胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域連接起來，并可以將受體錨定到免疫細胞。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域由共刺激結(jié)構(gòu)域和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[22]。

第一代CAR于1989誕生，目前為止，CAR結(jié)構(gòu)已發(fā)展到第四代。第一代細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域僅含有 CD3ζ 鏈，體內(nèi)存活時間較短; 第二代在第一代的基礎(chǔ)上加入了共刺激域（如 CD28、4-1BB、CD134和 ICOS）,使免疫細胞抗腫瘤活性明顯增強;第三代CAR結(jié)構(gòu)包含一個 CD3ζ 鏈和兩個或多個不同共刺激分子，可使免疫細胞持續(xù)活化增殖，增強殺傷腫瘤細胞作用; 第四代則加入了細胞因子或共刺激配體[23]，從而使修飾過的免疫細胞的增值活性和壽命得到了很大提升。CAR-NK的設(shè)計思路和基本框架是通過借鑒CAR-T細胞的構(gòu)建而設(shè)計的，但其也有一些特有的個性化設(shè)計。例如，篩選了DNAX相關(guān)蛋白12( DNAX-associated protein 12，DAP12) 和DAP10為胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，DAP12可能比CD3ζ 能更有效地激活NK細胞信號傳導(dǎo)。目前已經(jīng)有研究人員開發(fā)了包含自然殺傷組2，成員 D( Natural killer group 2，member D，NKG2D) 的胞外結(jié)構(gòu)域，NKG2D 作為自然殺傷細胞的表面受體，在多種腫瘤中都有其配體的表達。此外，有研究顯示CARNK細胞對廣譜腫瘤細胞亞型具有較強的殺傷毒性，這些個性化設(shè)計對急性淋巴細胞白血病、骨肉瘤、橫紋肌瘤細胞和前列腺癌等惡性腫瘤細胞系都有很好的殺傷效果[24]。

tran等人報道第一個用于NK細胞的CAR是CD4-CD3ζ(CD4ζ)融合受體[25]。在本研究中，CD4ζ 嵌合受體具有生物化學和功能活性，可以有效地引導(dǎo)人NK細胞在體外殺傷表達gp120蛋白的艾滋病病毒（HIV）感染的CD4+T細胞或NK耐藥腫瘤細胞，這表明CAR結(jié)構(gòu)可以成功表達在NK細胞上，從而實現(xiàn)高效的重定向[25]。隨后，采取了更多的探索試驗來增強NK細胞的抗腫瘤能力。

2 CAR-NK 細胞治療乳腺癌的研究進展

2.1 CAR-HER2 修飾的NK 細胞對乳腺癌細胞的殺傷

研究[26-27]發(fā)現(xiàn)，大約30%的乳腺癌患者過表達抗人表皮生長因子受體2( HER2 )基因。目前臨床上廣泛應(yīng)用的抗乳腺癌的藥物曲妥珠單抗，被證實對高度表達HER2 的乳腺癌細胞具有很好的抑制作用[28]。然而曲妥珠單抗在單用藥時僅對低于35% 的高表達HER2基因的乳腺癌患者有效[29]。且有許多HER2陽性乳腺癌患者會出現(xiàn)對曲妥珠單抗等靶向藥物耐藥現(xiàn)象[30]。因此，HER2-CAR修飾的NK細胞免疫治療成為了研究熱點。

靶激活NK-92（taNK）細胞與另一種用CARs修飾的NK-92細胞的工程突變體，已經(jīng)被設(shè)計用來靶向殺傷表達腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)的腫瘤細胞[31,32]。有研究表明，用HER2-CAR（CD28-CD3ζ）修飾的NK 細胞和 NK92 細胞系對HER2陽性的乳腺癌、卵巢癌和上皮細胞癌等腫瘤細胞系的殺傷作用明顯增強，并且在小鼠模型中能夠有效減慢腫瘤的生長速度[33，34]。Liu等[35]人通過熒光激活細胞分選(FACS)在細胞表面上表達高水平融合蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK-92-抗ErbB2 scFvCD28-ζ 細胞后, 發(fā)現(xiàn)這些細胞特異性地加快了表達ErbB2的人乳腺癌細胞系MDA-MB-453和SKBr3的細胞死亡。孔瀟等[36]人使用 NK-92MI 細胞系，利用病毒轉(zhuǎn)染的方試，將 HER2-CAR 構(gòu)建到 NK-92MI 細胞上，然后在細胞水平以及乳腺癌原位動物模型實驗中觀察到了顯著的靶向特異性，這表明，HER2抗原特異性CAR在一定程度上對HER2陽性的乳腺癌細胞具有較為明顯的殺傷作用。HER2-taNK已經(jīng)證明了taNK細胞穩(wěn)定的CAR表達和活性，這種細胞系目前正在復(fù)發(fā)性HER2陽性膠質(zhì)母細胞瘤患者中進行測試[37]。

2.2 表達PD-L1 的CAR-NK 細胞療法臨床進展

程序性死亡受體 1（PD-1）和程序性死亡受體配體 1（ PDL1）是近年來出現(xiàn)的一種新型免疫療法[38]，通過阻斷 PD-1/PD-L1信號通路進而使腫瘤細胞凋亡來實現(xiàn)治療腫瘤的目的[39]。許多研究表明，PD-L1在在乳腺癌中處于高表達狀態(tài)[40,41],因此，有研究人員提出利用表達PD-L1的CAR-NK細胞藥物來進行臨床試驗。PD-L1.t-haNK細胞療法是一種新穎的基于NK細胞的腫瘤免疫療法，利用PD-L1特異性單鏈抗體片段被設(shè)計成一種特殊的CAR-NK細胞來介導(dǎo)抗體依賴性細胞毒作用。

2019年6月，納斯達克上市公司NantKwest的PD-L1.t-haNK新藥臨床試驗申請已經(jīng)獲得FDA批準，這是該項目在局部晚期或轉(zhuǎn)移性實體瘤中的首次人體臨床試驗。PD-L1.t-haNK是表達靶向PD-L1的嵌合抗原受體的haNK細胞，haNK是公司專有的NK-92細胞系。這些細胞有兩種主要的殺傷機制，即直接NK殺傷和PD-L1特異性殺傷。該療法可以應(yīng)用于與其他靶向方法結(jié)合使用[42]。

同年12月初， NantKwest宣布了其在CAR-NK治療領(lǐng)域的部分臨床實驗結(jié)果，這項首次人體試驗評估了該公司針對腫瘤局部晚期或轉(zhuǎn)移性實體瘤的全球首創(chuàng)PD-L1.t-haNK細胞療法的安全性和初步療效。這些患者分別患有頭頸部鱗狀細胞癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、膀胱癌。試驗顯示，6名患者每次接受20億個細胞的靜脈輸注，輸注次數(shù)在9-23次之間，這些接受PDL1.t-haNK治療的門診患者均沒有發(fā)生嚴重不良事件或劑量限制性毒性，均表現(xiàn)出了CAR-NK細胞藥物較高的安全性，這表明CAR-NK療法有可能克服CAR-T治療實體瘤的局限性[43]。

2.3 CAR-NK 細胞與溶瘤病毒聯(lián)合應(yīng)用

溶瘤病毒（OV）是一類通過野生篩選或使用基因改造技術(shù)構(gòu)建、能夠在腫瘤細胞中選擇性復(fù)制、溶解腫瘤細胞的病毒。之前的研究表明，OV的作用機制包括直接裂解腫瘤細胞、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境、募集腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）、啟動先天免疫細胞和CD8+T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，以及調(diào)節(jié)血管生成。OV具有獨特優(yōu)勢：經(jīng)臨床前研究證實具有廣譜的抗腫瘤效果，對多種腫瘤都有效，且安全性出色。因此，溶瘤病毒在腫瘤治療過程中的多功能特性使其具有與其他藥物聯(lián)用增效的巨大潛力。一項三陰性乳腺癌的臨床前研究模型中顯示，溶瘤馬拉巴病毒可使難治性腫瘤對免疫檢查點抑制劑的敏感性增強[44]。此外，用多種細胞因子武裝的溶瘤病毒也被用于與CAR-T細胞療法聯(lián)合；在異種移植瘤模型中，這種聯(lián)合策略也增強了抗腫瘤活性[45]。據(jù)此，可以設(shè)想將CAR-NK與溶瘤病毒聯(lián)合起來治療乳腺腫瘤。

在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中乳腺癌腦轉(zhuǎn)移（B2BM）較常見，且預(yù)后較差。在最新的研究中發(fā)現(xiàn)，B2BM的關(guān)鍵機制涉及N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）,該受體存在于神經(jīng)元的細胞膜上，并且參與傳播神經(jīng)沖動，NMDAR由在這種神經(jīng)沖動的突觸傳遞期間從突觸前神經(jīng)元釋放的谷氨酸激活[46]。有研究顯示，與單獨使用CAR-NK細胞的療法相比，第二代設(shè)計的表皮生長因子受體-CAR-NK細胞與溶瘤性單純皰疹病毒（oHSV）的聯(lián)合應(yīng)用對乳腺癌細胞株具有更高的殺傷率，并在乳腺癌小鼠模型中可以有效抑制腫瘤擴散[47]。這可能為CAR-NK細胞聯(lián)合溶瘤性病毒有效治療其他耐藥實體腫瘤提供了參考價值。

2.4 CAR-NK 細胞聯(lián)合化療

研究表明放化療可上調(diào)腫瘤細胞表面 NK 細胞活化性受體配體的表達，提高腫瘤細胞的敏感性，進一步提高 NK細胞治療緩解率[48]。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是乳腺癌化療中的基石方案，尤其是對于三陰性（TNBC）這類高?；颊?。在2018年的歐洲腫瘤內(nèi)科學會（ESMO）上，有研究公布紫杉類聯(lián)合免疫治療對比單純化療可以顯著提高患者療效，并延長患者的總生存。這可以為CAR-NK聯(lián)合化療治療乳腺腫瘤提供研究思路，同時，隨著腫瘤免疫治療研究的發(fā)展，利用免疫細胞作為載體直接將抗癌藥物運送到腫瘤部位的概念受到了研究人員的關(guān)注。有研究報道，NK 細胞表面具有高水平的游離巰基[49]。Elizabeth L. Siegler等的研究顯示，免疫細胞可以作為直接對腫瘤有細胞毒性的納米粒子或攜帶化療藥物的納米粒子的活性載體。納米粒子可以通過直接利用氨基或巰基等官能團結(jié)合到腫瘤細胞表面，通過疏水作用、靜電相互作用進入脂質(zhì)雙層或附加到特定的細胞表面受體。交聯(lián)多層脂質(zhì)體小泡（cMLV）是由硫醇反應(yīng)的馬來酰亞胺頭部基團修飾的脂質(zhì)體，可穩(wěn)定地結(jié)合到NK細胞表面的還原巰基上。因此，CARNK細胞可促使包載PTX的cMLV進入腫瘤部位，有效減緩腫瘤生長，增加腫瘤內(nèi)PTX濃度[50]。此研究證明，應(yīng)用嵌合抗原受體工程的NK-92細胞作為載體，將載藥納米粒子直接導(dǎo)向靶點，在體外和體內(nèi)試驗都能提高乳腺癌化療的療效，同時也可減少非靶點毒性[50]。

3 CAR-NK 細胞免疫治療的不足和挑戰(zhàn)

雖然CAR修飾的NK細胞相對于CAR-T細胞的優(yōu)勢為其在難治性惡性乳腺癌細胞的免疫治療中的應(yīng)用提供了很大的希望，但目前也存在許多問題。首先，NK細胞上CARs的最優(yōu)結(jié)構(gòu)設(shè)計尚未得到系統(tǒng)研究。CAR結(jié)合表位的位置及其與CAR-NK細胞表面的距離可能會影響其與抗原的結(jié)合、免疫突觸的最佳形成和CAR-NK細胞的激活[51]。此外，由于NK細胞的異質(zhì)性，其包含有許多不同功能特征的不同NK亞群，而不同NK細胞亞群可能特異性地參與各種免疫反應(yīng)和相關(guān)疾病易感性[52]。所以仍有待進一步探索選擇何種NK細胞亞群來擴增和構(gòu)建靶向殺傷乳腺腫瘤的CAR-NK細胞。

越來越多的研究者正在積極開發(fā)更有效的方法以提高NK細胞為基礎(chǔ)的抗腫瘤免疫功能。體外擴增/激活技術(shù)的進步以及基因修飾NK細胞新方法的出現(xiàn)，使NK細胞的過繼免疫治療有望成為對抗惡性腫瘤的有力武器。此外，找到更好的聯(lián)合治療方案，找到更好的療效預(yù)測指標，找到更好的副作用控制措施，也是CARNK治療乳腺癌面臨的新挑戰(zhàn)。