戴 紅， 蔣秋悅， 全哲學(xué)

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

硝化作用作為連接固氮和反硝化作用的中間過程，是生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過程的重要環(huán)節(jié)[1]。傳統(tǒng)的硝化作用分為2個(gè)過程[2]，包括將氨氧化為亞硝酸鹽的過程(由氨氧化菌來完成)和將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽的過程(由亞硝酸氧化菌來完成)。Costa等[4]提出了全程硝化菌(complete ammonia oxidizer, comammox)存在的可能性，即1個(gè)微生物可通過氨氧化和亞硝酸氧化單獨(dú)完成原來由氨氧化菌和亞硝酸氧化細(xì)菌協(xié)同完成的過程，以獲得更多的能量。全程硝化菌的發(fā)現(xiàn)[3]打破了之前硝化作用需要由兩種不同的微生物來完成的理論，填補(bǔ)了生物地球化學(xué)氮循環(huán)中的關(guān)鍵過程，引起了社會的廣泛關(guān)注。因此，研究全程硝化菌在生態(tài)系統(tǒng)中的多樣性和貢獻(xiàn)，是氮循環(huán)機(jī)制研究和硝化微生物研究的重要基礎(chǔ)。目前，已經(jīng)獲得純培養(yǎng)的全程硝化菌是在深層石油井地下水管內(nèi)的生物膜上[4]發(fā)現(xiàn)的Nitrospirainopinata。在水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的滴濾池[5]樣品的厭氧除氮反應(yīng)器中，也獲得了2種全程硝化菌的富集培養(yǎng)物候選種Nitrospiranitrificans和候選種Nitrospiranitrosa，這些已報(bào)道的全程硝化菌在氨氧化過程的核心功能酶氨氧化單加氧酶基因amoA的系統(tǒng)發(fā)育樹中形成一個(gè)簇(clade A)[4-5]；在采自地下水樣品的宏基因組中[5]，檢測到了形成另一個(gè)簇(clade B)的全程硝化菌。此外，在飲用水系統(tǒng)[6]、地下水快速砂濾器[7]和農(nóng)業(yè)土壤[8]的宏基因組分析中也檢測到了全程硝化菌。這些研究表明，全程硝化菌在人造環(huán)境和自然生態(tài)系統(tǒng)中廣泛分布。目前，檢測不同環(huán)境樣品中全程硝化菌的方法有多種，包括利用宏基因組學(xué)方法研究全程硝化菌與其他氨氧化菌的分布比例[9]，根據(jù)全程硝化菌的amoA序列設(shè)計(jì)新的特異性引物檢測全程硝化菌[10]，以及利用高簡并引物兩步PCR擴(kuò)增方法[11]和部分巢式PCR擴(kuò)增方法[12]分析環(huán)境樣品中的全程硝化菌的群體結(jié)構(gòu)和多樣性。這些方法的建立為研究環(huán)境樣品中全程硝化菌的多樣性和分布奠定了重要基礎(chǔ)。灘涂濕地作為連接陸地和海洋的生態(tài)系統(tǒng)，在全球物質(zhì)循環(huán)中起著重要的作用[13]。每年大量營養(yǎng)物質(zhì)通過長江涌入灘涂河口地區(qū)，其中除了硝酸鹽還包括相當(dāng)多的銨和有機(jī)氮等，這些營養(yǎng)物通常被認(rèn)為是氮轉(zhuǎn)化，尤其是硝化作用主要基質(zhì)[14-16]。除了遠(yuǎn)海環(huán)境外，全程硝化菌在各種生態(tài)環(huán)境中都被檢測到，在灘涂生態(tài)系統(tǒng)中的分布在前期研究中已有報(bào)道[12]。之前利用設(shè)計(jì)的高簡并引物兩步PCR擴(kuò)增的方法，分析了4個(gè)季節(jié)中長江口不同深度的灘涂沉積物內(nèi)全程硝化菌和氨氧化細(xì)菌的分布特點(diǎn)[17]，結(jié)果表明，與氨氧化細(xì)菌相比，春季表層(0～1 cm)和淺表層沉積物(1～5 cm)以及秋季深層沉積物(5～10 cm)中的全程硝化菌的比例相對較高。但此分析的缺陷在于，設(shè)計(jì)的引物不能覆蓋全程硝化菌的clade B類型，且高簡并引物對clade A.2不能完全覆蓋[12]。本次研究結(jié)合可覆蓋環(huán)境中全程硝化菌的所有類型的部分巢式PCR擴(kuò)增方法和高通量測序方法，分析了長江河口灘涂沉積物在不同季節(jié)和不同深度的全程硝化菌的群落結(jié)構(gòu)，研究了全程硝化菌的生態(tài)分布特點(diǎn)與環(huán)境因子的關(guān)系，這對認(rèn)識灘涂生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過程中全程硝化菌的貢獻(xiàn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 分別于2014年的1月、4月、8月和10月在長江河口的崇明東灘灘涂地區(qū)采集樣品，以冬(W)、春(Sp)、夏(Su)、秋(A)代表不同月份。在相距50 m的區(qū)域內(nèi)分別設(shè)立了3個(gè)重復(fù)樣點(diǎn)(A、B和C)，按照5點(diǎn)采樣法，對每個(gè)樣點(diǎn)的3個(gè)不同深度采樣：表層(0～1 cm)、淺表層(1～5 cm)和深層(5～10 cm)，以數(shù)字0、1和5分別命名。樣品混勻，冰盒保存，用于理化性質(zhì)測定和DNA的提取。

1.1.2 主要試劑 Axygen膠回收試劑盒(天根生化科技北京有限公司)，PowerSoil DNA提取試劑盒(Mo Bio Laboratories，USA)，Ex Taq premix酶(TaKaPa，Japan)，牛血清蛋白(BSA)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 多用途水平電泳儀(BG-subMIDI，南北儀器有限公司)，PCR儀(MG96+，上海賽默生物科技發(fā)展有限公司)，便攜式pH計(jì)(Bante211，上海班特儀器有限公司)，超凈工作臺(VD-850，蘇州江東精密儀器有限公司)，0.22 μm濾膜(生工生物工程(上海)股份有限公司)，高速離心機(jī)(Pico17，上海凌儀生物科技有限公司)，微量移液槍(EF100，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，渦旋振蕩器(Vortex-genie2，USA)，離子色譜儀(ICS-1000，Dionex，Sunnyvale，CA)，碳氮分析儀(Flash EA 1112Series，Thermo，Italy)。

1.2 方法

1.2.1 理化性質(zhì)檢測 樣品的理化性質(zhì)數(shù)據(jù)參考文獻(xiàn)[17]。具體方法如下：樣品50 ℃烘干過夜，加入2 mol/L KCl溶液30 ℃震蕩孵育1 h[18]，取上清0.22 μm濾膜過濾，濾液用于硝酸根離子檢測，比色法檢測銨濃度[19]，使用Bante211便攜式pH計(jì)測量上清液的pH值。烘干的樣品經(jīng)研磨過100目篩，取40 mg使用碳氮分析儀檢測總碳(TC)和總氮(TN)含量。

1.2.2 DNA提取 樣品的DNA提取按PowerSoil DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，1%的凝膠電泳檢測，-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 部分巢式PCR擴(kuò)增 利用部分巢式PCR[12]對全程硝化菌的amoA基因進(jìn)行擴(kuò)增。第一輪PCR使用的引物為A189Y和為區(qū)分不同樣品在5′端包含8個(gè)堿基barcode 的C576r[12]，擴(kuò)增體系為50 μL，反應(yīng)體系：無菌水20 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，Ex Taq premix 25 μL，牛血清蛋白(20 mg/mL)2 μL，DNA模板1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，20個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。第二輪PCR使用的引物為CA209和為區(qū)分不同樣品在5′端包含8個(gè)堿基barcode 的C576r[12]，擴(kuò)增體系為50 μL，利用的DNA模板是第一輪的PCR產(chǎn)物，反應(yīng)體系：無菌水15 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，Ex Taq premix 25 μL，BSA(20 mg/mL)2 μL，DNA模板4 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.4 高通量測序 第二輪PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，對目的長度片段(約400 bp)割膠回收，用Qubit 2.0熒光計(jì)濃度檢測，均量混合不同樣品，構(gòu)建文庫，在Illumia Miseq系統(tǒng)上進(jìn)行高通量測序。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 下機(jī)后的數(shù)據(jù)參照Xia等[12]的方法，使用QIIME軟件[20]進(jìn)行分析。處理過程如下：切除序列中的barcode序列，對測序序列進(jìn)行質(zhì)控和兩端拼接，根據(jù)切下的8個(gè)堿基的barcode序列對樣品進(jìn)行區(qū)分，隨后進(jìn)行嵌合體的識別和去除。嵌合體識別參考修改后的銅結(jié)合單加氧酶家族(CuMMO)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫[11]，以此數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)作為參考序列，對大于250 bp長度核苷酸序列以90%的相似度進(jìn)行可分類操作單元(OTU)的分類，并用于不同環(huán)境樣品中不同全程硝化菌的比例分析。去除總序列數(shù)小于4條的OTU，選擇剩余的每個(gè)OTU的代表序列，利用FunGene數(shù)據(jù)庫(http://Fungene.cme.msu.edu)中的FrameBot工具對其進(jìn)行氨基酸翻譯，通過MEGA 5.0軟件[21]利用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，參考序列選擇Jiang等[17]文章中的序列，根據(jù)參考序列的分類信息，確定OTU的分類信息。根據(jù)理化性質(zhì)，在CANOCO 5.0中進(jìn)行冗余分析(RDA)，以確定環(huán)境參數(shù)與全程硝化菌類型之間的相互關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 全程硝化菌的amoA基因的OTU分類

基于高通量數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，共獲得79 532個(gè)全程硝化菌的amoA基因序列，將獲得的amoA基因序列以90%的閾值劃分OTU，選擇占比大于1%的18個(gè)主要OTU，取其代表序列與已知的參考序列，使用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。如圖1所示，環(huán)境樣品中的全程硝化菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上可以明顯分為clade A.1、clade A.2和clade B。clade A.1單獨(dú)形成一簇，其bootstrap值為92%；clade A.2單獨(dú)形成一簇，其bootstrap值為66%；clade A.1和clade A.2聚類為clade A，其bootstrap值為99%，表明clade A.1和clade A.2相對于clade B，其親緣關(guān)系更為接近；clade B單獨(dú)聚類，bootstrap值為99%。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，clade A.1主要以O(shè)TU1和OTU3為主，OTU1與之前報(bào)道的Candidatusnitrospiranitrosa相接近，OTU3則與scaffold HN-bin3[22]接近，clade A.1的其他幾個(gè)OTU代表序列則與Candidatusnitrospiranitrificans接近。全程硝化菌clade A.2主要以O(shè)TU2、OTU4和OTU5為主，在系統(tǒng)發(fā)育樹上都與scaffold HN-bin1[22]接近,全程硝化菌cladeB類型在系統(tǒng)發(fā)育樹上只有1個(gè)OUT17(1.10%)，占比較低。

圖1 全程硝化菌amoA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic analysis of the comammox amoA geneOTU后括號中的百分比值表示每個(gè)OTU在所有樣品的全程硝化菌amoA基因序列中所占比例。系統(tǒng)發(fā)育樹中僅顯示占比大于1%的18個(gè)主要OTU的代表序列,節(jié)點(diǎn)附近只顯示> 50%的bootstrap值Percents in brackets of the operational taxono mic units (OTUs) indicate the proportion of each OTU in the representative comammox amoA gene sequences. Only 18 OTUs with a ratio greater than 1% of the total comammox amoA gene sequences are shown in the phylogenetic tree. Only>50% bootstrap values are displayed near the nodes

不同樣品中OTU的分布比例如圖2所示，選擇占比大于1%的主要OTU進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在不同季節(jié)及深度的沉積物樣品中, clade A的比例明顯高于clade B。其中clade A.1和clade A.2的分布比例隨季節(jié)及深度的變化而變化，OTU1作為clade A.1主要的OTU，除夏季表層(Su0，0～1 cm)樣品以外，在其余季節(jié)和不同深度樣品中均占主導(dǎo)。屬于clade A.1的OTU7則在冬季淺表層(W1，1～5 cm)、春季深層(Sp5，5～10 cm)和夏季表層(Su0，0～1 cm)沉積物中有所分布。OTU7在夏季表層(Su0，0～1 cm)沉積物中分布最多，占該沉積物樣品中所有amoA序列的31.97%。整體而言，clade A.1在夏季各沉積物樣品中比例最高。

OTU2和OTU4作為clade A.2主要的OTU，OTU2在夏季淺表層(Su1, 1～5 cm)沉積物中的比例明顯高于其他沉積物樣品，而在夏季表層(Su0，0～1 cm)沉積物中比例相對偏低，OTU4則與其相反。整體而言，clade A.2在夏季沉積物樣品中比例偏低，但在冬季淺表層沉積物(W1，1～5 cm)樣品中比例最低，秋季深層沉積物(A5，5～10 cm)樣品中比例次之。

不同季節(jié)及深度的沉積物樣品中，全程硝化菌clade B比例很低，只有OTU17是clade B的主要OTU，OTU17在冬季各沉積物樣品中比例最高，并隨著“冬-秋-春-夏”季節(jié)變化其所占比例逐漸降低，冬季淺層(W0，0～1 cm)沉積物中OTU17的比例略高于淺表層和深層沉積物。

2.2 灘涂沉積物中全程硝化菌的分布

基于不同季節(jié)和不同深度的沉積物樣品中獲得的所有amoA基因序列形成柱狀圖，全程硝化菌不同類型的分布如圖3所示，全程硝化菌clade A.1在冬季淺表層沉積物(W1，1～5 cm)中分布最多，占比61.94%；在春秋兩季深層沉積物(5～10 cm)和夏季所有沉積物樣品中比例均高于clade A.2和clade B；在淺表層沉積物(1～5 cm)中，冬夏兩季clade A.1比例較高；在深層沉積物(5～10 cm)樣品中，春秋兩季clade A.1比例偏高，clade A.2則與其相反。

全程硝化菌clade B存在于秋冬兩季沉積物中，在兩季的不同深度沉積物中，clade B的比例有所差異。clade B在秋季淺表層和冬季淺層沉積物中比例偏高。

2.3 灘涂沉積物中全程硝化菌與環(huán)境因子的相關(guān)性研究

從測序結(jié)果中抽取全程硝化菌的序列，通過RDA分析研究全程硝化菌與各種環(huán)境因素的相關(guān)性。如圖4所示，夏季沉積物樣品都聚類在RDA圖右上方，其余三季表層沉積物(0～1 cm)樣品分布在RDA圖下方，淺表層沉積物(1～5 cm)樣品聚類在RDA圖右下方，深層沉積物(5～10 cm)樣品整體上分布在RDA圖左上方，表明除夏季以外，全程硝化菌在其余季節(jié)不同深度的沉積物中的群落組成較為接近。RDA圖顯示了銨濃度、硝酸鹽濃度、pH、總碳含量(TC)和總氮含量(TN)與不同季節(jié)和沉積物及其深度的全程硝化菌的群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性。夏季所有沉積物樣品中全程硝化菌與總碳含量(TC)呈負(fù)相關(guān)，除夏季沉積物樣品外，銨濃度與其余三季淺表層沉積物(1～5 cm)樣品中全程硝化菌的群落呈負(fù)相關(guān)，硝酸鹽濃度和pH與其余三季表層沉積物(0～1 cm)樣品中全程硝化菌的群落呈負(fù)相關(guān)，而總氮含量(TN)則與其余三季深層沉積物(5～10 cm)全程硝化菌群落呈負(fù)相關(guān)。

圖2 全程硝化菌amoA基因的代表性O(shè)TU在四個(gè)季節(jié)不同深度的沉積物中的分布Fig.2 Distribution of the representative operational taxonomic units (OTUs) of the comammox amoA gene in sediments of different depths in four seasons W、 Sp、 Su和 A分別代表冬、春、夏、秋四個(gè)季節(jié)；0、1和5分別代表沉積物的不同深度(分別為0～1、1～5和5～10 cm)；該圖僅顯示占比大于1%的全程硝化菌amoA基因序列的代表性O(shè)TUW，Sp，Su and A represent the four seasons of winter, spring, summer and autumn, respectively；0, 1 and 5 represent the different depths of the sediments (0-1, 1-5 and 5-10 cm respectively)； This figure only shows representative OTUs of the comammox amoA gene sequence with a ratio greater than 1%

圖3 四個(gè)季節(jié)不同深度的沉積物全程硝化菌的分布Fig.3 Distribution of the comammox in sediments at different depths in four seasons樣品名稱縮寫參考圖2，負(fù)誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Refer to figure 2 for abbreviations of samples，negative error bars indicate the standard deviation (n=3)

圖4 不同季節(jié)和深度的沉積物樣品中全程硝化菌比例的RDA分析Fig.4 RDA analysis of the proportion of comammox in sediments from different seasons and depths樣品名稱縮寫參考圖2Refer to figure 2 for abbreviations of sample names

3 討 論

全程硝化菌在不同的環(huán)境中廣泛分布。在灘涂生態(tài)系統(tǒng)中，全程硝化菌不同類型的分布特點(diǎn)有利于進(jìn)一步認(rèn)識灘涂沉積物的氮循環(huán)過程。通過部分巢式PCR擴(kuò)增的方法，檢測到長江河口崇明東灘灘涂濕地沉積物中存在的不同類型的全程硝化菌，根據(jù)高通量測序結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)不同類型的全程硝化菌的分布隨不同季節(jié)及沉積物不同深度的變化而變化。

Jiang等[17]的研究表明，用高簡并引物兩步PCR方法可以擴(kuò)增環(huán)境樣品中的全程硝化菌amoA序列，但其局限在于設(shè)計(jì)的引物不能覆蓋全程硝化菌clade B類型。本研究利用部分巢式PCR擴(kuò)增方法[12]，可以同時(shí)覆蓋全程硝化菌的clade A和clade B兩個(gè)分枝，有利于全面分析全程硝化菌在灘涂濕地的分布。在不同的環(huán)境中，全程硝化菌 clade A.1和clade A.2的比例不同。有研究報(bào)道全程硝化菌 clade A.1在潮灘沉積物、活性污泥、厭氧污泥和沿海水樣中占主導(dǎo)地位，而clade A.2在煤礦土壤和自來水樣本中占主導(dǎo)地位[12]，clade B則在水稻田土壤及森林土壤中占比更高[23]。根據(jù)部分巢式PCR數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)灘涂沉積物中全程硝化菌clade A占主導(dǎo)地位，clade B只占小部分比例，這個(gè)結(jié)果也進(jìn)一步說明，在灘涂生態(tài)系統(tǒng)中，全程硝化菌clade A可能是主要的貢獻(xiàn)者。

不同季節(jié)對全程硝化菌群落組成存在較大影響。在夏季樣品中，全程硝化菌clade A.1比例高于clade A.2，而clade B則出現(xiàn)在秋冬兩季沉積物樣品中。推測不同季節(jié)的溫度可能是影響不同類型全程硝化菌分布的原因之一，而clade B相比于clade A可能更適合于低溫環(huán)境，clade A.1相比于clade A.2更適合于較高溫度。除季節(jié)外，沉積物深度也影響灘涂生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)[24]，冬夏兩季沉積物樣品中，在淺表層沉積物(1～5 cm)樣品中clade A.1比例明顯高于clade A.2，但在深層沉積物(5～10 cm)樣品中，clade A.2比例則明顯高于clade A.1。隨著沉積物深度增加溶氧會急劇下降[25-26]，因此，相比于clade A.1, clade A.2可能更適合于低氧環(huán)境。

RDA數(shù)據(jù)顯示了全程硝化菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性。沉積物中氨的分布特性對全程硝化菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性具有重要作用[27-28]。總氮含量(TN)、pH和硝酸鹽對全程硝化菌的生長也存在一定的相關(guān)性。相比于clade A.1, clade A.2與銨濃度呈負(fù)相關(guān)，表明clade A.2更傾向于在低銨濃度條件下生長；全程硝化菌clade B則與TC呈正相關(guān)，與硝酸鹽濃度呈負(fù)相關(guān)；pH對陸地環(huán)境中氨氧化菌分布及其生長活性具有重要影響[29-31]，本研究發(fā)現(xiàn)，全程硝化菌clade B與pH呈負(fù)相關(guān)，夏季灘涂沉積物中pH值較高，因此，除了溫度，高pH值也可能是導(dǎo)致全程硝化菌clade B的比例降低的原因。

本研究通過部分巢式PCR擴(kuò)增的方法研究灘涂樣品中全程硝化菌的群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)分布，了解季節(jié)和沉積物深度對不同類型全程硝化菌的影響，由于研究中樣品數(shù)量有限且未檢測微生物硝化活性，所以對于了解灘涂生態(tài)系統(tǒng)中影響全程硝化菌分布的因素，還存在一定的局限。為了解全程硝化菌在環(huán)境中的分布以及對其在不同灘涂生態(tài)系統(tǒng)中多樣性的分析，還需要通過更廣泛的灘涂樣品，找出不同類型全程硝化菌的分布規(guī)律并進(jìn)一步研究不同類型的全程硝化菌在灘涂系統(tǒng)中的貢獻(xiàn)度。