張爽爽 陳瑩 滕巍 張金鵬 李阿紅 惠長敏

摘 ? ?要： 為了快速而準(zhǔn)確地篩選攜帶抗病基因的甜瓜種質(zhì)資源，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)對81份甜瓜種質(zhì)資源是否攜帶抗白粉病基因、抗蔓枯病基因進(jìn)行分析。結(jié)果表明，81份甜瓜種質(zhì)資源中篩選出攜帶抗白粉病基因的甜瓜材料19份，其中攜帶純合抗性基因的甜瓜材料4份;篩選出攜帶抗蔓枯病基因的甜瓜材料5份;同時(shí)攜帶抗白粉病基因和抗蔓枯病基因的甜瓜材料1份。本試驗(yàn)研究結(jié)果可為甜瓜抗病資源的分子標(biāo)記篩選及甜瓜抗病育種提供參考。

關(guān)鍵詞：甜瓜;種質(zhì)資源;抗病基因;分子標(biāo)記;白粉病;蔓枯病

中圖分類號：S652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2020）11-008-05

Abstract： In order to screen the disease resistant melon germplasm resources quickly and accurately， molecular marker assisted selection was used to analyze 81 melon germplasm resources for powdery mildew and gummy stem blight resistance genes. The results showed that among the 81 melon germplasm resources， 19 melon materials with powdery mildew resistance genes were selected， among which 4 were homozygous resistance genes. 5 melon materials carrying gummy stem blight resistance genes were selected. One melon material carrying resistance genes to powdery mildew gene and gummy stem blight. This result provides reference for molecular marker screening and melon breeding for disease resistance.

Key words：Melon; Germplasms; Resistance gene; Molecular markers; Powdery mildew; Gummy stem blight

白粉病是危害甜瓜生產(chǎn)的一種主要病害，在甜瓜整個(gè)生育期內(nèi)均可發(fā)生。導(dǎo)致甜瓜白粉病的病原菌有3個(gè)屬6個(gè)種，其中主要病原菌是單囊殼白粉菌和二孢白粉菌，我國甜瓜白粉病均由單囊殼白粉菌引起[1-2]。由于甜瓜白粉病生理小種多、分化快，給白粉病的防治帶來困難，因此利用甜瓜自身攜帶的抗病基因防治白粉病是最直接有效的手段。根據(jù)“甜瓜基因目錄”中記載，目前已發(fā)現(xiàn)的甜瓜抗白粉病基因共20個(gè)，由不同種質(zhì)資源載體攜帶[3]。近年來，隨著甜瓜基因組測序的完成及測序技術(shù)的不斷發(fā)展，與白粉病抗性基因連鎖的分子標(biāo)記已有報(bào)道，可為分子標(biāo)記輔助選擇甜瓜抗病育種提供便利[4]。

抗白粉病甜瓜種質(zhì)資源‘MR-1是國際鑒定甜瓜白粉病生理小種的鑒別寄主之一，該材料對單囊殼白粉菌的Race1、Race2、Race3、Race5及二孢白粉菌的Race0、Race1均表現(xiàn)出抗性，但是其攜帶的抗性基因尚不明確。李冰等[5]以抗白粉病甜瓜自交系‘MR-1及感白粉病自交系‘Top Mark為材料，對‘MR-1攜帶的抗白粉病基因進(jìn)行研究，獲得與‘MR-1中抗白粉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記BSA12-LI4HINFI。以分子標(biāo)記BSA12-LI4HINFI為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在甜瓜基因組中均可擴(kuò)增出525 bp的DNA片段，將PCR產(chǎn)物回收后用Hinf I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，抗病單株被酶切成351 bp和174 bp，而感病單株仍然為525 bp。雖然與BSA12-LI4HINFI標(biāo)記緊密連鎖的抗性基因尚未報(bào)道，但是分子標(biāo)記BSA12-LI4HINFI可以有效篩選甜瓜中是否攜帶同‘MR-1相同的抗白粉病基因。

蔓枯病是甜瓜生長中后期容易發(fā)生的一種土傳性病害，該病害危害甜瓜葉片、果實(shí)和莖蔓[6]。蔓枯病由亞隔孢殼屬的瓜類黑腐球殼菌所引起，目前尚未確定致病菌生理小種的分化[7]。目前已發(fā)現(xiàn)5個(gè)抗蔓枯病的獨(dú)立基因，分別是Gsb-1、Gsb-2、Gsb-3、Gsb-4、Gsb-5，由不同抗病種質(zhì)資源所攜帶[8-9]。雖然還沒有抗蔓枯病基因被成功定位和克隆，但是隨著甜瓜基因組研究水平的不斷深入，與甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-1、Gsb-2、Gsb-3相關(guān)的分子標(biāo)記不斷被報(bào)道[10-12]。

抗蔓枯病甜瓜種質(zhì)資源‘PI482398攜帶抗蔓枯病基因Gsb-4，研究表明，該種質(zhì)在我國長江中下游地區(qū)表現(xiàn)出對蔓枯病的抗性高于攜帶Gsb-1基因的‘PI140471[13]。華德平等[14]以抗蔓枯病的‘PI482398和感蔓枯病的‘白皮脆為材料，開發(fā)出與Gsb-4基因連鎖的能夠鑒定甜瓜蔓枯病抗性的SSR分子標(biāo)記專用引物。以鑒定甜瓜蔓枯病抗性專用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，擴(kuò)增結(jié)果為135 bp DNA片段的單株為抗蔓枯病材料，擴(kuò)增結(jié)果為105 bp DNA片段的單株為感蔓枯病材料。利用該專用引物，可以快速鑒定出甜瓜對蔓枯病的抗性。

筆者采用李冰等[5]發(fā)表的鑒定白粉病抗性的分子標(biāo)記BSA12-LI4HINFI和華德平等[14]開發(fā)的鑒定甜瓜蔓枯病抗性專用引物，分析81份甜瓜種質(zhì)資源是否攜帶抗白粉病基因及蔓枯病基因（Gsb-4），篩選出攜帶抗白粉病或抗蔓枯病基因的甜瓜種質(zhì)資源，以期為甜瓜抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的81份甜瓜種質(zhì)資源由吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院西甜瓜研究中心提供，其中包括雜交種、野生種、地方品種及高世代材料。2019年3月20日將81份甜瓜材料播種在吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院西甜瓜中心育苗溫室，4月20日定植于甜瓜大棚，在整個(gè)生育期內(nèi)對81份材料田間白粉病及蔓枯病的自然發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查。

1.2 方法

1.2.1 甜瓜基因組DNA的提取 待甜瓜苗生長至3葉1心時(shí)，取幼嫩葉片，利用植物基因組DNA提取試劑盒提取甜瓜基因組DNA，并對提取的甜瓜基因組DNA濃度及質(zhì)量進(jìn)行檢測。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件 PCR反應(yīng)體系：2×mix Buffer（含DNA聚合酶、dNTP等）12.5 μL，上游引物+下游引物2 μL，DNA模板2 μL，補(bǔ)充ddH 2O至25 μL。引物序列詳見表1。

PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測 利用2%瓊脂糖凝膠電泳（150 V，35 min）對PCR產(chǎn)物檢測。

1.2.4 PCR產(chǎn)物回收 BSA12-LI4HINFI是CAPS標(biāo)記，需要繼續(xù)進(jìn)行酶切反應(yīng)，電泳后回收膠塊，利用膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收純化。

1.2.5 酶切體系及反應(yīng)條件

酶切體系：10×Buffer 2 μL，HinfI 1 μL，底物10 μL 補(bǔ)充ddH2O至20 μL。酶切條件：37 ℃酶切30 min，82 ℃變性20 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取與檢測

利用植物基因組DNA提取試劑盒提取81份甜瓜基因組DNA，并利用核酸濃度檢測儀對獲得的DNA濃度及質(zhì)量進(jìn)行檢測，提取的DNA濃度在12.3～46.4 ng·μL-1之間，OD260/280數(shù)值在1.83～2.00之間，符合后續(xù)PCR試驗(yàn)要求。

2.2 抗白粉病材料鑒定結(jié)果

以分子標(biāo)記BSA12-LI4HINFI為引物，在81份甜瓜基因組DNA中均可擴(kuò)增出525 bp的條帶，將PCR產(chǎn)物回收后用HinfI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，有19份甜瓜材料條帶被切成351 bp和174 bp，說明這些材料攜帶抗白粉病基因。但是在這些材料中有15份材料同時(shí)含有525 bp、351 bp和174 bp條帶，只有4份材料完全酶切成351 bp和174 bp。結(jié)合被篩選甜瓜資源類型分析，15份材料中包括雜交種5份、地方品種4份、高世代材料6份，說明這15份材料攜帶的可能是雜合抗病基因，而4份完全酶切的材料攜帶的是純合抗病基因。酶切電泳圖如圖1所示，材料抗性信息見表2。

2.3 抗蔓枯病材料鑒定結(jié)果

如圖2所示，以鑒定甜瓜蔓枯病抗性專用引物進(jìn)行PCR，有6份材料擴(kuò)增出135 bp的DNA片段，說明這6份材料含有Gsb-4抗蔓枯病基因。其余全部為105 bp的DNA片段，說明這些材料都不含有Gsb-4抗蔓枯病基因。材料抗性信息見表2。

2.4 田間自然發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果

在對81份甜瓜資源的抗病性進(jìn)行分子標(biāo)記篩選的同時(shí)，將材料在田間自然表現(xiàn)進(jìn)行觀察記錄。19份攜帶抗白粉病基因的材料，在田間均表現(xiàn)出高抗或中抗白粉病;6份攜帶抗蔓枯病基因的甜瓜在田間并未發(fā)現(xiàn)感染蔓枯病。分子標(biāo)記鑒定結(jié)果和田間發(fā)病情況調(diào)查的結(jié)果是一致的。

3 討論與結(jié)論

通過采用李冰等[5]發(fā)表的鑒定白粉病抗性的分子標(biāo)記BSA12-LI4HINFI，對81份甜瓜種質(zhì)資源是否攜帶抗白粉病基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19份材料被酶切成351 bp和174 bp片段，但是其中15份材料在酶切后同時(shí)存在525 bp、351 bp和174 bp的片段，CAPS標(biāo)記可以有效區(qū)分純合雜合基因型[15]，說明這15份材料攜帶的可能是雜合抗病基因，而4份完全酶切的材料攜帶的可能是純合抗病基因。

采用華德平等[14]開發(fā)的鑒定甜瓜蔓枯病抗性專用引物，對81份甜瓜種質(zhì)資源是否攜帶抗蔓枯病基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有6份材料含有抗蔓枯病基因，抗性材料僅占8%。可能是因?yàn)楸狙芯克Y選的材料多為薄皮甜瓜，薄皮甜瓜資源自身攜帶的抗蔓枯病基因與‘PI482398有所差異或是自身確實(shí)不含蔓枯病抗性基因，導(dǎo)致篩選出的抗性材料較少。

本試驗(yàn)中分子標(biāo)記鑒定結(jié)果和田間自然發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果是一致的，說明筆者所采用的2個(gè)標(biāo)記準(zhǔn)確性較高。在篩選的材料中，19號甜瓜材料同時(shí)攜帶抗白粉病基因和抗蔓枯病基因，該材料為甜瓜野生資源，野生資源的抗病性相對較強(qiáng)，這也驗(yàn)證了本試驗(yàn)所采用的2個(gè)分子標(biāo)記準(zhǔn)確性較高，說明分子標(biāo)記篩選的結(jié)果是可靠的。

筆者利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)對81份甜瓜種質(zhì)資源是否攜帶抗病基因進(jìn)行研究，篩選到攜帶抗白粉病基因的甜瓜材料19份，其中攜帶純合抗性基因的甜瓜材料4份;篩選到攜帶抗蔓枯病基因的甜瓜材料5份;同時(shí)攜帶抗白粉病基因和抗蔓枯病基因的甜瓜材料1份。目前已知甜瓜抗白粉病基因有20個(gè)、抗蔓枯病基因有5個(gè)，這些基因被不同的甜瓜種質(zhì)資源所攜帶[3，8]。筆者采用的2個(gè)標(biāo)記僅限篩選與‘MR-1及‘PI482398（Gsb-4）相同的抗病基因，因而這些被篩選材料中也可能攜帶其他抗病基因，需要與之對應(yīng)的分子標(biāo)記去篩選。為了能夠完整評價(jià)材料的抗病性，需要開發(fā)更多與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，或是采用多個(gè)抗病基因分子標(biāo)記去篩選含有綜合抗性的甜瓜資源。在后續(xù)研究中，筆者將繼續(xù)篩選具有多個(gè)抗病基因的甜瓜資源，為培育具有綜合抗性的甜瓜品種提供育種材料。

參考文獻(xiàn)

[1] 張春秋.甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的精細(xì)定位與克隆[D].北京：北京市農(nóng)林科學(xué)院，2010.

[2] 林德佩.甜瓜白粉病的抗病基因、鑒定寄主及種質(zhì)資源[J].中國瓜菜，2011，24（4）：43-45.

[3] 林德佩.瓜類作物的遺傳及育種[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2019：68-139.

[4] 許勇，張春秋，張海英，等.與甜瓜抗白粉病基因Pm-2F緊密連鎖系列分子標(biāo)記及獲取方法：北京，CN104630215A[P].2015-05-20.

[5] LI B，ZHAO Y， ZHU Q， et al. Mapping of powdery mildew resistance genes in melon （Cucumis melo L.） by bulked segregant analysis[J].Scientia Horticulturae， 2017， 220（16）：160–167.

[6] 徐兵劃.甜瓜抗蔓枯病基因聚合的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[7] 劉書林，顧興芳，石延霞，等.瓜類蔬菜蔓枯病研究概況[J].中國蔬菜，2013（18）：1-10.

[8] ? FRANTZ J D，JAHN M M. Five independent loci each control monogenic resistance to gummy stem blight in melon（Cucumis melo L.）[J].Theoretical & Applied Genetics， 2004， 108（6）：1033-1038.

[9] 畢研飛，徐兵劃，錢春桃，等.甜瓜抗蔓枯病育種研究進(jìn)展[J].中國蔬菜，2013（20）：16-22.

[10] 劉文睿，張永兵，周曉慧，等.甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-1的分子標(biāo)記及其與抗源PI420145中抗病基因的關(guān)系[J].中國瓜菜，2009，22（5）：1-4.

[11] 張永兵，陳勁楓，伊鴻平，等.甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-2的ISSR分子標(biāo)記[J].果樹學(xué)報(bào)，2011，28（2）：296-300.

[12] 張學(xué)軍，張永兵，張龑，等.甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-3的ISSR分子標(biāo)記[J].西北植物學(xué)報(bào)，2013，33（2）：261-265.

[13] 王紅英，錢春桃，婁麗娜，等.甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-4的分子標(biāo)記[J].園藝學(xué)報(bào)，2012，39（3）：574-580.

[14] 華德平，劉莉，付金玉，等.一種用于鑒定甜瓜抗蔓枯病的專用引物及分子標(biāo)記方法：天津，CN106701917A[P].2017-05-24.

[15] 豆峻嶺.西瓜果實(shí)及株型相關(guān)性狀的遺傳及分子機(jī)理研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.