李志強，劉穎，林風(fēng)，吳麗云

(福建省微生物研究所，福建省紅曲微生物技術(shù)開發(fā)應(yīng)用工程研究中心，福建 福州，350007)

紅曲菌(Monascus)為一類小型、腐生的絲狀真菌[1]。紅曲起源于中國，被稱為我國的“國曲”，其可信的制作歷史已有上千年，是紅曲菌(Monascusspp.)發(fā)酵米飯制成的紫紅色曲米[2]。紅曲菌可產(chǎn)生莫納可林類、γ-氨基丁酸、麥角固醇及食用色素等多種有益代謝產(chǎn)物[3-5]，被廣泛用作食品著色劑、魚肉防腐劑、醋酒發(fā)酵劑以及心血管病治療藥物等[5-7]，因此開發(fā)紅曲菌具有重要的經(jīng)濟意義。目前我國工業(yè)化生產(chǎn)的紅曲產(chǎn)品主要有3類，即釀造紅曲、色曲和功能性紅曲，分別富含酯化酶或糖化酶、紅曲色素和莫納可林K[4,8]。以功能性紅曲為原料可開發(fā)成保健品和中藥，其代表產(chǎn)品分別為天曲牌益脂康片和血脂康膠囊[9]。

自ENDO[3]發(fā)現(xiàn)紅曲菌可以產(chǎn)生具有降血脂功能的莫納可林K(monacolin K，又名洛伐他汀)以來，國內(nèi)外興起紅曲產(chǎn)品開發(fā)的熱潮。然而，1977年WONG等[10]從紅曲中分離出一種抑菌因子monascidin A，該物質(zhì)在1995年被證實為一種真菌毒素——桔霉素(又叫桔青霉素，citrinin)[11]，對脊椎動物具有肝腎毒性、致畸性和致癌性，故紅曲菌及其發(fā)酵產(chǎn)品(包括紅曲)的安全性受到了人們的質(zhì)疑。因為桔霉素對人體的危害性極大，我國及其他一些國家和地區(qū)對紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)品的桔霉素含量制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)[8,12]。通過技術(shù)革新，我國紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品紅曲色素中的桔霉素問題基本得到了解決，但固態(tài)發(fā)酵紅曲米中的桔霉素超標(biāo)問題還未解決，這既影響我國紅曲產(chǎn)品的出口，又危害消費者的身體健康[12]。因此控制紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品中的桔霉素含量，使其符合相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)是紅曲產(chǎn)業(yè)亟需解決的課題?？梢酝ㄟ^優(yōu)化發(fā)酵條件、基因工程改造或菌株選育來控制紅曲中的桔霉素含量[5]；通過傳統(tǒng)的菌株選育已篩選到不產(chǎn)桔霉素可用于生產(chǎn)功能紅曲的菌株[13-14]。

鑒于控制紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)品中桔霉素含量的需求很迫切，研究人員開展了紅曲菌生物合成桔霉素通路的研究，試圖從分子水平上對紅曲菌株的產(chǎn)桔霉素特性進行鑒定，發(fā)現(xiàn)了一些紅曲菌的桔霉素生物合成相關(guān)基因[15-17]，并對幾種紅曲菌桔霉素生物合成相關(guān)基因的分布情況進行了研究[18]。由于紅曲菌合成桔霉素受培養(yǎng)條件和遺傳特性的影響，且同一株紅曲菌在不同培養(yǎng)條件下的發(fā)酵產(chǎn)物中的桔霉素含量往往有很大差異[5]，因此通過檢測發(fā)酵產(chǎn)物中是否含有桔霉素的產(chǎn)毒紅曲菌菌株的傳統(tǒng)鑒別方法，可能不太適合產(chǎn)桔霉素紅曲菌株的鑒定，亟需有效的檢測評價方法來減少菌株篩選的工作量，進一步確認(rèn)紅曲菌株產(chǎn)桔霉素的能力。

本研究以22株紅曲菌為研究對象，考察其基因組是否含有桔霉素生物合成相關(guān)基因，并檢測這些菌株通過固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲中的桔霉素含量，以探討菌株的桔霉素生物合成相關(guān)基因與采用現(xiàn)行桔霉素檢測方法制備的紅曲中桔霉素能否檢出的相關(guān)性，也為評價紅曲菌株產(chǎn)桔霉素的能力提供基本信息。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 菌株

本實驗選擇11株紫色紅曲菌(M.purpureus)和11株紅色紅曲菌(M.ruber)。其中福建省微生物研究所紅曲菌種資源庫10株，中國普通微生物菌種保藏管理中心4株，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心6株，美國模式培養(yǎng)物保存庫(ATCC)2株。

1.1.2 試劑

桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。甲醇和乙腈(色譜純)，德國Merck公司；H3PO4(色譜純)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷酸(dNTPs)、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)C，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基配制

馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，用于制備PDA斜面。種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50，蛋白胨15，酵母粉10，MgSO40.5，KH2PO41，NaNO33，用于固態(tài)發(fā)酵中紅曲菌種子液的制備。米飯培養(yǎng)基：市售大米50 g浸泡過夜，瀝干后裝入500 mL三角瓶中，用于固態(tài)發(fā)酵制備紅曲。以上培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器和設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀、2475熒光檢測器，美國Waters公司；XA105型電子分析天平(雙量程，d=0.01 mg/0.1 mg)，梅特勒-托利多公司；GR110DR型全自動高壓蒸汽滅菌鍋，廈門致微儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，Millipore公司；S1000 PCR儀，美國Bio-Rad公司；DYY-8C穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅曲菌株的ITS復(fù)核

對選取的菌株采用ITS測序和比對的方法進行菌種的復(fù)核，11株紅曲菌(R3、R5～R14)被鑒定為紫色紅曲菌，10株紅曲菌(R1、R2、R4、R15～R17、R19～R22)被鑒定為紅色紅曲菌，R18被鑒定為血紅紅曲菌(M.sanguineus)[19]。

1.3.2 紅曲的制備

將紅曲菌株接種至PDA斜面培養(yǎng)基活化后參照文獻制備種子液，將培養(yǎng)好的種子液按體積分?jǐn)?shù)10%接種量轉(zhuǎn)接于米飯培養(yǎng)基后進行固態(tài)發(fā)酵[14]。每個菌株固態(tài)發(fā)酵做3個平行樣本。固態(tài)發(fā)酵完成后，將紅曲米在60 ℃烘干，用料理機粉碎并過60目篩。

1.3.3 桔霉素含量的測定

參照GB 5009.222—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中桔青霉素的測定》中的免疫親和柱凈化-高效液相色譜法檢測紅曲米中的桔霉素含量[20]。使用Waters公司的2695高效液相色譜儀及2475熒光檢測器。液相色譜條件、所制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限見文獻[19]。

1.3.4 桔霉素生物合成相關(guān)基因的擴增及測序

菌株的液體培養(yǎng)參照文獻[21]，培養(yǎng)完成后收集菌絲體用滅菌蒸餾水清洗。獲得純度高、完整性好的DNA是進行分子生物學(xué)研究的前提條件，因此采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB)法提取DNA。取約200 mg清洗過的菌絲體放入滅菌的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末，再加入CTAB提取緩沖液提取DNA，用異丙醇沉淀DNA后采用蒸餾水溶解。

桔霉素聚酮合酶(citrinin polyketide synthase)基因pksCT的引物為pksCTF (5’-TGATGCGACGAAGATGTTAC-3’) 和pksCTR (5’-TCTCTATGCTGCGACTGAC-3’)[13]，擴增產(chǎn)物長度理論上為429 bp。以紫色紅曲菌 (AB243687) 和橙色紅曲菌(M.aurantiacus，EU309474) 的桔霉素生物合成相關(guān)基因簇作為引物設(shè)計的模板，采用Primer 5.0設(shè)計的轉(zhuǎn)錄激活因子ctnA的引物為ctnAF (5’-AACGGACAGGAAGAGCGTGC-3’) 和ctnAR (5’-CACACCACCGATGCCATACC-3’)，擴增的片段長度理論上為1520 bp。PCR反應(yīng)總體積為50 μL： 10×PCR反應(yīng)緩沖液 5 μL，dNTPs(4種濃度均為2.5 mmol/L)1 μL，引物(均為10 μmol/L)各1 μL，TaqDNA聚合酶2 U，DNA模板2 μL，加滅菌蒸餾水至50 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，33個循環(huán)；72 ℃終末延伸10 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，陽性樣本送測序公司用凝膠回收試劑盒回收目的片段后進行雙向測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲米中桔霉素含量的測定

表1為22株紅曲菌通過固態(tài)發(fā)酵所制紅曲米中桔霉素含量的測定結(jié)果。用11株紫色紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲中均檢出桔霉素，只有R8的桔霉素含量(18.37 μg/kg)最低，R14的含量為377.90 μg/kg，其他9份紅曲中的桔霉素含量均高于1 000 μg/kg。在10株紅色紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲中只在4份紅曲(R4、R15、R16和R17)中檢出桔霉素，其含量為59.25～137.45 μg/kg，其他6份紅曲中未檢出桔霉素。血紅紅曲菌R18生產(chǎn)的紅曲中未檢出桔霉素。

表1 22株紅曲菌所制作的紅曲中桔霉素含量檢測及桔霉素相關(guān)基因擴增結(jié)果Table 1 Citrinin contents of 22 samples of red yeast rice and the amplification results of citrinin biosynthesis related genes

2.2 紅曲菌桔霉素生物合成相關(guān)基因的擴增

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，用引物pksCTF和pksCTR在22株紅曲菌中的擴增產(chǎn)物均為單一條帶，其片段長度符合預(yù)期。但只在紅曲米中桔霉素檢測為陽性的紅曲菌中用ctnAF和ctnAR擴增出單一條帶，其片段長度符合預(yù)期。DNA序列分析表明本研究從10株紅色紅曲菌和11株紫色紅曲菌中擴增的pksCT基因片段完全相同，與紫色紅曲菌AB243687的序列相似性均為100%；而血紅紅曲菌R18與紅色紅曲菌和紫色紅曲菌在擴增的pksCT片段有11個位點的差異，其中包括1個位點的單堿基缺失(AB243687的對應(yīng)位點為9707T)(圖1)。3次擴增及測序結(jié)果均顯示血紅紅曲菌R18的pksCT基因片段在此位點有單堿基缺失(圖2)。

圖1 pksCT基因片段的多重排序Fig.1 Multiple sequence alignment of pksCT fragments

圖2 pksCT 基因片段的測序圖譜，顯示血紅紅曲菌R18的pksCT基因片段的單堿基缺失位點Fig.2 Chromatogram of the pksCT fragments. A single-base deletion was observed in the pksCT fragments of M.sanguineus R18

本研究中擴增的pksCT基因片段位于編碼區(qū)，DNA序列的翻譯分析表明該單堿基缺失會引起蛋白質(zhì)編碼基因的移碼突變從而導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)及多個終止密碼子，這表明血紅紅曲菌R18的pksCT基因不能指導(dǎo)合成有功能的桔霉素聚酮合酶。產(chǎn)桔霉素的4株紅色紅曲菌和11株紫色紅曲菌的ctnA基因片段之間沒有序列變異，與紫色紅曲菌AB243687的序列相似性均為100%。

3 討論

紅曲菌可用于生產(chǎn)紅曲(為藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材)及食用色素，因此闡明紅曲生產(chǎn)菌株的產(chǎn)桔霉素能力是非常重要的。桔霉素、紅曲色素和莫納可林K均屬于聚酮類次生代謝產(chǎn)物，該類物質(zhì)生物合成途徑中的關(guān)鍵酶為聚酮合酶。近年來，研究者采用分子生物學(xué)方法對紅曲菌株的桔霉素生物合成相關(guān)基因進行了研究。研究結(jié)果表明，通過同源重組破壞紫色紅曲菌IFO30873的pksCT基因?qū)е略摼晖耆珕适Я水a(chǎn)桔霉素的能力[15]，破壞轉(zhuǎn)錄激活因子的編碼序列ctnA則導(dǎo)致該菌株pksCT的轉(zhuǎn)錄大幅下降及發(fā)酵液中的桔霉素含量降低至幾乎檢測不出的水平[16]。我國學(xué)者通過構(gòu)建fosmid文庫對橙色紅曲菌AS3.4384的桔霉素合成相關(guān)基因簇進行了研究，其基因序列號為EU309474[17]。經(jīng)DNA序列比較，紫色紅曲菌 (AB243687) 和橙色紅曲菌(EU309474)的桔霉素生物合成相關(guān)基因簇的DNA序列相似性為100%。據(jù)報道，利用高產(chǎn)桔霉素的野生型橙色紅曲菌AS3.4384構(gòu)建的pksCT基因缺失株P(guān)HDS26在液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵中的桔霉素產(chǎn)量均有不同程度下降，其中在酵母浸膏蔗糖培養(yǎng)基和米粉培養(yǎng)基的液態(tài)發(fā)酵及大米固態(tài)發(fā)酵中均降低了97%以上[22-23]。這些研究表明，pksCT和ctnA為紅曲菌桔霉素生物合成的關(guān)鍵基因，也為從分子水平上鑒別產(chǎn)桔霉素的紅曲菌株提供了理論基礎(chǔ)。

研究者對一些紅曲菌的桔霉素生物合成相關(guān)基因的分布情況進行了研究。在CHEN等[18]的研究中，選用的4株M.purpureus和1株M.kaoliang(為M.purpureus的同種異名[24])均具有pksCT和ctnA基因，都可產(chǎn)生桔霉素；而6株M.ruber均缺失pksCT和ctnA基因，發(fā)酵產(chǎn)物的桔霉素檢測呈陰性；M.sanguineusATCC200613 的pksCT在擴增的編碼區(qū)有1個位點的單堿基缺失(AB243687的對應(yīng)位點為10453C，該單堿基缺失會引起移碼突變從而導(dǎo)致生成沒有功能的桔霉素聚酮合酶)，且不具有ctnA基因，發(fā)酵產(chǎn)物的桔霉素檢測為陰性。付桂明等[25]對14株產(chǎn)桔霉素的紅曲菌的pksCT基因的2個片段(包括翻譯起始區(qū)部分序列669 bp和終止密碼子區(qū)部分序列591 bp)進行了分析，發(fā)現(xiàn)14株紅曲菌的這2個DNA片段序列之間分別具有高度同源性，均與M.purpureus(AB167465)的pksCT對應(yīng)的區(qū)域序列一致。朱麗萍等[26]的研究結(jié)果表明，PCR擴增桔霉素合成相關(guān)基因為陽性的菌株，其發(fā)酵制備的紅曲中桔霉素含量超過了QB/T 2847—2007《功能性紅曲米(粉)的桔霉素》限量標(biāo)準(zhǔn)50 μg/kg。由于ctnA編碼的轉(zhuǎn)錄激活因子正向調(diào)控紅曲菌生物合成桔霉素[16]，因此6株M.ruber所生產(chǎn)的紅曲米中未檢出桔霉素可能與這些菌株缺失ctnA有關(guān)；而M.sanguineusR18所生產(chǎn)的紅曲米中桔霉素檢測陰性可能與該菌株的pksCT無功能化有關(guān)。本研究結(jié)果也表明，所用紅曲菌菌株的桔霉素合成相關(guān)基因(pksCT和ctnA)擴增結(jié)果均為陽性與菌株所制備的紅曲中桔霉素檢測陽性結(jié)果具有高度的一致性。

CHEN等[18]只在M.purpureus和M.kaoliang中擴增出有功能的pksCT和ctnA。本研究在產(chǎn)桔霉素的4株M.ruber和11株M.purpureus中均擴增出有功能的pksCT和ctnA，且與M.purpureusAB243687的pksCT和ctnA的DNA序列相似性均為100%。完整的ctnA序列包含了4個短內(nèi)含子[16]，本研究中擴增的ctnA序列包含了前3個內(nèi)含子。一般認(rèn)為內(nèi)含子的進化速率遠(yuǎn)高于外顯子，產(chǎn)桔霉素的M.ruber和M.purpureus的ctnA和pksCT之間分別沒有序列變異表明產(chǎn)桔霉素的M.ruber和M.purpureus的桔霉素生物合成相關(guān)基因ctnA和pksCT高度保守。CHEN等[18]在其所用的M.ruber菌株中均未擴增出pksCT和ctnA，而本研究中所有M.ruber菌株(桔霉素檢測為陰性或陽性)均擴增出pksCT，但只在產(chǎn)桔霉素的M.ruber菌株中擴增出ctnA，這表明M.ruber的pksCT和ctnA基因存在與否具有多樣性。M.sanguineusATCC200613 的pksCT基因的單堿基缺失位點對應(yīng)AB243687的位點為10453C，本研究中新發(fā)現(xiàn)的M.sanguineusR18的單堿基缺失位點對應(yīng)AB243687的位點為9707T，這表明M.sanguineus的pksCT在多個位點有堿基缺失。由于紅曲菌合成桔霉素受培養(yǎng)條件和遺傳特性的影響[5]，且紅曲中桔霉素的檢測結(jié)果受所用檢測方法和儀器靈敏度的影響，因此桔霉素生物合成相關(guān)基因pksCT和ctnA基因的擴增可作為篩選低產(chǎn)甚或不產(chǎn)桔霉素紅曲菌株的補充方法，以確認(rèn)低產(chǎn)或不產(chǎn)桔霉素紅曲菌株的基因特性。該方法簡單、快速，可節(jié)約檢測時間和檢測成本。