韋 超 李冬華* 錢睿亞 劉 宇 王文娜 邱甜甜 任 慧

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦四病房，北京 100026)

子宮肌瘤是一種常見的良性婦科腫瘤，多發(fā)生在育齡期女性，與雌激素濃度密切相關(guān)[1-3]。本病發(fā)病率高，大多數(shù)患者臨床癥狀不明顯，一般隨著年齡增長(zhǎng)，雌孕激素濃度的下降，可自行萎縮，但有部分患者子宮肌瘤過(guò)大或者生長(zhǎng)過(guò)快，癥狀明顯可能出現(xiàn)經(jīng)血增多及其引起的貧血，過(guò)大的子宮肌瘤產(chǎn)生壓迫癥狀如便秘、尿潴留、腰痛，甚至流產(chǎn)，影響受孕，嚴(yán)重影響女性的正常生活[4-7]，極少數(shù)患者向惡性腫瘤轉(zhuǎn)化[8]。目前臨床上尚缺乏有效的藥物治療，一般單發(fā)性肌瘤超過(guò)5 cm或者多發(fā)出現(xiàn)明顯癥狀者建議手術(shù)治療[9-13]。

體外研究模型的發(fā)展極大地促進(jìn)了細(xì)胞代謝、增生、凋亡的研究，促進(jìn)了人們對(duì)疾病機(jī)制深入認(rèn)識(shí)和了解，很大程度地促進(jìn)了醫(yī)學(xué)的發(fā)展[14]。體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒎椒ㄊ情_展一切體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，體外模型的質(zhì)量決定了研究結(jié)果的真實(shí)性、可靠性和穩(wěn)定性，因此體外培養(yǎng)模型的建立和質(zhì)量控制對(duì)疾病的研究至關(guān)重要。原代細(xì)胞剛剛離體，組織學(xué)特性、生物學(xué)特性及遺傳特性都接近于體內(nèi)，適合藥物研究、分子機(jī)制研究、細(xì)胞分化研究等[15]。本研究基于消化法建立子宮肌瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)方法并通過(guò)系列實(shí)驗(yàn)對(duì)時(shí)間點(diǎn)探索進(jìn)行培養(yǎng)方法的優(yōu)化，為子宮肌瘤體外實(shí)驗(yàn)研究奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

I型膠原酶(美國(guó)Gibco公司)，DMEM-F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(美國(guó)Gibco公司),70 μm細(xì)胞篩(美國(guó)BD公司)，0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))-EDTA的胰酶(美國(guó)Gibco公司)，細(xì)胞爬片(美國(guó)Meilunbio公司)，山羊血清(中國(guó)碧云天公司)，Triton X-100(中國(guó)索萊寶公司)，小鼠抗人平滑肌肌動(dòng)蛋白α(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)，單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的熒光二抗(中國(guó)中山金橋公司)。

1.2 原代細(xì)胞的提取

1.2.1 組織來(lái)源

隨機(jī)選取經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院診斷子宮肌瘤且未經(jīng)藥物治療需行子宮平滑肌瘤剔除術(shù)的患者，本研究獲得所有患者知情同意并經(jīng)筆者醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，倫理審批號(hào)：IEC-B-03-V01-FJ1。經(jīng)術(shù)后病理診斷確診為子宮肌瘤，取剔除部分新鮮的腫瘤組織，迅速放入含3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青/鏈霉素不含胎牛血清的冰浴DMEM-F12培養(yǎng)基中，封閉，迅速取回。

1.2.2 細(xì)胞提取

將組織塊取出，用含1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青/鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)反復(fù)漂洗3次，剝離最外層包膜和最內(nèi)層的中心缺血區(qū)，留取中間部分，用眼科剪將組織塊剪成1 mm3的組織碎塊，按照體積比1∶10加入0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))I型膠原酶，放入37 ℃水浴，并間斷混勻，進(jìn)行組織塊消化。分別在消化4、8、12、16、20和24 h后，用70 μm的細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞，將過(guò)濾出的細(xì)胞懸液1 200 r/min離心10 min。棄上清，加入完全培養(yǎng)基[包含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS和1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青/鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基]，吹打混勻細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入5%(體積分?jǐn)?shù))CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%融合，用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))-EDTA的胰酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.3 α-SMA免疫熒光細(xì)胞鑒定

將培養(yǎng)到第 4代狀態(tài)穩(wěn)定后的子宮平滑肌瘤細(xì)胞，用含DMEM-F12完全培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，接種于放置細(xì)胞爬片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放入5%(體積分?jǐn)?shù))CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；細(xì)胞貼壁后，加入完全培養(yǎng)基1 mL繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)板 PBS 漂洗3次，每次3 min。用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛室溫固定20 min，PBS 漂洗3次，每次3 min。0.3%(體積分?jǐn)?shù)) Triton X-100 室溫下破膜20 min，PBS漂洗3次。用10%(體積分?jǐn)?shù))山羊血清的PBS，37 ℃封閉30 min；10%(體積分?jǐn)?shù))山羊血清稀釋的一抗α-SMA抗體(1∶200)放置4 ℃孵育過(guò)夜；37 ℃復(fù)溫30 min，用PBS漂洗3次，每次5 min；加入10%(體積分?jǐn)?shù))山羊血清稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗鼠(1∶200)，37 ℃避光孵育1 h，PBS 漂洗3次，每次5 min；向細(xì)胞爬片上滴加50 μL DAPI 染核5 min，PBS漂洗3次，每次5 min；用抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)48 h鏡下細(xì)胞密度和狀態(tài)

膠原酶消化組織塊4、8、12、16、20和24 h分別37 ℃ 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2，95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察拍照細(xì)胞密度和狀態(tài)。在膠原酶消化組織塊4h，細(xì)胞密度較低，隨著時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞密度增加，消化16 h細(xì)胞密度最大，之后20 h和24 h細(xì)胞密度下降。如圖顯示以I型膠原酶消化16 h獲取的細(xì)胞數(shù)目最多。培養(yǎng)48 h細(xì)胞可見：細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)，基本形態(tài)呈梭形或分枝狀(圖1)。

圖1 組織消化不同時(shí)間點(diǎn)提取的原代子宮平滑肌瘤細(xì)胞(10×)Fig.1 Primary uterine leiomyoma cells extracted at different time points with tissue digestion methods

2.2 培養(yǎng)7 d鏡下細(xì)胞密度和狀態(tài)

光學(xué)顯微鏡下觀察，可以看到高密度細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)7 d，細(xì)胞基本均勻平鋪鋪滿，細(xì)胞排列規(guī)整緊密，條束狀；低密度細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，7 d可見細(xì)胞分枝狀、不規(guī)則狀，細(xì)胞空間充足，單個(gè)細(xì)胞伸展體積大，胞質(zhì)豐富(圖2)。

圖2 不同密度肌瘤細(xì)胞培養(yǎng)7 d形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of HuLM cells with different densities cultured for 7 daysHuLM： human uterus leiomyoma.

2.3 培養(yǎng)12 d鏡下細(xì)胞密度和狀態(tài)

光鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到完全融合后，細(xì)胞未表現(xiàn)出顯著的接觸抑制，表現(xiàn)為規(guī)則呈簇的平鋪疊層束狀生長(zhǎng)，部分細(xì)胞單層排列，部分細(xì)胞多層重疊呈整齊的束狀帶排列，整體上表現(xiàn)出典型的峰谷狀。作為良性腫瘤，細(xì)胞接觸抑制不顯著，當(dāng)細(xì)胞鋪滿后，營(yíng)養(yǎng)成分的匱乏，單層細(xì)胞區(qū)首先出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制，多層細(xì)胞束狀帶繼續(xù)維持束狀生長(zhǎng)，這與子宮肌瘤體內(nèi)生長(zhǎng)特性及其類似(圖3)。

圖3 培養(yǎng)12 d細(xì)胞形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of HuLM cells with different densities cultured for 12 daysHuLM： human uterus leiomyoma.

2.4 免疫熒光α-SMA細(xì)胞鑒定

高倍鏡和低倍鏡下均觀察到所有細(xì)胞的DAPI染細(xì)胞核和α-SMA染色細(xì)胞能全部擬合，所有的細(xì)胞均為子宮平滑肌瘤細(xì)胞(圖4)。

圖4 光學(xué)顯微鏡下免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞α-SMA表達(dá)Fig.4 Detection of α-SMA expression in HuLM cells by immunofluorescenceα-SMA： alpha-smooth muscle actin;HuLM： human uterus leiomyoma.

3 討論

醫(yī)學(xué)研究中很多至關(guān)重要的實(shí)驗(yàn)無(wú)法在人體內(nèi)進(jìn)行，體外原代細(xì)胞培養(yǎng)彌補(bǔ)了這一缺陷。子宮肌瘤是單克隆腫瘤，取材來(lái)自單發(fā)的肌瘤組織，獲取的原代子宮肌瘤細(xì)胞，成分單一，離體時(shí)間短，具備體內(nèi)生理狀態(tài)下細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，體外培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，消除了神經(jīng)、體液及激素等因素的影響等優(yōu)點(diǎn)，因此獲取子宮肌瘤原代細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，在研究子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制、新藥研發(fā)及藥物作用機(jī)制等方面都有很好的應(yīng)用價(jià)值[16]。

子宮平滑肌瘤原代細(xì)胞存在培養(yǎng)和純化困難等問(wèn)題，影響子宮平滑肌瘤體外實(shí)驗(yàn)研究。研究[17-18]顯示，子宮肌瘤細(xì)胞的原代細(xì)胞的常用的獲取方法有組織塊貼壁法和消化法，采用組織塊貼壁法，需要1個(gè)月長(zhǎng)出第一代，存在耗時(shí)長(zhǎng)，污染風(fēng)險(xiǎn)大等問(wèn)題，不能滿足實(shí)驗(yàn)基本需求，本研究未涉及。膠原酶消化法周期短，獲取細(xì)胞數(shù)目多，本研究針對(duì)消化法進(jìn)行原代細(xì)胞獲取方法的實(shí)驗(yàn)探索。消化法獲取細(xì)胞的關(guān)鍵是膠原酶的消化時(shí)間，常用Ⅰ型膠原酶或Ⅱ型膠原酶消化4、6、13 h不等[19-21]。本研究采用Ⅰ型膠原酶對(duì)子宮肌瘤組織的消化時(shí)間進(jìn)行了系列實(shí)驗(yàn)對(duì)子宮肌瘤的細(xì)胞獲取的消化條件，最佳消化時(shí)間進(jìn)行探索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在消化的2 h內(nèi)未取到細(xì)胞，在4 h內(nèi)獲取少量的子宮平滑肌瘤細(xì)胞，并且含有很多未消化完全的絮狀物，隨著消化時(shí)間延長(zhǎng)獲取的細(xì)胞數(shù)增多，至16 h膠原酶消化的組織懸液，未見黏有絮狀物，獲取的細(xì)胞數(shù)達(dá)到最多，在消化20 h和24 h，獲取細(xì)胞數(shù)明顯減少，可能是由于膠原酶對(duì)細(xì)胞的消化損害，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目減少。由此，可得出結(jié)論，用0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Ⅰ型膠原酶對(duì)子宮平滑肌瘤組織消化，在組織和膠原酶體積比1∶10情況下，獲取原代子宮肌瘤細(xì)胞的最佳消化時(shí)間是16 h。

原代細(xì)胞源自剛剛離體的組織，由于機(jī)體組織的復(fù)雜性，提取的細(xì)胞往往含有組織纖維結(jié)構(gòu)、血管等成分，原代細(xì)胞的純化是一大挑戰(zhàn)。只有細(xì)胞純度達(dá)到95%以上才能保證細(xì)胞穩(wěn)定傳代、生物學(xué)特性穩(wěn)定性、實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性，才能進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究[18]。本研究用肌瘤組織提取細(xì)胞中含雜細(xì)胞較多，可能混合血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血細(xì)胞等，血細(xì)胞不貼壁，內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))EDTA的胰酶很容易消化下來(lái)，肌瘤細(xì)胞貼壁牢固，消化時(shí)間長(zhǎng)3～5 min，早期消化下來(lái)的細(xì)胞受到胰酶的損害，細(xì)胞狀態(tài)差，經(jīng)反復(fù)傳代培養(yǎng)，子宮肌瘤細(xì)胞得到純化。子宮肌瘤細(xì)胞屬于平滑肌細(xì)胞，能特異性表達(dá)α-SMA[22]，本研究采用抗平滑肌細(xì)胞特異性抗體抗α-SMA抗體，用免疫熒光技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞鑒定，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)獲取的子宮肌瘤細(xì)胞純度高達(dá)到95%以上，幾乎不含雜細(xì)胞，滿足實(shí)驗(yàn)要求及后續(xù)研究的應(yīng)用，說(shuō)明采用差速消化法可將雜細(xì)胞去除。

體外實(shí)驗(yàn)需要在適宜的環(huán)境生長(zhǎng)，本身受到各種不同于體內(nèi)因素的干擾。作為原代細(xì)胞，由于其體外培養(yǎng)有自身的局限性而且隨著傳代時(shí)間延續(xù)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性可能發(fā)生變化[23]，而細(xì)胞研究對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的狀態(tài)和穩(wěn)定性有很高的要求，在細(xì)胞最佳狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)研究才有意義。細(xì)胞狀態(tài)和生長(zhǎng)周期密切相關(guān)，鑒于良性腫瘤和惡性腫瘤的顯著差異，及原代細(xì)胞和細(xì)胞系的顯著區(qū)別，本研究針對(duì)原代良性腫瘤細(xì)胞的獲取方法進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)這一優(yōu)化方法培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間細(xì)胞狀態(tài)和形態(tài)學(xué)特征分析，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的繼續(xù)培養(yǎng)提供參考依據(jù)。

關(guān)于子宮肌瘤原代培養(yǎng)的文獻(xiàn)[20-23]報(bào)道很多，但如何獲得數(shù)量多、純度高的子宮肌瘤細(xì)胞仍是關(guān)鍵問(wèn)題。本研究經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)、觀察，對(duì)人子宮肌瘤原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)的方法進(jìn)行了探索，總結(jié)出一種穩(wěn)定可靠的子宮肌瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)方法。通過(guò)對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法探索，優(yōu)化了子宮肌瘤原代細(xì)胞的培養(yǎng)和純化方法，培養(yǎng)出數(shù)量多、純度高的子宮肌瘤細(xì)胞，并對(duì)細(xì)胞不同狀態(tài)的形態(tài)特征進(jìn)行描述，為子宮肌瘤細(xì)胞進(jìn)一步研究提供了實(shí)用的實(shí)驗(yàn)方法和可靠的參考依據(jù)。