朱殿明 葛家宏 楊俊杰

摘要 目的：探討芍藥提取物對(duì)高脂誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制，為臨床改善精神分裂癥認(rèn)知功能障礙提供新的思路和線索。方法：選取40只雄性SD大鼠，均給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、二甲雙胍組、芍藥提取物實(shí)驗(yàn)組各10只，分別灌胃生理鹽水、0.15 g/kg二甲雙胍溶液，5 mg/mL芍藥提取物。給藥結(jié)束后檢測(cè)大鼠體質(zhì)量，性腺脂肪量，血糖和糖化血紅蛋白，Morris水迷宮系統(tǒng)測(cè)定各組大鼠認(rèn)知功能，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與模型對(duì)照組比較，二甲雙胍組、芍藥提取物實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量，體質(zhì)量，性腺脂肪量，血糖和糖化血紅蛋白均降低（P<0.05）;大鼠的逃避潛伏期、探索距離顯著減少，目標(biāo)象限游泳時(shí)間顯著增長(zhǎng)、站臺(tái)穿越次數(shù)顯著增加;大鼠海馬組織中PI3K、phospho-AKT（S473）蛋白的表達(dá)水平降低。結(jié)論：芍藥提取物可降低高脂誘導(dǎo)的大鼠的體質(zhì)量和血糖水平，改善認(rèn)知功能，其機(jī)制與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)。芍藥提取物可能成為治療精神分裂癥認(rèn)知功能障礙的新方法。

關(guān)鍵詞 芍藥提取物;精神分裂癥;認(rèn)知功能;代謝綜合征;PI3K/AKT信號(hào)通路

Abstract Objective：To investigate the effect and mechanism of paeonia lactiflora extract on the cognitive function of high-fat diet induced rats so as to provide new ideas for clinical treatment of cognitive dysfunction in schizophrenia. Methods：A total of 40 male SD rats were feed with high-fat and high-glucose diet， and they were divided into a blank control group， a model control group， a metformin group， a paeonia lactiflora extract group with 10 cases in each group. The 10 rats were respectively orally given with normal saline， 0.15 g/kg metformin solution， 5 mg/mL paeonia lactiflora extract. After the administration， the rats′ body weight， gonadal fat mass， blood glucose and glycosylated hemoglobin were measured. The Morris water maze system was used to measure the cognitive function of rats in each group， and the protein expression levels of PI3K and AKT were measured by Western blotting. Results：Compared with the model control group， the weight， body weight， gonadal fat mass， blood sugar and glycosylated hemoglobin of rats in the metformin group and the peony extract experimental group were reduced （P<0.05）; the escape latency and exploration distance of rats were significantly reduced， and the target quadrant swimming time increased significantly and the number of platform crossings increased significantly; the expression levels of PI3K and phospho-AKT （S473） proteins in the hippocampus of rats decreased. Conclusion：Paeonia lactiflora extract can reduce the body weight and blood glucose levels in high-fat diet induced rats， and improve their cognitive function. The mechanism is related to the inhibition of the PI3K/AKT signaling pathway. Paeonia lactiflora extract may be a new way for the treatment of cognitive dysfunction in schizophrenia.

Keywords Paeonia lactiflora extract; Schizophrenia; Cognitive function; Metabolic syndrome; PI3K/AKT signaling pathway

中圖分類號(hào)：R277.7;R285.5;R749.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.22.009

精神分裂癥為高復(fù)發(fā)，高致殘的重性精神疾病，其終身患病率約為1%，患者易造成極大的疾病負(fù)擔(dān)[1]。隨著抗精神病藥物的發(fā)展，精神分裂癥的陽(yáng)性癥狀已取得較好的療效，但是認(rèn)知功能障礙一直是治療中的難題。抗精神病藥物不僅對(duì)改善認(rèn)知功能效果有局限性，而且藥物引致的代謝紊亂可能會(huì)進(jìn)一步加重認(rèn)知障礙[2]。然而認(rèn)知功能卻是影響患者回歸社會(huì)，改善疾病預(yù)后的重要因素之一。有研究報(bào)道，當(dāng)歸芍藥散中的芍藥提取物，不僅能改善阿爾茨海默氏癥以及腦卒中大鼠認(rèn)知功能的作用[3]，而且在代謝方面具有降壓、增強(qiáng)糖尿病大鼠對(duì)胰島素的敏感性、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化及保護(hù)肝細(xì)胞等作用[4]。預(yù)示芍藥提取物有望成為改善精神分裂癥患者認(rèn)知功能障礙的有效治療方式，但目前尚缺乏相關(guān)研究。本研究探討芍藥提取物對(duì)高脂誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知障礙的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 由野生型WKY大鼠基因突變后近交繁衍的SPF級(jí)SH大鼠40只，雄性，10周齡，采購(gòu)于蘇州大學(xué)。大鼠同意進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度維持室溫（23±2）℃，進(jìn)行12 h循環(huán)光照周期，飼養(yǎng)期間大鼠能夠自由進(jìn)行飲水和攝食。該實(shí)驗(yàn)已經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)全程均遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》{倫理審批號(hào)：JN.No20191215c0600105[347]}。

1.1.2 藥品 芍藥提取物（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：050124）;二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20023370）。

1.1.3 試劑與儀器 糖化血紅蛋白試劑盒（南京建成生物有限公司，貨號(hào)：A056-1）;BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：P0012）;抗體PI3K（Proteintech，貨號(hào)：67121-1-Ig）、AKT（Proteintech，貨號(hào)：10176-2-AP）、phospho-AKT（S473）（Proteintech，貨號(hào)：66444-1-Ig）、β-actin（Proteintech，貨號(hào)：66009-1-Ig）;Morris水迷宮（上海吉量軟件科技有限公司，型號(hào)：JLBehv-M）;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Bio-RAD，美國(guó)，型號(hào)：1681130A）;三諾安穩(wěn)血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司，型號(hào)：STX）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只SH大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、二甲雙胍組、芍藥提取物實(shí)驗(yàn)組，每組10只，大鼠會(huì)進(jìn)行7 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)?？瞻讓?duì)照組喂食普通飼料，其余各組大鼠喂食自制高脂高糖飼料，共喂食8周[5]。

1.2.2 給藥方法 二甲雙胍組灌胃0.15 g/kg二甲雙胍溶液，芍藥提取物實(shí)驗(yàn)組灌胃5 mg/mL芍藥提取物，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組給與等體積生理鹽水，1次/d，所有大鼠均連續(xù)給藥4周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.2.3.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 按“1.2.1”的方法進(jìn)行分組，采用Morris水迷宮法[6]對(duì)大鼠的認(rèn)知功能進(jìn)行測(cè)定：4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)分別位于4個(gè)象限的正中間處，在任意一象限水中，擺放一個(gè)黑色露臺(tái)。在上午和下午4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)分別訓(xùn)練一次，共進(jìn)行4 d。第5天時(shí)，去掉黑色露臺(tái)，將大鼠從第一個(gè)標(biāo)記點(diǎn)放入水中。Any-maze動(dòng)物行為學(xué)分析軟件將會(huì)記錄大鼠的游泳軌跡及90 s內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期，學(xué)習(xí)功能）;第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)（記憶功能），記錄90 s穿過(guò)虛擬平臺(tái)的次數(shù)。

1.2.3.2 取材與標(biāo)本處理 按“1.2.1”的方法進(jìn)行分組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)大鼠禁食12 h，記錄各組大鼠體質(zhì)量和空腹血糖值。各組大鼠尾靜脈取血，提取取血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定糖化血紅蛋白[7]。取大鼠性腺脂肪組織，稱重，記錄其重量。

1.2.3.3 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平 取出凍存的大鼠組織使用磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液進(jìn)行裂解，用均漿器研磨組織至完全粉碎，取上清液，使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒對(duì)組織蛋白濃度進(jìn)行定量。組織蛋白通過(guò)SDS-PAGE膠進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。使用5%的脫脂奶粉對(duì)非特異性結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行阻斷，用相應(yīng)一抗（目標(biāo)蛋白一抗：PI3K、phospho-AKT（S473）、AKT;內(nèi)參蛋白一抗：β-actin）4 ℃孵育過(guò)夜。在室溫下與交聯(lián)二抗孵育2 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。利用Image J 8.0對(duì)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)的條帶進(jìn)行灰度分析。PI3K以β-actin作為參照，Phospho-AKT（S473）以AKT作為參照，以條帶灰度比值作為表達(dá)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中計(jì)量資料用（±s）表示，組間比較采用單因素方差（One Way ANOVA）分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芍藥提取物對(duì)高脂誘導(dǎo)的大鼠模型體質(zhì)量、性腺脂肪量、血糖和糖化血紅蛋白的影響 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血糖、糖化血紅蛋白水平顯著升高（P<0.05），體質(zhì)量、性腺脂肪含量也顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型對(duì)照組比較，二甲雙胍組、芍藥提取物組明顯降低大鼠血糖及糖化血紅蛋白水平（P<0.05），體質(zhì)量、性腺脂肪含量也顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 芍藥提取物對(duì)大鼠模型Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)的影響 定位航行實(shí)驗(yàn)，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)、游泳探索距離增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型對(duì)照組比較，二甲雙胍組、芍藥提取物組逃避潛伏期時(shí)間顯著減短、游泳探索距離顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 芍藥提取物對(duì)大鼠模型Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)的影響 空間探索實(shí)驗(yàn)，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組目標(biāo)象限游泳時(shí)間顯著縮短，站臺(tái)穿越次數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型對(duì)照組比較，二甲雙胍組、芍藥提取物組目標(biāo)象限游泳時(shí)間顯著增長(zhǎng)，站臺(tái)穿越次數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

[7]鄭琳穎，潘競(jìng)鏘，呂俊華.白芍總苷對(duì)脂肪肝大鼠增強(qiáng)胰島素敏感性及抗脂肪肝作用[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33（20）：2385-2390.

[8]Keefe RS，Eesley CE，Poe M P.Defining a cognitive function decrement in schizophrenia.[J].Biological Psychiatry，2005，57（6）：688-691.

[9]Francisco，Javier，Acosta，etc.Medication adherence in schizophrenia[J].World Journal of Psychiatry，2012，2（5）：74-82.

[10]銀春燕，白克鎮(zhèn).新型抗精神病藥物對(duì)代謝綜合癥的影響研究進(jìn)展[J].西南軍醫(yī)，2009，11（1）：81-83.

[11]李晨虎，饒順曾，沈文龍，等.慢性精神分裂癥伴代謝綜合征的認(rèn)知功能研究[J].神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生，2011，11（6）：586-588.

[12]朱葉芳，黨姍姍，華子瑜.芍藥苷神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（11）：1490-1493.

[13]曾嬙，李利民，金宇，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究芍藥防治老年癡呆的作用機(jī)制[C].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)第八屆虛證與老年醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)，中國(guó)老年學(xué)和老年醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)中西醫(yī)結(jié)合分會(huì)，江蘇省中醫(yī)藥學(xué)會(huì)老年醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)2019年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集，2019.

[14]劉港，胡增峣，王濤，等.當(dāng)歸芍藥散活性成分芍藥苷抗神經(jīng)炎性反應(yīng)的初步研究[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2011，25（增刊）：94-94.

[15]饒夢(mèng)琳，向莉，封莎，等.芍藥苷激活CB2受體對(duì)腦缺血神經(jīng)的保護(hù)作用[C].全國(guó)老年人常見(jiàn)疾病防治研討會(huì)，2014.

[16]李健，劉春娜，劉新宇，等.芍藥苷對(duì)認(rèn)知功能障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶功能和海馬神經(jīng)因子的影響[J].江蘇醫(yī)藥，2014，40（12）：1365-1367.

[17]Solit D B，Basso A D，Olshen A B，et al.Inhibition of heat shock protein 90 function downregulates Akt kinase and sensitizes tumors to taxol[J].Cancer Res，2003，63（9）：2139-2144.

[18]Song G，Ouyang G L，Bao S D.The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival[J].J Cell Mol Med，2005，9（1）：59-71.

[19]Xin M G，Deng X M.Nicotine inactivation of the proapoptotic function of bax through phosphorylation[J].J Biol Chem，2005，280（11）：10781-10789.

（2020-09-22收稿 責(zé)任編輯：蒼寧）