張松濤， 王櫻蕙， 張洪杰,3*

(1. 中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所 稀土資源與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 吉林 長(zhǎng)春 130022；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049; 3. 清華大學(xué) 化學(xué)系， 北京 100084)

1 引 言

熒光成像技術(shù)是利用光學(xué)檢測(cè)器采集熒光探針發(fā)光進(jìn)行實(shí)時(shí)成像的一種非侵入式的成像技術(shù)[1]，具有成像速度快、靈敏度高、時(shí)空分辨率高、無(wú)輻射等優(yōu)點(diǎn)[2-4]，在腫瘤診斷、小分子體內(nèi)檢測(cè)、生物傳感、免疫分析和防偽等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用潛力[5-9]。而激發(fā)和發(fā)射光穿過(guò)生物組織時(shí)所產(chǎn)生的組織內(nèi)吸收、散射及自體熒光干擾是影響熒光成像分辨率和組織穿透深度的主要因素。其中，不同波長(zhǎng)的光在穿過(guò)生物組織時(shí)由于生物組織中不同組分(如水、脂質(zhì)膜和亞細(xì)胞器等)的折射率存在差異而發(fā)生散射，該過(guò)程會(huì)將部分成像的光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡s散光而增加背景噪音，從而導(dǎo)致成像信噪比差。不同組織對(duì)不同波段光的散射強(qiáng)度如圖1(a)所示，其關(guān)系符合經(jīng)驗(yàn)公式：μ′s=λ-ω(λ：波長(zhǎng)，ω=0.22～1.68，數(shù)值取決于組織的種類)[10-11]。由此可見(jiàn)，隨著波長(zhǎng)的增加生物組織對(duì)光的散射強(qiáng)度會(huì)有所減弱。另外，生物組織內(nèi)的許多生物分子所含的發(fā)色基團(tuán)可吸收激發(fā)或發(fā)射光并將其轉(zhuǎn)換為熱量被耗散掉或者產(chǎn)生熒光而增加自體熒光背景干擾，導(dǎo)致組織穿透深度淺，成像信噪比低[12-13]。幸運(yùn)的是，由于波長(zhǎng)越長(zhǎng)其光子的能量越低，生物組織的自體熒光強(qiáng)度將隨著波長(zhǎng)的增加而逐漸減弱(圖1(b))。當(dāng)波長(zhǎng)超過(guò)1 500 nm后，生物組織在該波段的自體熒光強(qiáng)度幾乎降至為零，從而具有更高的成像信噪比?？傊?，相較于可見(jiàn)光區(qū)(400～700 nm)和近紅外一區(qū)(700～1 000 nm)熒光成像，生物組織對(duì)近紅外二區(qū)(1 000～1 700 nm)光具有更弱的吸收(圖1(c)～(d))和散射，以及更低的自體熒光，因此近紅外二區(qū)熒光成像因具有更深的組織穿透能力和更高的成像信噪比等極具競(jìng)爭(zhēng)力的優(yōu)勢(shì)而受到人們的青睞[1,14-15]。例如，在淋巴管熒光成像上，可見(jiàn)光區(qū)和近紅外一區(qū)成像的信噪比(Signal-to-noise ratio,SNR)分別為1.4和1.3(波長(zhǎng)： 520 nm 和720 nm)，而近紅外二區(qū)成像的信噪比可高達(dá)3.3、 7.3 和10.5(波長(zhǎng)：1 100，1 300，1 500 nm)，在很大程度上提升了淋巴管造影的準(zhǔn)確度[16]。另外，可見(jiàn)光區(qū)和近紅外一區(qū)成像的組織穿透深度分別約為1 mm[17]和 1～3 mm[18-19]，而近紅外二區(qū)成像的組織穿透深度可達(dá)到1～2 cm[20]，為深層組織的熒光成像提供了可能。因此，實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高分辨率和高信噪比的深層組織熒光成像的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)開發(fā)高質(zhì)量的近紅外二區(qū)(1 000～1 700 nm)熒光成像探針。

圖1 (a)不同組織的衰減散射因子隨波長(zhǎng)的變化曲線[10]；(b)小鼠肝臟(黑色曲線)、脾(紅色曲線)、心臟(藍(lán)色曲線)在808 nm激光照射下的自熒光光譜[15]；(c)不同生物組織的吸收光譜[14]；(d)水的吸收光譜(光程長(zhǎng)1 mm)，OD：光密度[1]。Fig.1 (a)Reduced scattering coefficients of different biological tissues and of intralipid tissue phantom[10]. (b)Autofluorescence spectra of mouse liver(black), spleen(red), and heart tissue(blue) under 808 nm light. Inset shows the enlarged results at longer wavelengths[15]. (c)Absorbance spectra of various biological tissues[14]. (d)Absorption spectrum of water through a 1-mm-long path. OD, optical density[1].

近些年，隨著納米科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，研究人員設(shè)計(jì)開發(fā)了許多種類的近紅外二區(qū)熒光探針，并探索了其在腫瘤成像診斷、血管造影、腦組織成像和免疫分析等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，如：量子點(diǎn)[21-25]、單壁碳納米管[11,26-27]、有機(jī)染料[28-35]、共軛高分子[36]等。但是這些熒光探針在穩(wěn)定性、生物安全性等方面仍存在著一些瓶頸問(wèn)題，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。例如，量子點(diǎn)探針中含有強(qiáng)毒性的重金屬元素(如鉛、鎘和汞)，存在生物安全隱患；單壁碳納米管探針的熒光發(fā)射峰寬(約幾百納米)；有機(jī)染料探針的斯托克斯位移小，易受激發(fā)光信號(hào)的干擾，并且染料分子自身也容易發(fā)生光漂白；共軛高分子探針的水溶性差且易發(fā)生團(tuán)聚。近年來(lái)，稀土近紅外二區(qū)熒光探針因具有光穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性好、發(fā)射半峰寬窄(10～20 nm)等諸多優(yōu)勢(shì)而受到人們的廣泛關(guān)注[5-6,37-41]。此外，由于自體熒光的壽命短(<10 ns)，而稀土近紅外二區(qū)熒光探針則具有激發(fā)態(tài)壽命長(zhǎng)且可調(diào)諧(μs-ms)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，因此可將其從光譜域成像拓展至?xí)r間域成像(時(shí)間分辨成像)，即熒光壽命多通道成像和時(shí)間門控成像，從而進(jìn)一步削弱了背景熒光的干擾，顯著提高了成像的信噪比。因此，本文從稀土熒光探針的發(fā)光機(jī)理和設(shè)計(jì)合成為出發(fā)點(diǎn)，包括基質(zhì)材料、敏化離子及發(fā)光中心的選擇，系統(tǒng)地綜述了這類納米材料在近紅外二區(qū)熒光成像方面的最新研究進(jìn)展(包含光譜域和時(shí)間域兩大類成像模式)，并對(duì)其亟需解決的問(wèn)題及未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

2 稀土近紅外二區(qū)熒光探針的發(fā)光機(jī)理及性能調(diào)控

稀土發(fā)光納米材料由基質(zhì)材料、敏化離子和發(fā)光中心三部分組成。首先，基質(zhì)材料應(yīng)滿足光學(xué)透明和晶格聲子能量低的要求，目前主要是以氟化物作為基質(zhì)。其次，對(duì)敏化離子和發(fā)光中心的選擇不僅決定著激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)而且還影響著近紅外二區(qū)發(fā)射光的強(qiáng)度。因此，合理、科學(xué)的選擇尤為重要。稀土熒光探針在合適波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下，敏化離子的基態(tài)電子首先被激發(fā)到激發(fā)態(tài)，而后將能量傳遞給發(fā)光中心，發(fā)光中心被激發(fā)到激發(fā)態(tài)，最后其激發(fā)態(tài)電子重新返回到基態(tài)后發(fā)射出近紅外二區(qū)熒光。因此，要求敏化離子在近紅外一區(qū)或者二區(qū)須具有較大的吸收截面，如Nd3+、Yb3+、Er3+和Tm3+(圖2(a))。另外，具有近紅外二區(qū)發(fā)射的發(fā)光中心主要有Nd3+(發(fā)射波長(zhǎng)：1 064 nm和1 330 nm)、Ho3+、Pr3+、Tm3+和Er3+(發(fā)射波長(zhǎng)分別為1 155，1 269，1 475，1 525 nm)(圖2(a))[6]。截至目前，以摻雜的敏化離子和發(fā)光離子來(lái)劃分，稀土近紅外二區(qū)熒光探針的發(fā)光機(jī)理主要分為以下五大體系：(1)單離子體系——Nd3+或Er3+離子(圖2(b)),(2)Yb3+-Ln3+體系(Ln=Ho、Pr、Tm或Er)(圖2(c)),(3)Nd3+-Yb3+-Ln3+體系(Ln=Ho、Pr、Tm或Er)(圖2(d))[42],(4)Er3+-Ln3+體系(Ln=Ho、Tm 或 Nd)(圖2(e))[43],(5)Tm3+-Er3+體系(圖2(f))[44]。

具體來(lái)說(shuō)，(1)單離子體系。因?yàn)镹d3+和Er3+離子在近紅外一區(qū)和二區(qū)既有吸收截面又有熒光發(fā)射，因此其既可做敏化離子來(lái)吸收激發(fā)光能量又可充當(dāng)發(fā)光離子發(fā)射近紅外二區(qū)熒光。在730 nm、808 nm或860 nm激光照射下，Nd3+捕獲激發(fā)光的能量后，其處于4I9/2基態(tài)的電子分別被激發(fā)到4F7/2、4F5/2或4F3/2能級(jí)，而后處于4F7/2和4F5/2激發(fā)態(tài)的電子非輻射弛豫至4F3/2能級(jí)，最后處于4F3/2激發(fā)態(tài)的電子可分別輻射躍遷至4I11/2和4I13/2能級(jí)而發(fā)射出1 064和1 330 nm的近紅外二區(qū)熒光(圖2(b)左)。就Er3+而言，4I15/2基態(tài)電子吸收808 nm或980 nm激發(fā)光能量后被激發(fā)至4I9/2或4I11/2能級(jí)，而后非輻射弛豫至4I13/2能級(jí)發(fā)生4I13/2→4I15/2躍遷從而發(fā)射約1 550 nm近紅外二區(qū)熒光(圖2(b)右)。(2)Yb3+-Ln3+體系(Ln=Ho、Pr、Tm或Er)。在該體系中，Yb3+離子作為敏化離子，其2F7/2基態(tài)電子吸收980 nm激發(fā)光能量后被激發(fā)至2F5/2能級(jí)。在Yb3+-Ho3+離子共摻雜的納米晶中，Yb3+吸收的能量可通過(guò)2F5/2(Yb3+)+5I8(Ho3+)→2F7/2(Yb3+)+5I6(Ho3+)能量傳遞過(guò)程將能量傳遞給Ho3+離子以增加5I6(Ho3+)激發(fā)態(tài)電子數(shù)，最后Ho3+發(fā)生5I6→5I8(Ho3+)輻射躍遷而發(fā)射1 155 nm近紅外二區(qū)熒光。在Yb3+-Pr3+或Er3+離子共摻雜的納米晶中, 其能量轉(zhuǎn)移過(guò)程與上述過(guò)程類似。最后Pr3+和Er3+離子分別發(fā)生1G4→3H5(Pr3+)和4I13/2→4I15/2(Er3+)輻射躍遷而產(chǎn)生1 289 nm和1 525 nm近紅外二區(qū)熒光發(fā)射。而就Yb3+-Tm3+離子共摻雜的納米晶而言，在經(jīng)過(guò)雙光子上轉(zhuǎn)換過(guò)程后，Tm3+離子的基態(tài)電子被激發(fā)至能量更高的3F2和3F3能級(jí)，而后非輻射弛豫至3H4能級(jí)，最后輻射躍遷至3F4而發(fā)射1 475 nm近紅外二區(qū)熒光(圖2(c))。(3)Nd3+-Yb3+-Ln3+體系(Ln=Ho、Pr、Tm或Er)。該體系用Nd3+和Yb3+雙敏化離子的共敏化策略將激發(fā)波長(zhǎng)從980 nm調(diào)節(jié)至808 nm。即Nd3+離子的4I9/2基態(tài)電子吸收808 nm激發(fā)光能量后被激發(fā)至4F5/2能級(jí)，而后該能級(jí)的能量可通過(guò)4F3/2(Nd3+)+2F7/2(Yb3+)→4I9/2(Nd3+)+2F5/2(Yb3+)能量傳遞過(guò)程將其傳遞給Yb3+離子，最后通過(guò)不同的能量傳遞過(guò)程將能量傳遞給不同的發(fā)光離子，其機(jī)理同Yb3+-Ln3+體系(Ln=Ho、Pr、Tm或者Er)(圖2(d))。(4)Er3+-Ln3+體系(Ln=Ho、Tm 或Nd)。由于Er3+在1 525 nm左右有著較大的吸收截面，因此其也可以作為敏化離子吸收1 525 nm激發(fā)光的能量并經(jīng)過(guò)三光子上轉(zhuǎn)換過(guò)程將Nd3+、Yb3+或Tm3+離子的基態(tài)電子分別激發(fā)至4F5/2(Nd3+)、5F5(Ho3+) 或3F2和3F3(Tm3+) 激發(fā)態(tài)，而后經(jīng)過(guò)不同的非輻射弛豫和輻射躍遷分別產(chǎn)生1 060 nm(Nd3+,4F3/2→4F5/2)、 1 330 nm(Nd3+,4F3/2→4I13/2)、1 155 nm(Ho3+,5I6→5I8) 和1 475 nm(Tm3+,3H4→3F4)的近紅外二區(qū)熒光發(fā)射(圖2(e))。(5)Tm3+-Er3+體系(圖2(f))。該體系中Tm3+離子作為敏化離子可吸收1 208 nm激發(fā)光的能量，經(jīng)過(guò)雙光子上轉(zhuǎn)換過(guò)程將其基態(tài)電子分別激發(fā)至3H5和3F3(Tm3+)能級(jí)，之后通過(guò)能量傳遞過(guò)程將能量分別轉(zhuǎn)移至Er3+離子的4I13/2和4I9/2(Er3+)能級(jí)。4I9/2(Er3+)激發(fā)態(tài)電子非輻射弛豫至4I13/2，最后發(fā)生輻射躍遷4I13/2→4I15/2(Er3+)而產(chǎn)生1 525 nm的近紅外二區(qū)熒光(圖2(f))。

圖2 (a)Nd3+、Yb3+和Er3+在近紅外區(qū)的吸收光譜(實(shí)線標(biāo)識(shí))及Nd3+、Ho3+、Pr3+、Tm3+和Er3+在近紅外二區(qū)的發(fā)射光譜(顏色填充的實(shí)線標(biāo)識(shí))[6]；(b)Nd3+和Er3+的近紅外二區(qū)發(fā)射；(c)Yb3+敏化Ln3+ (Ln=Ho、Pr、Er和Tm)的近紅外二區(qū)熒光發(fā)射的能量轉(zhuǎn)移路徑圖示，曲的短劃線表示Yb3+向Tm3+的能量轉(zhuǎn)移過(guò)程和Tm3+的雙光子激發(fā)態(tài)吸收過(guò)程；(d)Nd3+敏化Er3+的近紅外二區(qū)熒光發(fā)射的能量轉(zhuǎn)移路徑圖示[42]；(e)Er3+敏化Ln3+ (Ln=Nd、Ho和Tm)的近紅外二區(qū)熒光發(fā)射的能量轉(zhuǎn)移路徑圖示[43]；(f)Tm3+敏化Er3+的近紅外二區(qū)熒光發(fā)射的能量轉(zhuǎn)移路徑圖示[44]；(g)(ⅰ)核殼結(jié)構(gòu)的圖解說(shuō)明[5]，(ⅱ)ICG染料敏化NaYF4∶Yb3+/X3+@NaYbF4@NaYF4∶Nd3+納米粒子的能量傳遞過(guò)程圖示[48]，(ⅲ)在980 nm激光激發(fā)下α-ErNPs納米探針的能量轉(zhuǎn)移圖示[38]。Fig.2 (a)Absorption spectra of Nd3+, Yb3+ and Er3+ in NIR-Ⅰ and NIR-Ⅱ region (solid line) and NIR-Ⅱ emission spectra from Nd3+, Ho3+, Pr3+, Tm3+ and Er3+(solid line with color shade). Proposed energy transfer mechanisms for emissions in the NIR-Ⅱ region[6]. (b)Intrinsic NIR-Ⅱ emissions of Nd3+ and Er3+. (c)Simplified energy transfer pathways for NIR-Ⅱ emissions of Ln3+(Ln=Ho, Pr, Er, Tm) using Yb3+ as the sensitizer. The dashed curve indicates the energy transfer from Yb3+ to Tm3+ and the simultaneous two-photon ESA process of Tm3+. (d)Simplified energy transfer pathways for NIR-Ⅱ emissions of Er3+ using Nd3+ as the sensitizer[42]. (e)Simplified energy transfer pathways for NIR-Ⅱ emissions of Ln3+(Ln=Nd, Ho, Tm) using Er3+ as the sensitizer[43]. (f)Simplified energy transfer pathways for the NIR-Ⅱ emissions of Er3+ using Tm3+ as the sensitizer[44]. (g)(ⅰ)Schematic illustration of the core/shell structure[5]. (ⅱ)Energy transfer pathway from ICG on the surface of NaYF4∶Yb3+/X3+@NaYbF4@NaYF4∶Nd3+ nanocrystal, to the Nd3+ ions in the outer shell, then to the Yb3+ in the inner shell, and finally to the Yb3+/X3+(X=null, Er, Ho, Tm or Pr) in the core, producing large Stokes-shifted NIR-Ⅱ emissions[48]. (ⅲ)Simplified energy-level diagrams depicting the energy transfer involved in a-ErNPs on 980 nm excitation[38].

熒光探針的量子產(chǎn)率是決定其應(yīng)用發(fā)展的重要因素之一，量子產(chǎn)率高的熒光探針可以在保證成像質(zhì)量的前提下最大限度地降低所使用激發(fā)光的功率和探針的用量而減少對(duì)生物體的光損傷和生物毒性，提高安全性。因此，除了以上合理地選擇基質(zhì)、敏化離子和發(fā)光離子外，還可以通過(guò)設(shè)計(jì)優(yōu)化熒光探針的結(jié)構(gòu)來(lái)提高量子產(chǎn)率而增強(qiáng)其發(fā)光強(qiáng)度。如圖2(g)所示[6]，通過(guò)在稀土近紅外二區(qū)熒光探針表面外延生長(zhǎng)一層或多層惰性殼層或活性殼層而形成的核殼結(jié)構(gòu)可有效地減弱溶劑分子對(duì)發(fā)光中心的猝滅作用。包覆的活性殼層還可以增加對(duì)激發(fā)光的捕獲能力并提高其利用率，從而提高近紅外二區(qū)熒光發(fā)射強(qiáng)度[5,14,38,45-46]。另外，在熒光探針外嫁接在近紅外一區(qū)或二區(qū)具有較強(qiáng)吸收截面且與敏化離子吸收能級(jí)相匹配的染料分子而形成染料敏化結(jié)構(gòu)，可以改善4f-4f電子躍遷禁阻所導(dǎo)致的量子產(chǎn)率低的問(wèn)題而增加躍遷幾率，進(jìn)而提高熒光強(qiáng)度[47-48]。最近，通過(guò)在Er3+摻雜的熒光探針中摻雜Ce3+和Zn2+離子來(lái)調(diào)控其內(nèi)部能量轉(zhuǎn)移過(guò)程的方法也被證實(shí)是一種提高Er3+近紅外二區(qū)熒光強(qiáng)度的有效策略[38]。不僅如此，還可以通過(guò)調(diào)控稀土近紅外二區(qū)熒光探針的結(jié)構(gòu)[49-50]、離子摻雜濃度[39,51-52]、粒徑[40]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移和內(nèi)部能量遷移過(guò)程[53-54]等方法來(lái)調(diào)節(jié)其熒光壽命，以更好地實(shí)現(xiàn)熒光壽命多通道成像。

3 近紅外二區(qū)熒光成像應(yīng)用

3.1 光譜域成像

相較于可見(jiàn)和近紅外一區(qū)熒光成像，近紅外二區(qū)成像受到生物組織的散射和自體熒光的干擾更弱，近年來(lái)引起了人們的廣泛關(guān)注。同時(shí)，日益成熟的近紅外二區(qū)光子檢測(cè)技術(shù)和快速發(fā)展的納米科學(xué)技術(shù)為充分地探索近紅外二區(qū)熒光探針的應(yīng)用潛力提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。特別是基于稀土近紅外二區(qū)熒光探針的成像研究，因其具有發(fā)光波長(zhǎng)可調(diào)諧、穩(wěn)定性好、發(fā)射半峰寬窄等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)取得了令人矚目的進(jìn)展[14,43-44,47,55-71]。2013年，美國(guó)羅格斯大學(xué)Moghe 研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)開發(fā)了NaYF4,Yb∶Ln(Ln=Ho、Pr、Tm或Er)@NaYF4近紅外二區(qū)熒光探針[14]。由于Yb3+離子在980 nm處有較強(qiáng)的吸收截面(1.2×10-20cm2)[72]，因此該探針中的Yb3+離子可有效地吸收980 nm激發(fā)光能量，將能量傳遞給不同的發(fā)光中心后，發(fā)生相應(yīng)的輻射躍遷從而發(fā)射不同波長(zhǎng)的近紅外二區(qū)熒光如1 155 nm(Ho3+)、1 269 nm(Pr3+)、1 475 nm(Tm3+)或1 525 nm(Er3+)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相較于近紅外一區(qū)(808 nm)的組織穿透深度(≤5 mm)，近紅外二區(qū)光(1 525 nm)有著更深的組織穿透深度，可達(dá)1 cm以上。該探針在修飾HSA分子(Human serum albumin)后可有效地在腫瘤和主要臟器內(nèi)富集而實(shí)現(xiàn)了對(duì)其高分辨成像(微米級(jí)的分辨率)及多光譜實(shí)時(shí)成像(Er3+：1 525 nm；Ho3+：1 185 nm)。 該工作不僅首次探索發(fā)掘了稀土近紅外二區(qū)熒光探針在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)多光譜熒光成像上的應(yīng)用潛力，而且為稀土近紅外二區(qū)熒光探針的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。但是，由于稀土離子存在4f-4f電子躍遷禁阻效應(yīng)導(dǎo)致較低的熒光量子產(chǎn)率，因而阻礙了其進(jìn)一步發(fā)展。因此，設(shè)計(jì)開發(fā)熒光量子產(chǎn)率高的稀土近紅外二區(qū)熒光探針尤為重要[38,41,47,61,71]。2019年，美國(guó)斯坦福大學(xué)戴宏杰課題組巧妙地設(shè)計(jì)合成了鋅摻雜的α-NaYbF4∶2%Er,2%Ce,10%Zn@NaYF4核殼結(jié)構(gòu)的近紅外二區(qū)熒光探針[38]。其發(fā)光機(jī)理如圖3(a)所示, Yb3+離子作為敏化離子，其2F7/2基態(tài)電子吸收980 nm激發(fā)光能量后被激發(fā)至2F5/2能級(jí)。在Yb3+-Er3+離子共摻雜的納米粒子中，Yb3+吸收的能量可通過(guò)2F5/2(Yb3+)+4I15/2(Er3+)→2F7/2(Yb3+)+4I11/2(Er3+)能量傳遞過(guò)程將能量傳遞給Er3+離子以增加4I11/2(Er3+)激發(fā)態(tài)電子數(shù)，4I11/2(Er3+)激發(fā)態(tài)電子非輻射弛豫至4I13/2，最后發(fā)生輻射躍遷4I13/2→4I15/2(Er3+)而產(chǎn)生1 525 nm的近紅外二區(qū)熒光。其中聲子能量高的α相晶體結(jié)構(gòu)和摻雜的Ce3+可分別增強(qiáng)4I11/2→4I13/2(Er3+)非輻射弛豫過(guò)程和2F7/2(Ce3+)+4I11/2(Er3+)→2F5/2(Ce3+)+4I13/2(Er3+)交叉弛豫過(guò)程而大幅度增加了4I13/2(Er3+)激發(fā)態(tài)電子數(shù)，從而有效地抑制了上轉(zhuǎn)換過(guò)程并增強(qiáng)了下轉(zhuǎn)換過(guò)程。另外，摻雜的Zn2+和包覆的惰性殼層可分別減弱4f-4f電子躍遷禁阻作用和溶劑分子對(duì)發(fā)光中心的猝滅作用而增強(qiáng)近紅外二區(qū)熒光強(qiáng)度。即在以上4種策略的調(diào)控下，Er3+離子下轉(zhuǎn)換熒光強(qiáng)度提升了近11倍(圖 3(a))。該超亮的熒光探針在被聚丙烯酸和氨基聚乙二醇等分子修飾后，具有長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間和良好的生物安全性(兩周后90%的探針可經(jīng)糞便排出體外)。由于1 525 nm波長(zhǎng)的熒光幾乎不受組織的自熒光干擾，因此該熒光探針不僅實(shí)現(xiàn)了低功率下(15 mW·cm-2)對(duì)小鼠血管的高信噪比和高分辨率實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像和對(duì)其心率的監(jiān)測(cè)；而且在共價(jià)嫁接靶向anti-PD-L1抗體后，實(shí)現(xiàn)了癌癥免疫治療的高分辨率實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像。其腫瘤與正常組織的信噪比高達(dá)40(提升了近4倍)(圖 3(b))。

圖3 (a)(ⅰ)α-ErNPs和β-ErNPs熒光探針的上/下轉(zhuǎn)換熒光光譜，內(nèi)嵌圖片是二者分散在環(huán)己烷溶劑中的熒光圖像；(ⅱ)在980 nm激光激發(fā)下，α-ErNPs納米探針的能量轉(zhuǎn)移圖示；(ⅲ)不同鋅離子摻雜濃度的α-ErNPs納米探針的熒光光譜(0%,5%,7.5%,10%,12.5%，15%)。(b)(ⅰ)～(ⅱ)分別注射ErNPs-aPDL1和ErNPs熒光探針5 min、12 h和24 h后，腫瘤小鼠的近紅外二區(qū)熒光成像圖(標(biāo)尺：1 cm)；(ⅲ)腫瘤部位與正常組織的熒光強(qiáng)度比隨時(shí)間變化的曲線[38]。Fig.3 (a)(ⅰ)Upconversion and downconversion luminescence spectra of α-ErNPs and β-phase ErNPs. The insets show NIR-Ⅱb luminescence images of these two nanoparticles in cyclohexane. (ⅱ)Simplified energy-level diagrams depicting the energy transfer involved in α-ErNPs on 980 nm excitation. (ⅲ)Downconversion luminescence spectra of Zn-doped α-ErNPs with different Zn2+ concentrations(0%,5%,7.5%,10%,12.5% and 15%, nominal doping concentration). The insets show NIR-IIb luminescence images of α-ErNPs with 10% and 0% Zn2+ doping. (b)(ⅰ)-(ⅱ)Wide-field images of CT-26 tumor mice(n=5) treated with ErNPs-aPDL1, CT-26 tumor mice(n=3) treated with free ErNPs(middle) at different time points p.i.(5 min, 12 h and 24 h). Scale bar, 1 cm. (ⅲ)T/NT ratios of ErNPs in tumor were plotted as a function of time over 120 h[38].

為了進(jìn)一步提高激發(fā)光的穿透深度，研究人員開發(fā)了一系列近紅外二區(qū)光激發(fā)的稀土熒光探針，并探索了其在生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用性[43-44,63,73-75]。新加坡國(guó)立大學(xué)的劉小鋼教授團(tuán)隊(duì)率先利用Er3+作為敏化離子，設(shè)計(jì)合成了近紅外二區(qū)光激發(fā)的NaErF4∶Tm (0.5%)@NaYF4稀土發(fā)光納米材料，將激發(fā)波長(zhǎng)調(diào)控至1 530 nm[63]。該材料中Er3+不但可以作為敏化離子，也可以充當(dāng)上轉(zhuǎn)換發(fā)光過(guò)程的發(fā)光中心(650 nm)。其中少量摻雜的Tm3+離子則可以提供能量陷獲中心而減少能量遷移過(guò)程中的損失，從而進(jìn)一步提高發(fā)光效率。該材料不僅有著良好的生物成像應(yīng)用前景，而且拓寬了激發(fā)光波長(zhǎng)的選擇范圍，為開發(fā)近紅外二區(qū)激發(fā)和發(fā)射的稀土熒光探針奠定了基礎(chǔ)。復(fù)旦大學(xué)張凡教授課題組最近利用Er3+吸收1 530 nm激發(fā)光，并經(jīng)過(guò)三光子上轉(zhuǎn)換過(guò)程將Ho3+離子的基態(tài)電子激發(fā)至5F5(Ho3+) 激發(fā)態(tài)，從而獲得Ho3+的近紅外二區(qū)熒光發(fā)射(1 155 nm,Ho3+,5I6→5I8)的稀土發(fā)光納米材料(NaErF4∶Ho@NaYF4)[43]。該探針在生物傳感、熒光壽命編碼成像和體內(nèi)高信噪比炎癥病灶成像方面均表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能。最近，該課題組又利用Tm3+作為敏化離子，制備了NaYF4∶Tm/Er@NaYF4稀土發(fā)光納米材料，成功地將激發(fā)波長(zhǎng)拓展到1 208 nm。Tm3+作為敏化離子吸收1 208 nm激發(fā)光，Er3+作為發(fā)光離子產(chǎn)生1 525 nm近紅外二區(qū)熒光發(fā)射。同時(shí)，改變Er3+的摻雜濃度還可以實(shí)現(xiàn)其熒光壽命的調(diào)控，使其應(yīng)用于熒光壽命的多通道編碼成像和信息存儲(chǔ)等領(lǐng)域[44]。此外，南京工業(yè)大學(xué)黃嶺教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了Ho3+離子敏化的NaYF4∶Er/Ho稀土發(fā)光納米材料，成功獲得了1 155 nm激發(fā)的上轉(zhuǎn)換發(fā)射，并在生物成像和傳感等領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力[75]。

目標(biāo)與背景信號(hào)的比值(Target-to-background ratio，TBR)是評(píng)價(jià)熒光成像質(zhì)量的一個(gè)重要參數(shù)[76-77]。近些年，研究人員一直致力于設(shè)計(jì)開發(fā)新型熒光探針以提高TBR，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)熒光成像。主要包括3個(gè)研究方向：最小化背景熒光信號(hào)、最大化目標(biāo)區(qū)域熒光信號(hào)及兩者協(xié)同調(diào)控。病變組織的病理微環(huán)境與正常組織的生理環(huán)境明顯不同，例如pH值[70,78]、異常的氧化還原環(huán)境(H2O2[69,79-80]、HClO[62,65,81]、ONOO-[82-83]和GSH[64,84]等)或酶等[78,85-86]，而這些病理參數(shù)正是各種疾病(例如癌癥、炎癥和心血管疾病)的重要生物標(biāo)志物。構(gòu)建熒光強(qiáng)度對(duì)成像病灶部位的特異性響應(yīng)的熒光探針可以實(shí)現(xiàn)最小化背景熒光信號(hào)，最大化目標(biāo)區(qū)域熒光信號(hào)，是一種實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)熒光成像的有效策略。刺激-響應(yīng)型熒光探針可對(duì)病理組織中的病理參數(shù)做出響應(yīng)而增強(qiáng)或激活熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)最小化背景熒光信號(hào)和最大化目標(biāo)區(qū)域熒光信號(hào)。因此，設(shè)計(jì)開發(fā)新穎的刺激-響應(yīng)型稀土近紅外二區(qū)熒光探針是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)高靈敏度和高信噪比成像的關(guān)鍵[62,64-65,67,69-70,81,87]。近年來(lái)，首都師范大學(xué)周晶研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種pH響應(yīng)熒光增強(qiáng)的NaDyF4∶10%Nd-GA-Fe近紅外二區(qū)熒光探針[70]。其中既做敏化離子又擔(dān)當(dāng)發(fā)光離子的Nd3+吸收808 nm激發(fā)光能量后可發(fā)射1 050 nm(4F3/2→4I11/2,Nd3+)和1 330 nm(4F3/2→4I13/2,Nd3+)的近紅外二區(qū)熒光。稀土納米粒子修飾上沒(méi)食子酸-鐵配合物(GA-Fe)后，由于GA-Fe在酸性條件下易被質(zhì)子化而增強(qiáng)配合物分子間的氫鍵作用導(dǎo)致粒子聚集。因此，通過(guò)尾靜脈注射將該探針注入載瘤小鼠體內(nèi)后，利用腫瘤微環(huán)境的弱酸環(huán)境可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤病灶區(qū)域的pH響應(yīng)聚集誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)的近紅外二區(qū)熒光成像(強(qiáng)度提升約2倍)。復(fù)旦大學(xué)張凡教授課題組利用炎癥部位過(guò)氧化氫水平異常的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)開發(fā)了一系列稀土近紅外二區(qū)熒光成像探針[43,69,81]。如設(shè)計(jì)合成小尺寸單離子摻雜體系的NaGdF4∶5%Nd納米探針，在808 nm激光激發(fā)下可產(chǎn)生1 064 nm近紅外二區(qū)熒光[69]。利用納米晶表面Gd3+離子與羧基的螯合作用，在其表面修飾上生物小分子谷胱甘肽。這不僅提升了其血液循環(huán)時(shí)間和生物安全性，而且賦予了其過(guò)氧化氫響應(yīng)的聚集性誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)的特性(谷胱甘肽分子上的巰基在過(guò)氧化氫的氧化作用下可形成二硫鍵)(圖4(a))。經(jīng)尾靜脈給藥后，與對(duì)照組相比，富集到炎癥病灶的納米粒子在過(guò)氧化氫的作用下發(fā)生團(tuán)聚而產(chǎn)生更高的熒光信號(hào)，因此信噪比更高(提升了近3倍)(圖4(b))。另外，進(jìn)一步證明了在體內(nèi)谷胱甘肽修飾的納米探針可實(shí)現(xiàn)過(guò)氧化氫響應(yīng)的粒子間交叉偶聯(lián)，并表現(xiàn)出有效的能量傳遞效率(圖4(c))。另外，該課題組進(jìn)一步設(shè)計(jì)開發(fā)了近紅外二區(qū)比率熒光探針(NaErF4∶Ho@NaYF4)[43]，其發(fā)光機(jī)理為：在1 530 nm激光照射下，作為敏化離子的Er3+吸收1 530 nm激發(fā)光，并經(jīng)過(guò)三光子上轉(zhuǎn)換過(guò)程將Ho3+離子的基態(tài)電子激發(fā)至5F5(Ho3+) 激發(fā)態(tài)，而后經(jīng)過(guò)不同的非輻射弛豫和輻射躍遷產(chǎn)生1 155 nm(Ho3+,5I6→5I8)的近紅外二區(qū)熒光發(fā)射和980 nm(Er3+,4I11/2→4I15/2)近紅外一區(qū)熒光發(fā)射。而后表面修飾的IR1061染料賦予了其過(guò)氧化氫的響應(yīng)特性。因?yàn)镮R1061在800～1 100 nm處有強(qiáng)吸收而導(dǎo)致980 nm 熒光猝滅，但是在過(guò)氧化氫的存在下IR1061被Fenton催化Fe2+和H2O2產(chǎn)生的·OH降解，而增強(qiáng)980 nm發(fā)射光的強(qiáng)度，其中1 180 nm發(fā)射光強(qiáng)度幾乎不變。該工作為高分辨率(200 μm×200 μm)的體內(nèi)動(dòng)態(tài)炎癥傳感開辟了新道路。此外，炎癥部位除了過(guò)氧化氫水平異常外，其他活性氧的含量也遠(yuǎn)高于正常組織，如HOCl、·OH、1O2等[62,65,81,88]。最近，張凡教授課題組設(shè)計(jì)開發(fā)了一種基于吸收競(jìng)爭(zhēng)誘導(dǎo)熒光發(fā)射機(jī)理的Er摻雜NaYF4@NaYF4-Cy7.5 近紅外二區(qū)熒光復(fù)合探針(圖 5(a))[81]。在808 nm激發(fā)光照射下，由于Cy7.5染料于808 nm處有著更強(qiáng)的吸收強(qiáng)度從而極大地削弱了Er3+離子對(duì)808 nm的吸收，導(dǎo)致Er3+離子在1 530 nm處近紅外二區(qū)熒光發(fā)射變?nèi)?。但?dāng)HOCl分子存在時(shí)，Cy7.5染料被降解而削弱了其對(duì)808 nm激發(fā)光的吸收，反而增強(qiáng)了Er3+離子近紅外二區(qū)熒光發(fā)射強(qiáng)度。由于Cy7.5染料對(duì)980 nm吸收較弱，因此在980 nm激光照射下，Er3+離子下轉(zhuǎn)換的近紅外二區(qū)熒光發(fā)射強(qiáng)度幾乎保持不變。因此，分別在雙激發(fā)波長(zhǎng)照射下，二者的1 530 nm熒光強(qiáng)度的比值與HOCl分子濃度密切相關(guān)。近紅外二區(qū)比率熒光(I808/I980)實(shí)現(xiàn)了對(duì)HOCl含量的精準(zhǔn)檢測(cè)(檢出限低至500 nmol·L-1)以及體內(nèi)炎癥的高分辨率高信噪比成像(淋巴管成像分辨率約477 μm)(圖 5(b)～(c))。該系列工作推動(dòng)了基于稀土近紅外二區(qū)熒光成像探針的體內(nèi)炎癥的精準(zhǔn)成像的發(fā)展。福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所的陳學(xué)元教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)合成了過(guò)氧化氫激活的NaCeF4∶Er/Yb 近紅外二區(qū)熒光探針，并實(shí)現(xiàn)了尿酸的檢測(cè)[67]。其機(jī)理與上述α-NaYbF4∶2%Er,2%Ce,10%Zn@NaYF4探針類似，其中摻雜的Ce3+有效地增強(qiáng)了2F7/2(Ce3+)+4I11/2(Er3+)→2F5/2(Ce3+)+4I13/2(Er3+)交叉弛豫過(guò)程而大幅度增加了4I13/2(Er3+)激發(fā)態(tài)電子數(shù)，從而有效地抑制了上轉(zhuǎn)換過(guò)程并增強(qiáng)了下轉(zhuǎn)換過(guò)程。在過(guò)氧化氫的氧化作用下，Ce3+被氧化成Ce4+而減弱了上述交叉弛豫過(guò)程導(dǎo)致了1 530 nm發(fā)射光的熒光猝滅。這一響應(yīng)性探針可用于檢測(cè)過(guò)氧化氫或可生成過(guò)氧化氫的生物分子，如通過(guò)檢測(cè)尿酸和尿酸酶反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫分子，可將尿酸的檢出限降低到25.6 nmol·L-1，并且在小動(dòng)物成像上其組織深度可達(dá)10 mm。

圖4 (a)超小熒光探針用于急性局域表皮炎癥生物成像的圖示說(shuō)明;(b)(ⅰ)注射不同探針后急性局域表皮炎癥的近紅外二區(qū)生物成像，(ⅱ)體內(nèi)粒子間能量遷移生物成像[69]。Fig.4 (a)Illustration of bioimaging for acute local epidermal inflammation in mice utilizing ultra-small DCNP@GSH nanoprobes. (b)(ⅰ)NIR-Ⅱ fluorescence bioimaging of the acute local epidermal inflammation with various nanoprobes，(ⅱ)In vivoⅠ-PEM bioimaging[69].

圖5 (a)基于ACIE機(jī)理的DCNP@Cy7.5復(fù)合探針對(duì)HOCl分子響應(yīng)的圖示說(shuō)明，Er3+-DCNP∶NaErxY1-xF4@NaYF4(x=0.05,0.15,0.5)，下轉(zhuǎn)換納米粒子的熒光由于Cy7.5染料對(duì)激發(fā)光能量的強(qiáng)吸收作用而被猝滅，但在HOCl分子存在下由于Cy7.5染料被HOCl分子降解而得到恢復(fù)；(b)小鼠后肢淋巴系統(tǒng)的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，其中綠色箭頭表示從爪子到坐骨淋巴結(jié)間的淋巴管；(c)注射DCNP@Cy7.5探針30 min后，經(jīng)內(nèi)毒素和生理鹽水處理的小鼠淋巴管的近紅外二區(qū)熒光成像和相應(yīng)的比率熒光成像圖[81]。Fig.5 (a)Schematic illustration showing the ratiometric response of DCNP@Cy7.5 to HOCl based on an ACIE mechanism. Er3+-doped DCNP∶NaErxY1-xF4@NaYF4(x=0.05, 0.15, 0.5). When excitation is performed in the absorption overlapping region (808 nm), fluorescence of DCNPs are quenched due to the energy filtration of excitation light by strong absorbing Cy7.5. The quenching process is reversed after the degradation of Cy7.5 by HOCl oxidation. (b)Anatomical structure of lymphatic system in the hindlimb of mice, green arrow represents the lymphatic drainage from the paw to the sciatic lymph node. (c)In vivo NIR-Ⅱ fluorescence images and corresponding ratiometric images of LPS-treated and saline-treated mouse lymphatic drainage at 30 min post injection of DCNP@Cy7.5[81].

3.2 時(shí)間域成像

3.2.1 時(shí)間門控成像

時(shí)間門控成像技術(shù)是一種經(jīng)短脈沖激發(fā)光激發(fā)后捕獲采集延遲一定時(shí)間后的熒光信號(hào)進(jìn)行成像的時(shí)間分辨技術(shù)。它可以通過(guò)調(diào)控延遲時(shí)間過(guò)濾掉激發(fā)光和短壽命的熒光信號(hào)并采集長(zhǎng)壽命特異性的熒光信號(hào)從而實(shí)現(xiàn)高信噪比的熒光成像。由于稀土熒光探針的壽命可調(diào)，且遠(yuǎn)高于生物組織的散射及自體熒光的壽命，因此在生物成像和生物傳感領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景[37,89-90]。哈爾濱工業(yè)大學(xué)陳冠英課題組設(shè)計(jì)開發(fā)了可用于近紅外二區(qū)時(shí)間門控成像的NaYF4∶10%Yb3+, 30%Nd3+@CaF2稀土熒光探針，在其表面修飾的聚丙烯酸賦予了納米材料良好的生物相容性與安全性[49]。由于其熒光壽命(約1 ms)遠(yuǎn)長(zhǎng)于散射光和自體熒光的壽命(小于10 ns)，小鼠活體內(nèi)時(shí)間門控成像的結(jié)果表明，該探針極大地削弱了小鼠部分生物組織(皮膚和眼睛)的散射光及自體熒光對(duì)成像信號(hào)的干擾，從而顯著地提高了成像信噪比。另外，由于時(shí)間門控成像系統(tǒng)是捕獲采集脈沖激發(fā)光激發(fā)后隨時(shí)間衰減的熒光信號(hào)，導(dǎo)致成像信號(hào)強(qiáng)度通常較弱。因此，開發(fā)量子產(chǎn)率高、壽命長(zhǎng)的熒光探針可以在保證成像質(zhì)量的前提下最大限度地降低所使用激發(fā)光的功率和探針的用量，從而減少對(duì)生物體的損傷，提高安全性?；诖?，復(fù)旦大學(xué)的李富友教授團(tuán)隊(duì)和澳大利亞悉尼科技大學(xué)金大勇教授研究團(tuán)隊(duì)合作開發(fā)了一種新型可用于時(shí)間門控成像的小尺寸α-NaYbF4@CaF2稀土熒光探針[37]。其中Yb3+離子在吸收975 nm短脈沖激發(fā)光能量后，由于存在4f-4f電子躍遷禁阻效應(yīng)，2F5/2(Yb3+)激發(fā)態(tài)電子有著較長(zhǎng)的熒光壽命。另外，單離子摻雜有效地避免了離子間交叉弛豫過(guò)程，使得具有較長(zhǎng)壽命的2F5/2(Yb3+)激發(fā)態(tài)電子將在Yb3+離子間不斷傳遞直至輻射躍遷至基態(tài)發(fā)射出同等波長(zhǎng)的光子。重要的是，由于CaF2惰性殼層的保護(hù)，有效地避免了溶劑分子等對(duì)發(fā)光離子的猝滅作用和非輻射弛豫過(guò)程，最大限度地減少了能量傳遞過(guò)程中的能量損失，從而實(shí)現(xiàn)了近乎100%量子產(chǎn)率的近紅外熒光發(fā)射(圖 6(a))。因此，在小鼠活體內(nèi)時(shí)間門控成像應(yīng)用中，即使在低劑量(13 μg·g-1)和低的激光輻照功率(1.1 mW·cm-2)條件下，仍可實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠器官的高靈敏度和高信噪比(SNR>9)成像(圖 6(b))。同時(shí)，該高量子產(chǎn)率稀土熒光探針的設(shè)計(jì)理念同樣適用于其他在近紅外區(qū)有吸收截面的稀土離子如Nd3+、Er3+和Tm3+。該工作推動(dòng)了稀土熒光探針在時(shí)間門控技術(shù)應(yīng)用上的發(fā)展。

圖6 (a)時(shí)間域熒光傳感器(ⅰ)(τ-dots; <15 nm)和與之相比較的上轉(zhuǎn)換(ⅱ)及下轉(zhuǎn)換(ⅲ)納米粒子(<20 nm)的設(shè)計(jì)原理，時(shí)間域檢測(cè)原理：在脈沖激光激發(fā)后通過(guò)精準(zhǔn)地控制時(shí)間窗口來(lái)檢測(cè)分析延遲熒光的強(qiáng)度及衰減信號(hào)；(ⅳ)時(shí)間域過(guò)濾的光學(xué)信號(hào)和光學(xué)過(guò)濾的上轉(zhuǎn)換及下轉(zhuǎn)換光學(xué)信號(hào)對(duì)比示意圖。(b)注射α-NaYbF4@CaF2探針不同時(shí)間后 在975 nm脈沖激發(fā)光激發(fā)下小鼠的時(shí)間門控成像圖像[37]。Fig.6 (a)Design principle of the sub-15 nm biocompatible time-domain luminescent transducer(τ-dots; (ⅰ)) compared with typical designs with sub-20 nm upconversion(ⅱ) and downshifting(ⅲ) nanoparticles. The time-domain detection of τ-dots involves a pulsed laser excitation following a precisely controlled time window to resolve both the intensity and decay signature of the delayed luminescence in the same spectral band. (ⅳ) Schematic comparison of the optical signal discrimination approaches of time-domain filtering and upconversion and downshifting luminescence using spectral filters. (b)Time-gated imaging of α-NaYbF4@CaF2 nanoparticles(NIR τ-dots) under pulsed excitation at 975 nm[37].

3.2.2 熒光壽命成像

熒光壽命成像技術(shù)是一種通過(guò)采集不同熒光壽命信號(hào)而進(jìn)行分析成像的另一種時(shí)間分辨技術(shù)。由于稀土熒光探針的熒光壽命可調(diào)范圍廣(μs-ms)，因此在生物成像、生物傳感、熒光壽命多通路復(fù)合成像和高通量檢測(cè)分析等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景[42,52,87,91-93]。另外，由于熒光壽命不受激發(fā)光功率和組織穿透深度的影響而不需要進(jìn)行不同深度的校準(zhǔn)，因此其常被用于定量探針，為對(duì)體內(nèi)分子或標(biāo)志物進(jìn)行多編碼定量檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。復(fù)旦大學(xué)張凡教授研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了基于熒光壽命多通路復(fù)合成像技術(shù)的、可用于二元(顏色和熒光壽命)編碼的NaGdF4∶Yb3+,Ln3+@NaYF4∶Yb3+@NaNdF4∶Yb3+@NaYF4(Ln=Tm，Er/Pr，Er)納米探針[92]。其中Nd3+離子的4I9/2基態(tài)電子吸收808 nm激發(fā)光能量后被激發(fā)至4F5/2能級(jí)，該能級(jí)的能量可通過(guò)4F3/2(Nd3+)+2F7/2(Yb3+)→4I9/2(Nd3+)+2F5/2(Yb3+)能量傳遞過(guò)程將其傳遞給同層的Yb3+離子，并沿著Yb3+單摻雜的能量遷移層傳遞至內(nèi)核的Yb3+離子，最后將能量傳遞給發(fā)光離子(藍(lán)光：Tm3+，綠光：Er3+/Pr3+，紅光：Er3+)產(chǎn)生上轉(zhuǎn)換熒光。通過(guò)控制能量遷移層的厚度可以調(diào)控能量傳遞的時(shí)間而改變熒光壽命，改變摻雜的發(fā)光離子的種類可以調(diào)控?zé)晒獍l(fā)射的波長(zhǎng)。因此實(shí)現(xiàn)了不同壽命的紅光、綠光和藍(lán)光發(fā)射探針相結(jié)合的超高編碼容量(>105種)的二元編碼模式。因此，將9種有著不同壽命和顏色的納米材料分別修飾人乳頭瘤病毒的DNA探針(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，68)并利用壽命多通道復(fù)合成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高通量的高風(fēng)險(xiǎn)HPV檢測(cè)。該工作基于稀土發(fā)光納米材料熒光壽命可調(diào)的特性，利用時(shí)間壽命成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了病毒的高通量檢測(cè)分析并為檢測(cè)其他標(biāo)志物提供了可行有效的方案。若結(jié)合近紅外二區(qū)成像的高信噪比、組織穿透能力強(qiáng)的特點(diǎn)，將可以實(shí)現(xiàn)活體內(nèi)多編碼成像和對(duì)腫瘤標(biāo)志物的定量分析。2018年，復(fù)旦大學(xué)張凡教授研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步設(shè)計(jì)合成了一系列熒光壽命工程化的β-NaGdF4@NaGdF4∶Yb,Ln(Ln=Ho、Pr、Tm或Er)@NaYF4∶Yb @NaNdF4∶Yb核-多層殼結(jié)構(gòu)近紅外二區(qū)熒光探針[42]。在808 nm激發(fā)下，可發(fā)射出取決于摻雜離子的近紅外二區(qū)熒光，如1 155 nm(Ho3+)、1 269 nm(Pr3+)、1 475 nm(Tm3+)或1 525 nm(Er3+)。以摻雜Er的熒光探針為例，通過(guò)調(diào)控第二層能量轉(zhuǎn)移層的厚度及Er3+的摻雜量，實(shí)現(xiàn)了橫跨3個(gè)數(shù)量級(jí)的熒光壽命調(diào)控(μs-ms)(圖7(a))。系統(tǒng)性測(cè)試的結(jié)果表明，在熒光模式下即使其信噪比低于1.5但壽命仍然保持不變，即熒光探針的熒光壽命與組織深度無(wú)關(guān)，因此其可用于定量研究，而無(wú)需在不同深度進(jìn)行校準(zhǔn)。分別在3種具有不同時(shí)間壽命的熒光探針表面修飾MCF-7和BT-474乳腺腫瘤生物標(biāo)志物(雌激素受體、黃體酮受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體2：ER、PR和 HER2)抗體，經(jīng)尾靜脈注射后，實(shí)現(xiàn)了生物體內(nèi)腫瘤標(biāo)志物的多重定量檢測(cè)。其結(jié)果與蛋白質(zhì)印跡和免疫組織化學(xué)測(cè)試結(jié)果一致(圖7(b))。因此這種新型無(wú)創(chuàng)傷的熒光壽命多編碼成像為活體內(nèi)深層組織多通道定量成像研究開辟了新道路。另外,哈爾濱工業(yè)大學(xué)陳冠英課題組設(shè)計(jì)開發(fā)了NaYF4@NaYF4∶Yb3+,Nd3+@CaF2稀土基熒光探針[94]。該溫敏探針利用熒光壽命成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了基于近紅外二區(qū)熒光壽命的高溫度靈敏度((1.4～1.1)%·℃-1)的體內(nèi)溫度傳感(10～64 ℃)和對(duì)小鼠炎癥的活體內(nèi)成像診斷。該工作不僅為體內(nèi)溫度傳感應(yīng)用提供了有著巨大應(yīng)用潛力的新策略，而且拓展了稀土基熒光探針的應(yīng)用領(lǐng)域。

圖7 (a)(ⅰ)核-多層殼納米材料能量傳遞過(guò)程的能級(jí)圖示，(ⅱ)具有不同能量遷移層厚度的Er摻雜納米粒子在1 525 nm的熒光衰減曲線(d=0～7 nm)，(ⅲ)不同Er摻雜濃度的納米粒子的熒光衰減曲線(CEr=2%～30%，d=0.9 nm；CEr=15%～45%，d=0 nm)。 (b)(ⅰ)3種不同熒光壽命的納米粒子分別共價(jià)嫁接3種抗體(anti-ER、anti-PR和anti-HER2)，3種壽命通道下(分別用紅、綠和藍(lán)色表示)對(duì)MCF-7和BT-474腫瘤小鼠的時(shí)間分辨成像；(ⅱ)兩種腫瘤模型中標(biāo)志物表達(dá)情況的計(jì)算結(jié)果柱形圖，IVM:體內(nèi)多重成像;WB:蛋白質(zhì)印跡法;IHC:免疫組織化學(xué)染色法[42]。Fig.7 (a)(ⅰ)Energy level diagram illustrating the luminescence process of the core-multi-shell nanoparticles.(ⅱ)Luminescence decay curves measured at 1 525 nm from the as-prepared Er nanoparticles with energy relay shells of increasing thickness d from 0 to 7 nm(identical composition). (ⅲ)Luminescence decay curves of the nanoparticles with incremental Er3+ concentration CEr doping from 2% to 30% for d=0.9 nm and from 15% to 45% for d=0 nm. (b)(ⅰ)Three batches of Er nanoparticles exhibiting distinct lifetimes are conjugated to three antibodies(anti-ER, anti-PR and anti-HER2), respectively. Lifetime-resolved images for the MCF-7 and BT-474 tumours are decomposed into the three lifetime channels, represented by the red, green and blue monochromatic image sets. (ⅱ)Results and calculated biomarker expression patterns of the two tumour subtypes. IVM: in vivo multiplexing; WB: western blot; IHC: immunohistochemistry[42].

如光譜域成像部分所述，刺激-響應(yīng)型的熒光探針能實(shí)現(xiàn)更高信噪比的精準(zhǔn)成像，由于壽命不受組織深度和激發(fā)光功率的影響，因此設(shè)計(jì)開發(fā)刺激-響應(yīng)型的熒光壽命成像探針可以進(jìn)一步提高成像信噪比。復(fù)旦大學(xué)李富友教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)開發(fā)了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)(Luminescence resonance energy transfer,LRET)的NaYF4∶Tm3+-IR-820復(fù)合熒光探針，用于ClO-響應(yīng)的熒光壽命編碼成像和生物傳感[87]。其中Tm3+吸收785 nm激發(fā)光能量后其基態(tài)電子被激發(fā)至3H4能級(jí)，而后輻射躍遷返回到基態(tài)并產(chǎn)生800 nm熒光發(fā)射。另外，由于IR-820染料于800 nm處有著強(qiáng)的吸收，因此可很大程度地吸收800 nm熒光能量而導(dǎo)致800 nm熒光壽命降低。當(dāng)ClO-分子存在時(shí)，IR-820染料被分解而削弱了其對(duì)800 nm熒光的吸收，使得800 nm熒光壽命恢復(fù)。因此，該復(fù)合探針的熒光壽命與ClO-的濃度密切相關(guān)。利用熒光壽命多編碼成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了ClO-的定量檢測(cè)。并且由于炎癥病灶部位的ClO-含量遠(yuǎn)高于正常組織，還實(shí)現(xiàn)了小鼠活體內(nèi)關(guān)節(jié)炎病灶的特異性高信噪比成像。該項(xiàng)工作不僅出色地實(shí)現(xiàn)了ClO-響應(yīng)的熒光壽命編碼成像和生物傳感，而且為設(shè)計(jì)響應(yīng)型熒光壽命成像探針提供了新思路。最近，復(fù)旦大學(xué)張凡教授研究團(tuán)隊(duì)同樣利用該策略設(shè)計(jì)合成了一種新型腫瘤微環(huán)境(ONOO-)響應(yīng)的NaYF4@NaYF4∶1%Nd3+-MY-1057復(fù)合納米熒光探針(圖8(a))[91]。其中Nd3+吸收808 nm激發(fā)光能量后產(chǎn)生1 060 nm的近紅外二區(qū)熒光，由于MY-1057染料在1 060 nm處有著強(qiáng)吸收，二者發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移加速了Nd3+從吸收能量到發(fā)射熒光的進(jìn)程,從而減少了1 060 nm的熒光壽命。但是當(dāng)ONOO-存在時(shí)，MY-1057染料被降解使得熒光壽命恢復(fù)(圖8(b))。將該探針經(jīng)尾靜脈注射入原位肝癌腫瘤小鼠模型后，由于肝癌病灶中ONOO-含量高于正常肝組織，因此在對(duì)其進(jìn)行熒光壽命編碼成像時(shí)，根據(jù)其熒光壽命的不同可將其準(zhǔn)確地區(qū)別開來(lái)，并且可定量檢測(cè)ONOO-含量(圖8(c))。該復(fù)合探針為特異性響應(yīng)的超精準(zhǔn)癌癥診斷開辟了新道路，并為活體內(nèi)對(duì)病理學(xué)參數(shù)的定量研究及其實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像提供了新思路(圖 8)。

圖8 (a)ONOO-響應(yīng)型DSNP@MY-1057-GPC-3納米傳感器圖解；(b)在ONOO-存在下，作為能量受體的MY-1057染料分子被降解導(dǎo)致近紅外二區(qū)熒光時(shí)間壽命恢復(fù)；(c)DSNP@MY-1057-GPC-3納米傳感器探針對(duì)肝癌小鼠的非侵入式近紅外二區(qū)熒光強(qiáng)度和時(shí)間分辨成像示意圖，時(shí)間分辨成像可區(qū)分出病灶和正常區(qū)域而熒光強(qiáng)度成像無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)二者的區(qū)分[91]。Fig.8 (a)Scheme of the ONOO--responsive nanosensor DSNP@MY-1057-GPC-3. (b)In the presence of ONOO-, the structure of the energy acceptor MY-1057 degrades sensitively, leading to the lifetime recovery in NIR-Ⅱ region. (c)Illustration of noninvasive NIR-Ⅱ intensity- and lifetime-based imaging for HCC mice after administration of DSNP@MY-1057-GPC-3 nanosensor. HCC lesions could be distinguished from normal hepatic tissue from lifetime imaging, while the intensity-based luminescence imaging fails[91].

綜上所述，稀土基近紅外二區(qū)熒光探針在光譜域和時(shí)間域成像的應(yīng)用上取得了不錯(cuò)的成果，也在響應(yīng)型生物成像和生物傳感方面做出了巨大的貢獻(xiàn)。但其仍存在著些許問(wèn)題值得我們探討。如就響應(yīng)型熒光增強(qiáng)成像而言， 雖然有效地增加了目標(biāo)區(qū)域的熒光信號(hào)但是仍然存在著背景信號(hào)的干擾，因此設(shè)計(jì)開發(fā)病理因子響應(yīng)激活探針可實(shí)現(xiàn)零背景干擾。對(duì)用于活體內(nèi)分子檢測(cè)的響應(yīng)型熒光強(qiáng)度比成像來(lái)說(shuō)，由于生物組織對(duì)不同波長(zhǎng)的吸收、散射和自體熒光的強(qiáng)度存在差異，因此體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所得的熒光強(qiáng)度比與體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果會(huì)存在誤差而影響準(zhǔn)確度。響應(yīng)型熒光壽命成像存在著熒光壽命變化小而對(duì)檢測(cè)儀器要求較高的問(wèn)題。因此 設(shè)計(jì)開發(fā)病理因子響應(yīng)激活熒光探針和多病理因子協(xié)同響應(yīng)熒光探針(提高特異性成像)是高TBR成像的主要發(fā)展方向。

4 總結(jié)與展望

近年來(lái)，近紅外二區(qū)熒光成像因其高靈敏度、高信噪比和深組織穿透深度等特點(diǎn)，在腫瘤診斷、小分子體內(nèi)檢測(cè)、生物傳感、免疫分析和防偽等領(lǐng)域展現(xiàn)了潛在的應(yīng)用前景。在研究開發(fā)近紅外二區(qū)熒光探針的進(jìn)程中，稀土近紅外二區(qū)熒光探針因具有光穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)、發(fā)射半峰寬狹窄(10～20 nm)、斯托克斯位移大和近紅外二區(qū)發(fā)射波長(zhǎng)及熒光壽命可調(diào)等諸多優(yōu)勢(shì)而受到人們的廣泛關(guān)注，并在光譜域成像及時(shí)間分辨成像領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。然而，面向臨床應(yīng)用，稀土近紅外二區(qū)熒光探針目前仍存在著一些問(wèn)題亟待解決。

(1)如何提高稀土近紅外二區(qū)熒光探針量子產(chǎn)率

熒光探針的量子產(chǎn)率是決定著其應(yīng)用發(fā)展的重要因素之一，量子產(chǎn)率高的熒光探針可以在保證成像質(zhì)量的前提下最大限度地降低所使用激發(fā)光的功率和探針的用量，從而減少對(duì)生物體的損傷，提高其安全性。目前用于提高稀土熒光探針的量子產(chǎn)率策略主要包括[95-100]：①開發(fā)晶胞尺寸更大的基質(zhì)材料和均勻摻雜的新方法以減少濃度猝滅效應(yīng)；②設(shè)計(jì)開發(fā)惰性殼層包覆的核殼結(jié)構(gòu)以減少溶劑分子對(duì)發(fā)光中心的猝滅作用；③設(shè)計(jì)開發(fā)活性殼層包覆的核殼結(jié)構(gòu)和染料敏化結(jié)構(gòu)以提高對(duì)激發(fā)光能量的捕獲能力,從而提高激發(fā)光能量的利用率。然而，上述策略對(duì)量子產(chǎn)率的提升程度有限，因此為了獲得更高量子產(chǎn)率的稀土熒光探針，進(jìn)一步探索開發(fā)提高稀土基熒光探針量子產(chǎn)率的新策略就顯得尤為重要。

(2)發(fā)展激發(fā)與發(fā)射光均處于近紅外二區(qū)的新型熒光探針

由于生物組織對(duì)處于近紅外二區(qū)波段的光有著較低的散射及自體熒光，近紅外二區(qū)熒光成像具有更深的組織穿透深度及高信噪比，因而備受人們的青睞。激發(fā)光和發(fā)射光均對(duì)成像的質(zhì)量影響較大，因此研發(fā)激發(fā)和發(fā)射光均處于近紅外二區(qū)的熒光探針可進(jìn)一步提升成像的質(zhì)量。截至目前，用于近紅外二區(qū)成像的稀土納米探針絕大多數(shù)都是利用Nd3+和Yb3+作為敏化離子(808/980 nm激發(fā))，僅有少數(shù)的Er3+(1 525 nm)敏化稀土探針。因此，現(xiàn)階段仍需進(jìn)一步開發(fā)在近紅外二區(qū)激發(fā)和發(fā)射的稀土熒光探針。

(3)發(fā)展提高稀土近紅外二區(qū)熒光探針生物安全性的新方案

如何提高熒光探針的生物安全性是其臨床應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(US Food and Drug Administration,FDA)明確要求診斷劑必須在合理的時(shí)間內(nèi)從人體內(nèi)徹底清除[101]。納米粒子的體內(nèi)代謝路徑主要有經(jīng)膽汁隨糞便排出和經(jīng)腎臟隨尿液排出兩種途徑[102]。就第二種排泄路徑而言，一般來(lái)說(shuō)直徑小于5.5 nm的“硬”材料和尺寸稍大的柔性“軟”材料(蛋白質(zhì)和聚合物等)可以通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)來(lái)清除[103]。然而，粒徑的減小會(huì)直接影響稀土熒光探針的量子效率。因而，設(shè)計(jì)開發(fā)新型功能化生物分子修飾的稀土熒光探針，使其可以經(jīng)膽汁代謝如脂質(zhì)體[57]和水溶性高分子[38,104]等，進(jìn)一步提高其生物安全性是未來(lái)該領(lǐng)域的重要發(fā)展方向之一，對(duì)推動(dòng)稀土近紅外二區(qū)熒光探針在臨床中的應(yīng)用具有重要的意義。除了研究開發(fā)優(yōu)質(zhì)熒光探針外，推動(dòng)熒光成像系統(tǒng)中另一個(gè)關(guān)鍵組成部分——光學(xué)檢測(cè)器的發(fā)展也是重中之重。由于可響應(yīng)近紅外二區(qū)波段光的檢測(cè)器價(jià)格昂貴而限制了其應(yīng)用范圍，因此，研究開發(fā)低價(jià)、高靈敏度和高質(zhì)量的光學(xué)檢測(cè)器對(duì)推動(dòng)近紅外二區(qū)熒光成像的普及應(yīng)用與發(fā)展也有著重要意義。