韓云雪 李麗梅 石潔瓊

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，桂林 541000)

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理生理過程，是各種數(shù)慢性肝病發(fā)展為肝硬化不可逾越的階段[1,2]。因此，遏制肝纖維化的發(fā)生對(duì)預(yù)防肝硬化具有至關(guān)重要的意義。雞血藤，又名血風(fēng)藤、馬鹿藤、紫梗藤，是我國一種傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)血行血、通經(jīng)活絡(luò)、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜催眠等作用[3-6]。近年來，有研究指出，黃芪雞血藤湯具有預(yù)防大鼠肝纖維化的功效，其機(jī)制可能與TGF-β1信號(hào)通路有關(guān)[7]。為研究雞血藤抗肝纖維化的機(jī)制，參照文獻(xiàn)[8]構(gòu)建肝纖維化動(dòng)物模型，初步探討TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路在雞血藤提取物預(yù)防肝纖維化中的作用，為雞血藤提取物在肝纖維化疾病中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 8只Wistar雄性大鼠(體質(zhì)量200～250 g)購于上海凱學(xué)生物科技有限公司；M199培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco公司；二甲基亞硝胺(DMN)和Ⅳ型膠原酶購于美國Sigma公司；雞血藤購于廣東南領(lǐng)藥業(yè)有限公司；無效對(duì)照劑Placebo和TGF-β1信號(hào)通路激活劑SRI-011381購于美國GLPBIO公司；鼠源Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)抗體、兔源p38MAPK抗體、兔源CyclinD1抗體、兔源P21抗體、兔源GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠以及羊抗兔Ⅱ抗購于美國Abcam公司；鼠源TGF-β1抗體購于美國Santa Cruz公司。MTT試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、Western封閉液、洗滌液、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1雞血藤提取物的制備 雞血藤提取物制備參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。取一定量的雞血藤粉末，加30倍量體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，回流提取1.5 h，共提取3 次；合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，乙醇回收，用純化水定容至生藥濃度為1 g/ml。給藥前用純水稀釋為2、4、8 mg/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2肝纖維化大鼠模型構(gòu)建 采用二甲基亞硝胺(DMN)按照10 mg/kg腹腔注射大鼠，共3周，每周注射3次。

1.2.3大鼠肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)、分組和處理 大鼠肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。經(jīng)門靜脈灌流Ⅳ型膠原酶消化液分散肝細(xì)胞，采用淋巴細(xì)胞分離液行密度梯度離心純化肝細(xì)胞，用含10%胎牛血清199培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml接種培養(yǎng)于培養(yǎng)皿(內(nèi)置蓋玻片)，4 h后更換5%胎牛血清199培養(yǎng)液，貼壁培養(yǎng)48 h后將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(纖維化肝細(xì)胞，用5%胎牛血清)、雞血藤提取物處理組(分別用雞血藤濃度為2、4、8 mg/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液處理纖維化肝細(xì)胞)、雞血藤提取物4 mg/ml+Placebo組(用雞血藤提取物濃度為4 mg/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液處理纖維化肝細(xì)胞后，用Placebo處理)、雞血藤提取物4 mg/ml+SRI-011381組(用雞血藤提取物濃度為4 mg/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液處理纖維化肝細(xì)胞后，用10 μmol/L的SRI-011381處理)。另設(shè)置正常肝細(xì)胞組。

1.2.4MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力 將纖維化肝細(xì)胞按照1×104個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，按照1.2.3實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行細(xì)胞處理，分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時(shí)，各取一組細(xì)胞，向每孔內(nèi)加入20 μl的MTT試劑，孵育4 h后，吸去上清液，再向每孔內(nèi)加入150 μl DMSO，繼續(xù)孵育2 h直到結(jié)晶充分溶解，全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處各孔細(xì)胞的吸光度(OD)值。

1.2.5Western blot檢測Col Ⅰ、TGF-β1、p38MAPK、CyclinD1和P21蛋白的表達(dá) 采用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測細(xì)胞蛋白濃度。取適量細(xì)胞蛋白，100℃水溶加熱3～5 min使細(xì)胞蛋白充分變性，取30 μg變性細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將已分離的細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。然后，用Western封閉液4℃封閉過夜，吸盡封閉液后，Western洗膜液漂洗膜3次，每次10 min，隨后加入已稀釋的抗Col Ⅰ、TGF-β1、p38MAPK、CyclinD1、P21和GAPDH的Ⅰ抗(P21為1∶1 000稀釋，GAPDH為1∶2 500稀釋，其他均為1∶500稀釋)，室溫條件孵育2 h后，再次用Western洗膜液漂洗膜3次，每次10 min，然后加入相應(yīng)的Ⅱ抗，室溫條件孵育1 h后，于暗處進(jìn)行ECL顯影，拍照后，采用Image J軟件對(duì)目的條帶灰度值進(jìn)行定量分析(以GAPDH為內(nèi)參)。

2 結(jié)果

2.1纖維化肝細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中TGF-β1/p38MAPK、Col Ⅰ的表達(dá) 與正常肝細(xì)胞相比，纖維化肝細(xì)胞中Col Ⅰ、TGF-β1以及p38MAPK蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 TGF-β1/p38MAPK、Col Ⅰ在纖維化肝細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)Tab.1 Expressions of TGF-β1/p38MAPK and Col Ⅰ in fibrotic hepatocytes and normal

圖1 TGF-β1/p38MAPK、Col Ⅰ在纖維化肝細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of TGF-β1/p38MAPK and Col Ⅰ in protein fibrotic hepatocytes and normal hepatocytesNote:1.Hepatocyte；2.Fibrotic hepatocyte.

2.2雞血藤提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組比較，雞血藤提取物處理組纖維化肝細(xì)胞CyclinD1蛋白的表達(dá)顯著降低，P21蛋白的表達(dá)顯著升高，細(xì)胞在24 h、48 h、72 h時(shí)細(xì)胞活力顯著降低，并呈顯著的濃度依賴性(P<0.05)。表明雞血藤提取物處理能夠抑制纖維化肝細(xì)胞的增殖，選用抑制率約為50%的雞血藤提取物濃度(4 mg/ml)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn),見圖2、表2。

表2 雞血藤提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞增殖的影響Tab.2 Effects of extracts from Caulis C on proliferation of fibrotic

圖2 雞血藤提取物纖維化肝細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of extract from Caulis C on the expression of proliferative protein in fibrotic hepatocytesNote:1.Control;2.Caulis C 2 mg/ml;3.Caulis C 4 mg/ml;4.Calis C 8 mg/ml.

2.3雞血藤提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞中TGF-β1/p38MAPK及Col Ⅰ的影響 與對(duì)照組比較，雞血藤提取物4 mg/ml組纖維化肝細(xì)胞中TGF-β1、Col Ⅰ以及p38MAPK蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。表明雞血藤提取物能夠抑制纖維化肝細(xì)胞Col Ⅰ表達(dá)，抑制TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路，見圖3、表3。

表3 雞血藤提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞中TGF-β1/p38MAPK及Col Ⅰ表達(dá)的影響Tab.3 Effects of extracts from Caulis C on expression of TGF-β1/p38MAPK and Col Ⅰ in fibrotic

圖3 雞血藤提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞中TGF-β1/p38MAPK及Col Ⅰ表達(dá)的影響Fig.3 Effects of extract from Caulis C on expression of TGF-β1/p38MAPK and Col Ⅰ in fibrotic hepatocytesNote:1.Control；2.Caulis C 4 mg/ml.

2.4TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路激活劑SRI-011381能逆轉(zhuǎn)雞血藤提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞增殖的影響 圖4和表4顯示，與對(duì)照組比較，雞血藤提取物4 mg/ml組纖維化肝細(xì)胞CyclinD1蛋白的表達(dá)顯著降低，P21蛋白的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞增殖活力顯著降低；與雞血藤提取物4 mg/ml+Placebo組相比，雞血藤提取物4 mg/ml+SRI-011381組纖維化肝細(xì)胞CyclinD1蛋白的表達(dá)水平顯著升高，P21蛋白的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞增殖活力顯著升高(P<0.05)。

表4 SRI-011381可逆轉(zhuǎn)雞血藤提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞增殖的抑制作用Tab.4 SRI-011381 can reverse inhibitory effect of extract from Caulis C on proliferation of fibrotic

圖4 SRI-011381能逆轉(zhuǎn)雞血藤提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞增殖的影響Fig.4 SRI-011381 can reverse effect of extract from Caulis C on proliferation of fibrotic hepatocytesNote: 1.Control;2.Caulis C 4 mg/ml;3.Caulis C 4 mg/ml+Placebo;4.Caulis C 4 mg/ml+SRI-011381.

2.5TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路激活劑SRI-011381能逆轉(zhuǎn)雞血藤提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞ConⅠ表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，雞血藤提取物4 mg/ml組纖維化肝細(xì)胞TGF-β1、及Col Ⅰ以及p38MAPK蛋白的表達(dá)水平顯著降低；與雞血藤提取物4 mg/ml+Placebo組相比，雞血藤提取物4 mg/ml+SRI-011381組纖維化肝細(xì)胞TGF-β1、Col Ⅰ以及p38MAPK蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),見圖5、表5。

圖5 TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路激活劑SRI-011381能逆轉(zhuǎn)雞血藤提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞ConⅠ表達(dá)的影響Fig.5 TGF-β1/p38MAPK signal pathway activator SRI-011381 can reverse effect of extract from Caulis C on ConⅠ expression in fibrotic hepatocytesNote: 1.Control;2.Caulis C 4 mg/ml;3.Caulis C 4 mg/ml+Placebo;4.Caulis C 4 mg/ml+SRI-011381.

表5 SRI-011381能逆轉(zhuǎn)雞血藤提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞TGF-β1/p38MAPK及ConⅠ表達(dá)的影響Tab.5 SRI-011381 can reverse effects of extracts from Caulis C on expression of TGF-β 1/p38MAPK and ConⅠ in fibrotic

3 討論

肝纖維化是肝臟對(duì)各種原因所致肝臟損傷的修復(fù)愈合反應(yīng)，以細(xì)胞外基質(zhì)的大量積累為特征，是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)過程。目前，臨床尚無安全有效的治療肝硬化的藥物，但近年來中藥及其天然產(chǎn)物在抗肝纖維化中的療效引起研究者的廣泛關(guān)注。二甲基亞硝胺(DMN)具有肝臟毒性，是一種常用的肝纖維化誘導(dǎo)劑，已被廣泛用于構(gòu)建肝纖維化動(dòng)物模型[10，11]。本研究采用DMN腹腔注射建立肝纖維化動(dòng)物模型，觀察雞血藤提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞生成膠原蛋白和TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路的影響，并探討雞血藤提取物的保肝作用機(jī)制。

肝細(xì)胞能合成多種膠原蛋白，主要以Col Ⅰ為主，但在正常情況下，肝細(xì)胞的Col Ⅰ合成能力較低或處于抑制狀態(tài)，而在肝纖維化時(shí)Col Ⅰ合成顯著增加。當(dāng)肝纖維化時(shí)，TGF-β1通過多種方式激活肝星狀細(xì)胞(HSC)，促進(jìn)Col Ⅰ的合成，抑制蛋白酶水解酶的合成及分泌，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)積累增強(qiáng)而降解減少。TGF-β1通過調(diào)控TGF-β1/p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路將細(xì)胞外刺激傳導(dǎo)至HSC，促進(jìn)HSC活化，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[12]。本實(shí)驗(yàn)中，DMN腹腔注射后，原代培養(yǎng)大鼠纖維化肝細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Col Ⅰ、TGF-β1以及p38MAPK蛋白的表達(dá)顯著升高，大鼠肝纖維化模型構(gòu)建成功。

雞血藤的保肝作用是近年來的研究熱點(diǎn)。李蓉等[13]研究發(fā)現(xiàn)，利用黃芪雞血藤湯灌胃能有效預(yù)防實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的形成，其機(jī)制可能與TGF-β1、CTGF和PDGF-BB表達(dá)，抑制肝星狀細(xì)胞的活化有關(guān)；盧識(shí)禮等[9]研究發(fā)現(xiàn)，雞血藤醇提物具有較好的降血脂和抗氧化保肝作用；此外，有研究顯示雞血藤總黃酮對(duì)肝癌細(xì)胞的生長具有抑制作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，雞血藤提取物處理后，纖維化肝細(xì)胞的增殖活力顯著降低，CyclinD1蛋白的表達(dá)水平顯著降低，P21蛋白的表達(dá)顯著升高，Col Ⅰ、TGF-β1以及p38MAPK蛋白的表達(dá)顯著減少。表明雞血藤提取物提取物可顯著抑制纖維化肝細(xì)胞增殖，抑制Col Ⅰ合成，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/p38MAPK通路活化有關(guān)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證雞血藤提取物是通過激活TGF-β1/p38MAPK通路進(jìn)而發(fā)揮抗肝纖維化作用，使用TGF-β1信號(hào)通路激活劑SRI-011381激活TGF-β1/p38MAPK通路，發(fā)現(xiàn)激活TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路能逆轉(zhuǎn)雞血藤提取物對(duì)纖維化肝細(xì)胞增殖及Col Ⅰ表達(dá)的影響。提示雞血藤提取物通過抑制TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路，抑制Col Ⅰ合成，發(fā)揮抗肝纖維化作用，這與曹清等[15]報(bào)道TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路在大黃酸逆轉(zhuǎn)肝纖維化過程中作用相吻合。此外，魏潔等[16]研究顯示，姜黃素對(duì)肝纖維化的治療作用也與負(fù)性調(diào)控TGF-β1表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，雞血藤提取物通過抑制TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路，抑制纖維化肝細(xì)胞增殖和Col Ⅰ的合成，進(jìn)而發(fā)揮抗肝纖維化作用。本研究的發(fā)現(xiàn)為雞血藤提取物的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)，雞血藤提取物有望成為肝纖維化的預(yù)防和治療藥物。