吳映?陳煜森?魏莊盛

【摘要】酸性鞘磷脂酶（ASMase）不僅介導(dǎo)溶酶體代謝，參與膜結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且對鞘磷脂轉(zhuǎn)化為神經(jīng)酰胺起關(guān)鍵作用。ASMase由鞘磷脂磷酸二酯酶1（SMPD1）基因編碼。最近有研究顯示SMPD1及ASMase與神經(jīng)退行性疾病如帕金森病的發(fā)病和進展相關(guān)。該文就SMPD1及ASMase與帕金森病的相關(guān)研究進行介紹，以供同行們參考。

【關(guān)鍵詞】酸性鞘磷脂酶;帕金森病;鞘磷脂磷酸二酯酶1基因;細(xì)胞外囊泡;α-突觸核蛋白

Acid sphingomyelinase and Parkinsons disease Wu Ying， Chen Yusen， Wei Zhuangsheng. Department of Neurology， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524001， China

Corresponding author， Chen Yusen， E-mail： chenyusen925@ 163. com

【Abstract】Acid sphingomyelinase （ASMase） not only mediates lysosomal metabolism， participates in the regulation of membrane structure and signal transduction， but also plays a key role in the conversion of sphingomyelin into ceramide. ASMase is encoded by the sphingomyelin phosphodiesterase 1 （SMPD1） gene. Recent studies have found that SMPD1 and ASMase are correlated with the onset and progression of neurodegenerative diseases， such as Parkinsons disease. In this article， the research progress on the association between SMPD1， ASMase and Parkinsons disease was reviewed.

【Key words】Acid sphingomyelinase;Parkinsons disease;

Sphingomyelin phosphodiesterase 1 gene;Extracellular vesicle;α-synuclein

帕金森?。≒D）是一種常見的與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態(tài)異常等運動癥狀。黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元大量丟失、存活神經(jīng)元中存在包涵體路易小體（LB）是PD的主要病理學(xué)特征。異常聚集的α-突觸核蛋白（α-Syn）、泛素及熱休克蛋白是組成LB的主要成分。目前PD的診斷主要靠臨床表現(xiàn)，早期診斷比較困難，在治療上亦尚無治愈方法，因此尋找PD早期診斷、判斷預(yù)后的新型標(biāo)志物和新型治療方法已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。越來越多研究表明，鞘脂是與年齡有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的重要調(diào)節(jié)劑[1]。此外，有關(guān)神經(jīng)退行性疾病的研究還顯示了血液及一些組織中存在異?；钚缘乃嵝郧柿字福ˋSMase）——一種重要的鞘脂代謝酶[1]。

ASMase缺乏會引發(fā)尼曼-匹克?。∟PD），這是一種溶酶體貯積病，在細(xì)胞水平上以鞘磷脂在內(nèi)溶酶體區(qū)室中蓄積為特征。NPD分為經(jīng)典型A型急性神經(jīng)型（NPA）、B型非神經(jīng)型（NPB）及C型慢性神經(jīng)型（NPC）。NPA于1914年首次被確定為嚴(yán)重的嬰兒神經(jīng)退行性疾病，此外，NPA、NPB和NPC患者均曾被報道出現(xiàn)PD癥狀。例如，1例9個月大的NPA女性患兒出現(xiàn)舌頭和一側(cè)身體的震顫;1例55歲的晚發(fā)性NPB女性患者表現(xiàn)為PD表型;1例10歲的NPC男性患兒出現(xiàn)帕金森綜合征并伴有僵硬無力綜合征;1例75歲的1p.G992R突變的NPC女性患者出現(xiàn)帕金森震顫，她的3個兄弟均出現(xiàn)了帕金森震顫[2-3]。在多項研究中，編碼該酶的鞘磷脂磷酸二酯酶1（SMPD1）基因突變被證實為PD發(fā)病的危險因素之一，近期更有學(xué)者提出，ASMase的活性降低與PD的早期發(fā)病有關(guān)[4]。此外，在人類細(xì)胞模型中，SMPD1突變及ASMase缺乏可導(dǎo)致α-Syn積聚。上述發(fā)現(xiàn)為ASMase對PD的潛在作用提供了證據(jù)，在此，我們對SMPD1基因、ASMase的結(jié)構(gòu)以及ASMase與PD的研究進展進行介紹，以供同行參考。

一、SMPD1基因及ASMase概述

1. SMPD1基因

SMPD1基因（GenBank NC 000011.10）位于第11號染色體（11p15.1-11p15.4）上，全長約5 kb，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，并優(yōu)先從母體染色體表達（即父系印跡）[5]。目前研究者已鑒定出有7種類型（1 ～ 7型）的SMPD1基因轉(zhuǎn)錄本，只有1型轉(zhuǎn)錄本編碼了具有催化活性的功能性人ASMase，而其他轉(zhuǎn)錄本是由交替剪接產(chǎn)生的，缺少部分催化和（或）羧基末端結(jié)構(gòu)域，不編碼功能性酶[6]。

2. ASMase

2.1 ASMase的生物合成、N-糖基化及巰基修飾

ASMase在幾乎所有類型的細(xì)胞中表達，根據(jù)定位不同分為細(xì)胞內(nèi)溶酶體形式和細(xì)胞外分泌形式。在正常情況下ASMase位于內(nèi)小體/溶酶體間隔內(nèi)，在細(xì)胞應(yīng)激和疾病期間，ASMase可以優(yōu)先轉(zhuǎn)運到細(xì)胞膜的外葉，并分泌到細(xì)胞外間隙[1]。

ASMase的生物合成始于75 kDa的前體，該前體幾乎無酶促活性，并且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中被蛋白水解切割成72 kDa的前體。72 kDa的前體形式在核糖體-溶酶體區(qū)室中進一步加工成70 kDa的成熟且具有完全活性的溶酶體ASMase[7]。

成熟形式ASMase多肽鏈中具有6個N-糖基化位點及8個二硫鍵，其中5個N-糖基化位點（Asn86、Asn175、Asn335、Asn395與Asn520）寡糖側(cè)鏈包含甘露糖-6-磷酸殘基，這是溶酶體蛋白的典型特征，這5個位點對于正確折疊，防止蛋白水解和酶活性十分重要[7]。

ASMase的17個半胱氨酸殘基中只有16個參與二硫鍵的形成。未橋接的羧基末端Cys629的缺失或氧化導(dǎo)致ASMase活性提高4 ～ 5倍[8-9]。Cys629通過化學(xué)修飾，銅促進的二聚作用或該殘基的缺失使該氨基酸上的巰基丟失，從而導(dǎo)致ASMase活化，并且有研究者認(rèn)為該殘基在成熟蛋白中的保留可能會導(dǎo)致無活性的高分子量聚集體的形成[8]。

2.2 ASMase的溶酶體轉(zhuǎn)運

作為一種可溶性的溶酶體水解酶，ASMase靶向溶酶體的主要機制是甘露糖-6-磷酸受體系

統(tǒng)[9]。ASMase的N端信號肽將核糖體引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，ASMase的N端在ER中進行核心糖基化后，通過高爾基體運輸?shù)椒词礁郀柣w網(wǎng)絡(luò)（TGN），進一步被甘露糖-6-磷酸殘基修飾后離開TGN。這些殘基被甘露糖-6-磷酸受體特異性識別，確保它們被轉(zhuǎn)運到內(nèi)小體/溶酶體間隔內(nèi)，由于后者的酸性pH特性，它們最終變得活躍[9-10]。此外，還有證據(jù)表明存在另一種甘露糖-6-磷酸非依賴性溶酶體靶向機制，例如山梨素介導(dǎo)的不同皂苷的轉(zhuǎn)運[11]。但甘露糖-6-磷酸受體介導(dǎo)的途徑似乎是這2種機制中更占優(yōu)勢的一條。

2.3 SMPD1基因的突變與ASMase的活性

SMPD1基因的突變會降低ASMase活性甚至使其活性消失，Alcalay等[4]在HeLa細(xì)胞中采用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)進行SMPD1基因敲除，獲得了12個敲除克隆并將其與野生型細(xì)胞進行了比較，蛋白免疫印跡結(jié)果表明，所有克隆中的ASMase表達幾乎完全喪失。此外，他們?yōu)榱搜芯縎MPD1變體如何影響ASMase活性，將ASMase在亞細(xì)胞中的定位與野生型ASMase的3個變體（p.L302P、? p.fsP330與p.A487V突變）進行了比較，發(fā)現(xiàn)具有p.L302P或p.fsP330突變的ASMase未能到達溶酶體區(qū)室，并且?guī)缀跬耆挥趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)中。p.A487V突變則不受影響，說明ASMase溶酶體定位受特定SMPD1變體影響。他們還進行計算機分析，表明SMPD1基因的突變對ASMase的結(jié)構(gòu)和功能具有有害影響。因此，SMPD1基因的突變可能通過影響ASMase活性進一步在相關(guān)疾病的發(fā)生及發(fā)展中起作用。

二、ASMase與PD

一項有關(guān)NPA神經(jīng)退行性病程病理機制的研究顯示，在ASMase敲除小鼠（ASMko）的模型中，ASMase缺乏會引起脂質(zhì)改變及鞘磷脂積累，進一步引發(fā)大腦一系列的病理反應(yīng)，包括神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膨脹溶酶體的積累和浦肯野細(xì)胞神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的完全喪失，信號傳導(dǎo)途徑異常，鈣穩(wěn)態(tài)失衡，軸突極性改變和內(nèi)吞功能受損，星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的微粒受損等[12]。ASMase參與PD病理過程的確切機制仍存在爭議。一項研究顯示，與正常樣品的干血斑相比，PD樣品中ASMase的活性并無改變[13]。然而另有研究者指出，降低ASMase活性會增加PD的發(fā)病風(fēng)險，ASMase活性降低與PD發(fā)病時間提前3.5 ～ 5.8年有關(guān)[4]。目前，ASMase與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的研究越來越多，但與PD關(guān)系的研究仍較少，ASMase與PD的發(fā)生發(fā)展是否存在直接相關(guān)性尚需要進行更多的研究。有研究者發(fā)現(xiàn)編碼ASMase的基因SMPD1基因及ASMase下游代謝物神經(jīng)酰胺與PD發(fā)生風(fēng)險增高相關(guān)，另外，ASMase還會影響細(xì)胞外囊泡的分泌和生成，這與PD的α-Syn的傳播相關(guān)。而且，ASMase活性下降或會進一步引起α-Syn升高。

1. SMPD1基因與PD

SMPD1基因p.L302P突變在德系猶太NPA患者中很常見，據(jù)報道該變異使德系猶太人PD的發(fā)病風(fēng)險增加9倍[14]。Foo等[15]對198例中國PD患者SMPD1基因的所有外顯子進行了測序，確定了SMPD1基因中的4種罕見變體（p.P332R、p.Y500H、p.P533L與p.R591C突變）僅在患者中存在，而在對照受試者中不存在。隨著時間的推移，在不同的隊列中觀察到了許多與PD發(fā)病風(fēng)險增加相關(guān)的突變[16-18]。后來，宋娜等[19]報道3.64%的中國PD患者存在SMPD1基因突變，這些突變或會對ASMase酶的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生破壞作用。據(jù)報道，SMPD1基因的Leu-Ala（Val）重復(fù)變異與中國漢族散發(fā)性PD存在相關(guān)性[20]。目前，對整個外顯子組測序數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)分析進一步證實了SMPD1基因突變與發(fā)生PD的較高易感性之間的關(guān)聯(lián)[21]。

2. ASMase的下游代謝物神經(jīng)酰胺

ASMase是溶酶體酶家族成員，該酶可通過裂解磷酸膽堿鍵來催化鞘磷脂的分解，從而產(chǎn)生神經(jīng)酰胺。鞘磷脂是所有哺乳動物膜的主要脂質(zhì)成分，也是膜外小葉中最普遍的脂質(zhì)，由與神經(jīng)酰胺骨架連接的磷酸膽堿部分組成。神經(jīng)酰胺可進一步轉(zhuǎn)化為鞘氨醇-1-磷酸（S1P）、 鞘氨醇等一系列描述神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的抗逆性、增殖、分化和成熟表型的生物活性鞘脂，它們通過脂質(zhì)成分的改變促進細(xì)胞膜特性變化而觸發(fā)信號傳導(dǎo)事件[22-23]。越來越多研究顯示神經(jīng)酰胺和S1P作為信號分子中的主要鞘脂控制多種細(xì)胞活動，包括血管生成、炎癥、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老、自噬、轉(zhuǎn)移等，特別是參與大腦衰老和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[24]。脂質(zhì)組學(xué)分析顯示，與對照樣品相比，PD死亡患者腦組織中的神經(jīng)酰胺和鞘磷脂的水平發(fā)生改變[25]。在血漿中，PD患者的幾種飽和神經(jīng)酰胺水平更高[26]。此外，癡呆的PD患者中的某些血液神經(jīng)酰胺水平高于非癡呆的PD患者，包括與PD相關(guān)的精神病并發(fā)癥有關(guān)的幾種飽和神經(jīng)酰胺[27]。在PD患者中檢測到的血漿神經(jīng)酰胺代謝異常的證據(jù)支持了ASMase/神經(jīng)酰胺代謝途徑參與PD發(fā)病機制的假說[26]。

3. ASMase與細(xì)胞外囊泡

細(xì)胞外囊泡包括外泌體、微囊泡（微粒）及凋亡小體，它們作為體液中一種穩(wěn)定存在的載體，包裹生物活性蛋白、糖類、脂質(zhì)和廣泛核酸，在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起信息傳遞作用[28]。有研究表明，神經(jīng)酰胺的合成參與多泡體腔內(nèi)囊泡形成中的不依賴內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體（ESCRT）的生物發(fā)生途徑，多泡體與質(zhì)膜融合后，囊泡以外泌體的形式釋放[23]。Bianco等[29]確定ASMase為負(fù)責(zé)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞）表面ATP受體P2X7依賴的微囊泡生物發(fā)生的關(guān)鍵酶。在鞘磷脂轉(zhuǎn)化為神經(jīng)酰胺的過程中，神經(jīng)酰胺進入質(zhì)膜的內(nèi)部小葉，其倒錐結(jié)構(gòu)可以擾亂膜曲率和流動性，有利于微囊泡的萌芽和釋放[30]。此外，Wang等[31]通過選擇性抑制劑或短干擾RNA（siRNA）抑制ASMase表達或活性，減弱了ATP誘導(dǎo)的鞘磷脂水解，而且減弱了具有促凝血活性的組織因子陽性微囊泡的釋放。細(xì)胞外囊泡參與神經(jīng)退行性疾病中錯誤折疊蛋白質(zhì)（例如PD的α-Syn）的傳播和擴散，還能促進其異常聚集，隨后將這些毒性聚集體擴散到神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的無病變區(qū)域，神經(jīng)元通過內(nèi)吞的方式處理這些“毒性”蛋白，因此加速了神經(jīng)元退化，形成惡性循環(huán)[32]。ASMase活性的改變可能通過影響神經(jīng)酰胺的生成進一步影響細(xì)胞外囊泡內(nèi)容物或數(shù)量的改變，從而影響神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展，ASMase活性及細(xì)胞外囊泡數(shù)目及內(nèi)容物含量變化或可作為診斷PD的生物學(xué)標(biāo)志物。

4.ASMase與α-Syn

Alcalay等[4]敲除小鼠SMPD1基因，發(fā)現(xiàn)12個敲除SMPD1基因的小鼠體內(nèi)幾乎完全喪失ASMase表達，這與其中10個小鼠中α-Syn水平升高相關(guān)，且證實無論使用何種siRNA，ASMase的表達均會降低，這導(dǎo)致α-Syn水平平均升高約3倍。ASMase如何引起α-Syn水平升高的機制尚未明確，鈣動態(tài)平衡不良可能起重要作用[3]。細(xì)胞產(chǎn)生的α-Syn以鈣依賴的方式通過外泌體分泌并影響神經(jīng)元存活，持續(xù)進入的鈣離子可以加速內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體衰老，這是鈣穩(wěn)態(tài)的2個主要細(xì)胞器[33-35]。此外，一項體外研究顯示胞質(zhì)鈣的增加似乎在1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，這暗示鈣穩(wěn)態(tài)在PD中的可能作用[36]。有研究者在敲除SMPD1基因小鼠的大腦中檢測到了鈣穩(wěn)態(tài)的改變，這可能會影響多巴胺能神經(jīng)元對遺傳和環(huán)境因素的脆弱性，從而在PD發(fā)生發(fā)展中起作用[12]。

三、小結(jié)與展望

綜上所述，編碼ASMase的SMPD1基因突變與PD有關(guān)，SMPD1基因突變會影響ASMase溶酶體定位導(dǎo)致ASMase活性的降低甚至消失，ASMase的降低還會引起下游物質(zhì)神經(jīng)酰胺水平的降低及PD病理蛋白α-Syn水平的增高。神經(jīng)酰胺和S1P作為信號分子參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展，PD死亡患者腦中的神經(jīng)酰胺水平異常。因此可以猜想，PD患者血漿或腦脊液等體液中ASMase含量或活性可能會發(fā)生改變，ASMase及神經(jīng)酰胺有望成為診斷PD的生物學(xué)標(biāo)志物。此外，越來越多研究者認(rèn)為ASMase具有作為衰老和各種與年齡有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的藥物靶標(biāo)的潛力[1]。在PD中，ASMase可以影響細(xì)胞外囊泡的生成和釋放從而可能參與PD的病理蛋白α-Syn的傳播和擴散，這為PD的治療提供了新靶點和新方向。

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（收稿日期：2020-08-30）

（本文編輯：洪悅民）