劉智慧，孟峻

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，呼和浩特 010000

2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，呼和浩特 010000

研究表明，細(xì)胞修復(fù)受損傷的DNA是通過(guò)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的[1]。在正常細(xì)胞中，受損的DNA通常于G1/S期檢查點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)，而大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞于G1/S期檢查點(diǎn)存在修復(fù)缺陷，主要與TP53基因的失活有關(guān)。因此，在多數(shù)情況下，腫瘤細(xì)胞會(huì)依賴G2/M期檢查點(diǎn)來(lái)修復(fù)受損的DNA。G2/M期檢查點(diǎn)主要依賴于Wee1蛋白激酶和細(xì)胞分裂周期因子25（cell division cyclin 25，CDC25）對(duì)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1，又稱CDC2）進(jìn)行翻譯后修飾。Wee1在第15位酪氨酸殘基（tyrosine 15，Y15）處磷酸化CDK1，在DNA復(fù)制過(guò)程中造成G2/M期阻滯[2]。上述分子事件為細(xì)胞有絲分裂前的DNA修復(fù)提供了檢查點(diǎn)，但在DNA損傷的背景下抑制細(xì)胞周期檢查點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷持續(xù)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這是無(wú)法彌補(bǔ)的遺傳損傷。早期臨床研究主要集中在DNA損傷劑存在的情況下調(diào)節(jié)Wee1的活性和廢除G2期DNA損傷修復(fù)檢查點(diǎn)，利用有絲分裂災(zāi)難的概念作為抗腫瘤活性的機(jī)制。體外研究表明，Wee1在穩(wěn)定復(fù)制叉和同源重組修復(fù)中也起著重要作用[3]。Wee1在DNA修復(fù)中發(fā)揮了更大的作用，進(jìn)一步支持了其作為惡性腫瘤治療中可行治療靶點(diǎn)的有效性。

1 Wee1在細(xì)胞周期和DNA 損傷修復(fù)中的作用

細(xì)胞周期檢查點(diǎn)與細(xì)胞周期阻滯和DNA損傷反應(yīng)的關(guān)系密切，對(duì)修復(fù)和維持基因組的完整性具有重要意義。p53主要通過(guò)ATM（ATR）/CHK1（CHK2）-p53/MDM2-p21通路誘導(dǎo)持續(xù)或永久性的G1期阻滯。但是，目前研究表明，多數(shù)腫瘤存在p53基因的突變和缺失，這就更加依賴于G2/M期的檢查點(diǎn)，而Wee1是G2/M期阻滯的關(guān)鍵激酶[4]。Wee1通過(guò)磷酸化CDK1、調(diào)節(jié)CDK1/細(xì)胞周期蛋白B（cyclin B）復(fù)合物的活性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。作為G2/M期檢查點(diǎn)的組成部分，Wee1決定進(jìn)入有絲分裂的時(shí)間點(diǎn)，并抑制細(xì)胞周期的早期進(jìn)展，同時(shí)也參與細(xì)胞對(duì)DNA的損傷反應(yīng)[5-6]。Wee1還通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）的磷酸化狀態(tài)維持DNA復(fù)制過(guò)程中復(fù)制叉的穩(wěn)定[7]。

2 Wee1蛋白激酶抑制劑

MK-1775是一種高效的、選擇性的Wee1小分子抑制劑，屬于吡唑嘧啶衍生物，其半抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）為 5 nmol/L[8]。MK-1775與放療、化療相結(jié)合的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)（Ⅰ期和Ⅱ期）正在進(jìn)行中，包括以下試驗(yàn)：①作為肉瘤細(xì)胞和難治性實(shí)體瘤的單一療法[9-10]；②作為乳腺癌的單一療法[11]；③聯(lián)合吉西他濱、5-氟尿嘧啶、順鉑和卡鉑在卵巢癌和結(jié)腸癌中的應(yīng)用[12-13]；④聯(lián)合放射治療在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的應(yīng)用[14]；⑤聯(lián)合吉西他濱在胰腺移植瘤中的應(yīng)用[15]。上述研究表明Wee1蛋白激酶抑制劑在臨床上既可作為單一治療方法，亦可與傳統(tǒng)的DNA損傷劑聯(lián)合使用。

3 Wee1蛋白激酶抑制劑對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的靶向治療作用

3.1 Wee1蛋白激酶抑制劑與乳腺癌細(xì)胞

一項(xiàng)評(píng)估Wee1沉默對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7（攜帶野生型p53）和MDA-MB-468（含突變型）抑瘤作用的研究發(fā)現(xiàn)，敲除Wee1基因?qū)?xì)胞凋亡因子p53、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）的表達(dá)產(chǎn)生影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wee1沉默可使MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞株的活力降低50%以上；DNA含量測(cè)定結(jié)果顯示，沉默1周后，細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯增加；Wee1蛋白激酶抑制劑也誘導(dǎo)了乳腺癌細(xì)胞中p53的表達(dá)上調(diào)，并且兩種細(xì)胞株中VEGF和Bcl-2的表達(dá)水平均明顯降低[16]，表明抑制Wee1可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞G2期阻滯消失，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-468對(duì)Wee1沉默的敏感性似乎與p53的表達(dá)水平一致。抑制Wee1會(huì)使p53缺陷的腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療敏感，其原因可能是由p53突變的腫瘤細(xì)胞G1檢查點(diǎn)缺失和Wee1或CHK1抑制后G2檢查點(diǎn)缺失的聯(lián)合作用導(dǎo)致的，其共同促進(jìn)細(xì)胞增殖，盡管存在未修復(fù)的DNA損傷。目前，針對(duì)人類表皮生長(zhǎng)因子2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽(yáng)性乳腺癌患者的治療策略是使用HER2受體靶向藥物曲妥珠單抗，但約70%的患者發(fā)生了對(duì)曲妥珠單抗抵抗的現(xiàn)象[17]。同時(shí)，新的證據(jù)表明，腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）與曲妥珠單抗抵抗密切相關(guān)，其促進(jìn)了腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[18]。Sand等[19]的研究表明，MK-1775通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的活性和增殖以及誘導(dǎo)其凋亡從而靶向曲妥珠單抗耐藥的HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞；該研究還發(fā)現(xiàn)，MK-1775是通過(guò)抑制黏蛋白1（mucin 1，MUC1）的表達(dá)從而靶向誘導(dǎo)CSC的形成。其中，MUC1是一種評(píng)價(jià)抗曲妥珠單抗功能性的生物標(biāo)志物，其裂解產(chǎn)物在腫瘤細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中充當(dāng)生長(zhǎng)因子受體[20]。Mir等[21]發(fā)現(xiàn)Wee1抑制劑可以克服CSC對(duì)輻射的抵抗。Zhou等[22]證明了Wee1或CHK1靶向藥物與組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑聯(lián)合治療對(duì)某些白血病干細(xì)胞樣細(xì)胞有效。由此可以假設(shè)MK-1775也可以有效地靶向其他惡性腫瘤，但這些惡性腫瘤既往由于CSC亞群而表現(xiàn)出對(duì)一線治療的抵抗，因此仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2 Wee1蛋白激酶抑制劑與黑色素瘤細(xì)胞

通過(guò)靶向關(guān)鍵細(xì)胞的途徑治療黑色素瘤已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，但許多患者對(duì)治療產(chǎn)生了耐藥性或治療后復(fù)發(fā)，因此仍需尋找其他靶點(diǎn)。微小RNA（microRNA，miRNA）-155對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用[23]。一項(xiàng)檢測(cè)黑色素瘤中miRNA-155表達(dá)情況的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)黑色素瘤中的miRNA-155的表達(dá)水平較低，但不能預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況；在小鼠實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型中發(fā)現(xiàn)miRNA-155、Wee1的表達(dá)情況與黑色素瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)[24]，確認(rèn)了Wee1是miRNA-155的新靶點(diǎn)，表明miRNA-155的高表達(dá)和Wee1的沉默均可減少小鼠模型中黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，且其能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Wee1激酶的表達(dá)從而調(diào)控黑色素瘤的轉(zhuǎn)移，Wee1也對(duì)細(xì)胞周期具有調(diào)節(jié)作用。miRNA-155、Wee1與其他驅(qū)動(dòng)黑色素瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞過(guò)程的關(guān)系尚待今后的研究進(jìn)一步闡明，為黑色素瘤的靶向治療提供新的理論依據(jù)。

3.3 Wee1抑制劑與結(jié)直腸癌細(xì)胞

結(jié)直腸癌是男性第二高發(fā)的惡性腫瘤，僅次于前列腺癌[25]。早期篩查可降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率[26]。然而，傳統(tǒng)化療藥物對(duì)晚期結(jié)直腸癌患者的治療效果不佳，導(dǎo)致晚期患者預(yù)后差。有研究表明，抑制Wee1的表達(dá)僅能增強(qiáng)DNA損傷相關(guān)藥物和放療對(duì)p53缺陷的腫瘤細(xì)胞的作用[27]。但也研究表明，Wee1對(duì)p53野生型和突變型腫瘤均具有化療增敏效果[28]。Yin等[29]通過(guò)分析Wee1抑制劑MK-1775對(duì)p53突變型結(jié)腸癌細(xì)胞HT29和SW480的抗腫瘤作用發(fā)現(xiàn)，MK-1775能明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。有研究已發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)結(jié)果顯示，MK-1775可以劑量依賴性地增加DNA損傷標(biāo)志物組蛋白H2A的一種亞型（γ-H2AX）。MK-1775還可提高HT29和SW480細(xì)胞對(duì)伊立替康的敏感性[30-31]，與相關(guān)研究結(jié)果一致[29]。雖然MK-1775單藥治療在p53突變的結(jié)腸癌細(xì)胞中可以起到抗腫瘤作用，但由于靶向細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的藥物具有毒性，因此，治療劑量是一個(gè)重要問(wèn)題。有研究采取了適當(dāng)?shù)牟呗砸蕴岣吣[瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性效應(yīng)的敏感性[32-33]。

3.4 Wee1抑制劑與肺癌細(xì)胞

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要病理類型。早期NSCLC以手術(shù)、輔助化療或放療為主，晚期NSCLC患者主要采取針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）/鼠類肉瘤病毒癌基因同源物 B1（v-raf murine sarcoma viraloncogene homolog，BRAF）等基因突變的靶向治療和免疫治療方法[34-35]。表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）是EGFR突變的NSCLC的一線治療藥物。但是，治療后9～14個(gè)月，接受EGFR-TKI治療的患者不可避免地會(huì)產(chǎn)生耐藥性。有研究表明，在EGFR-TKI耐藥細(xì)胞系中，Wee1的表達(dá)水平較高，并且隨著G2/M細(xì)胞周期的延長(zhǎng)，Wee1的表達(dá)水平逐漸增加；58.3%（7/12）的獲得性伊克替尼/吉非替尼耐藥患者的Wee1表達(dá)水平高于其初始表達(dá)水平；當(dāng)敲除EGFR-TKI耐藥的H1299和PC9/G2細(xì)胞的Wee1基因后，順鉑和吉西他濱對(duì)兩種細(xì)胞株的作用增強(qiáng)，主要體現(xiàn)在H1299組順鉑的IC50值由 8.64 μg/ml降至 3.10 μg/ml，而 PC9/G2 組順鉑的IC50值由3.66 μg/ml降至0.97 μg/ml；表明Wee1基因的敲除可增強(qiáng)EGFR-TKI耐藥的NSCLC的化療敏感性[36]。此外，Liu等[37]對(duì)663例NSCLC患者進(jìn)行了Wee1基因多態(tài)性與化療療效相關(guān)性的研究，結(jié)果顯示，Wee1 rs3910384 G/G純合基因型晚期NSCLC患者經(jīng)順鉑和吉西他濱方案治療后，總生存期延長(zhǎng)13.5個(gè)月，無(wú)進(jìn)展生存期延長(zhǎng)3.2個(gè)月，3年生存期延長(zhǎng)13.5個(gè)月，說(shuō)明Wee1 rs3910384 G/G純合基因型晚期NSCLC患者對(duì)順鉑和吉西他濱化療方案敏感。因此，Wee1 rs3910384 G/G純合基因型可作為一個(gè)潛在的工具來(lái)決定化療方案，以促進(jìn)NSCLC患者個(gè)性化治療的實(shí)現(xiàn)。

3.5 Wee1抑制劑與胰腺癌細(xì)胞

胰腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDA）是一種致死性疾病，5年生存率低，缺乏有效的靶向治療方案是其主要原因[25]。盡管從PDA基因組測(cè)序中收集了大量的遺傳知識(shí)，但目前尚無(wú)美國(guó)食品藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的靶向治療PDA特定遺傳變異的有效方案。有研究證明，PDA細(xì)胞中RNA結(jié)合蛋白Hur的沉默會(huì)使PDA細(xì)胞對(duì)某些DNA損傷劑敏感，而Hur的過(guò)表達(dá)會(huì)引起抵抗，這與Hur對(duì)Wee1表達(dá)的快速上調(diào)有關(guān)[38]。當(dāng)DNA出現(xiàn)損傷時(shí)，Hur對(duì)Wee1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用是通過(guò)促進(jìn)CDK1的磷酸化從而激活G2/M期檢查點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的。這種新的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制支持PDA的耐藥表型，并證明Wee1的快速翻譯可防止PDA細(xì)胞發(fā)生災(zāi)難性DNA損傷[38-39]。Kausar等[40]研究發(fā)現(xiàn)，MK-1775可使同源重組（homologous recombination，HR）功能正常的PDA細(xì)胞對(duì)吉西他濱化療敏感，盡管Wee1的抑制機(jī)制與G2/M期檢查點(diǎn)的取消有關(guān)，但此種機(jī)制可能不足以使HR功能正常的PDA細(xì)胞致敏。相反，根據(jù)研究結(jié)果更支持這樣的假設(shè)，即Wee1的抑制對(duì)化療的敏感性與HR的抑制有關(guān)，持續(xù)的輻射能夠使DNA發(fā)生損傷。因此，抑制HR的修復(fù)是MK-1775治療胰腺癌的一個(gè)重要作用機(jī)制，推斷MK-1775與化療聯(lián)合治療胰腺癌可能有效。

4 小結(jié)與展望

MK-1775在多種惡性腫瘤細(xì)胞中具有細(xì)胞毒性，其機(jī)制是由于DNA復(fù)制過(guò)程中DNA損傷后未及時(shí)修復(fù)而提前進(jìn)入分裂期從而引起腫瘤細(xì)胞凋亡。MK-1775對(duì)Wee1的化學(xué)抑制作用可以加強(qiáng)各種DNA損傷劑的細(xì)胞毒性，并且在p53缺失的惡性腫瘤中表現(xiàn)得更加明顯，亦支撐了G1檢查點(diǎn)缺陷時(shí)腫瘤在很大程度上依賴G2檢查點(diǎn)逃避有絲分裂的致命性的觀點(diǎn)[41]。MK-1775單一用藥或與其他化療藥物聯(lián)合使用對(duì)多數(shù)惡性腫瘤均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。然而，目前仍存在一些問(wèn)題，如當(dāng)Wee1抑制劑與DNA損傷藥物聯(lián)合使用時(shí)，Wee1的表達(dá)水平在聯(lián)合用藥的過(guò)程中是否能夠保持穩(wěn)定；MK-1775的療效是否與其他分子環(huán)境等有關(guān)。因此，未來(lái)的研究需要確定細(xì)胞周期檢查點(diǎn)、DNA損傷修復(fù)和DNA復(fù)制對(duì)Wee1抑制劑單獨(dú)用藥或與其他藥物聯(lián)合治療腫瘤時(shí)的作用。