張艷彥，晁 珂，金文龍

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科,吉林 延吉133000)

有研究表明，高膽固醇血癥、冠心病、2型糖尿病患者血清LR11水平增加，與糖代謝紊亂的生化指標(biāo)(空腹血糖、HbA1c)及動脈粥樣硬化危險因素(年齡、LDL-C、頸動脈IMT)相關(guān)[1-5]，在動脈粥樣硬化動物模型的動脈斑塊內(nèi)膜平滑肌細胞中的表達增高[6]。一些流行病學(xué)、血清學(xué)、組織病理學(xué)及臨床研究等提示幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori,HP)感染與動脈硬化相關(guān)[7]，亦有研究認為兩者不相關(guān)[8]。本實驗探討幽門螺桿菌外膜泡對2型糖尿病患者大動脈內(nèi)皮細胞的LR11及動脈硬化危險因子表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 HP培養(yǎng)和HP-OMVs的提取

從哥倫比亞-腦心浸液固體培養(yǎng)基挑取單克隆幽門螺桿菌菌株(美國ATCC43504)活化制備種子液，并擴大培養(yǎng)(5% O2、10% CO2和85% N2；37℃、120 rpm)，培養(yǎng)4天待菌液OD600≈1時，收集菌液，10 000 rpm離心收集上清，用0.45 μm濾頭過濾去除雜質(zhì)，用胞外囊泡分離試劑盒(exoEasy Maxi Kit，Qiagen，76064)收集胞外囊泡，-20℃保存?zhèn)溆谩?0 μl胞外囊泡液滴加到200目銅網(wǎng)表面，3-5 min后吸干殘余液體，再滴加20 μl 4%戊二醛溶液在室溫固定3-5 min，再用濾紙吸干殘余液體，用生理鹽水洗滌1次，室溫晾干，再滴加20 μl 2%磷鎢酸鈉，室溫染色3-5 min，吸干殘余液體，用生理鹽水洗滌1次，最后在電鏡下觀察HP-OMVs呈圓泡形，大小各異，直徑在50-200 nm之間(圖1)。囊泡濃度：采用BCA法(碧云天，試劑盒由中國上海Beyotime Biotechnology提供)檢測囊泡蛋白濃度。

圖1 HP-OMVs電鏡觀察

1.2 細胞培養(yǎng)

D-HAEC原代細胞株購自美國Lonza公司，進行復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代。實驗中使用第4代細胞、美國Thermo Fisher Scientific細胞培養(yǎng)箱(5%CO2、37℃)及Lonza EGM-2血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(CC-3162)。

1.3 細胞增殖檢測

培養(yǎng)D-HAEC 24 h，更換90 μl EGM-2培養(yǎng)基，加入10 μl不同濃度(2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml、10 μg/ml)HP-OMVs，對照組加入等體積PBS。取出96孔板，每孔加入CCK-8試劑10 μl，37℃孵育2 h，使用CCK-8試劑盒(日本株式會社同仁化學(xué)研究所，Dojindo)，在450 nm處檢測吸光度(美國BioTek儀器有限公司Gen5酶標(biāo)儀)并計算細胞活力，實驗重復(fù)5次。

1.4 分組

實驗分為4組，C組(對照組，即Control組，無HP-OMVs和SQ22536)，HP組(有HP-OMVs，無SQ22536)，CS組(無HP-OMVs，有SQ22536)，HPS組(有HP-OMVs和SQ22536)。6孔板鋪設(shè)D-HAEC(Passage 4)，HP組和HPS組加入HP-OMVs共同培養(yǎng)24 h后，CS組和HPS組加入腺苷酸環(huán)化酶抑制劑(SQ22536)作用30 min，之后提取細胞總RNA。每組n=6。

1.5 Real-time PCR

從QIAGEN公司購買Rneasy Plus Mini Kit、QuantiNova Rev Transcription Kit、QuantiNova SYBR Green PCR Kit，培養(yǎng)D-HAEC，提取細胞總RNA，合成cDNA，實時熒光定量PCR測定LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表達水平。引物產(chǎn)品號:LR11(PPH06225A)，IL-1β(PPH00171C)，IL-6(PPH00560C)，MCP-1(PPH00192F)，TNF-α(PPH00341E)，VCAM-1(PPH00623E)。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件，進行ANOVA分析、Pearson相關(guān)分析及多元逐步回歸分析，P<0.05示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HP-OMVs促進D-HAEC的增殖

HP-OMVs(濃度2.5、5.0、7.5、10 μg/ml)與D-HAEC共同培養(yǎng)24 h，用CCK-8檢測細胞活力，隨HP-OMVs濃度的增加而D-HAEC數(shù)逐漸增多，HP-OMVs濃度7.5 μg/ml、10 μg/ml時，增殖率達125%、128%，與對照組比較有顯著性差異(圖2)。本實驗采用7.5 μg/ml濃度進行后續(xù)實驗。

圖2 CCK-8檢測細胞活力

2.2 LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表達

HP組與C組比較，HP-OMVs可顯著增高D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表達水平，當(dāng)加入腺苷酸環(huán)化酶阻滯劑(SQ22536)時，HPS組D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表達水平被顯著抑制(表1)。Pearson相關(guān)性分析(表2)示LR11與IL-1β、IL-6、VCAM-1呈顯著正相關(guān)，與TNF-α有相關(guān)趨勢，多元逐步回歸分析示LR11與IL-1β最密切相關(guān)(表3)。

表1 各組間LR11及其他動脈硬化危險因素表達水平的比較

表2 LR11與其他動脈硬化危險因素的相關(guān)性

表3 LR11與其他動脈硬化危險因素的多元逐步回歸分析

3 討論

幽門螺桿菌外膜泡分泌的細胞毒素相關(guān)基因A(CagA)和空泡毒素A(VacA)毒力非常強，可引起強烈的炎癥反應(yīng)[9]。有研究報道，HP感染與糖尿病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，引起胰島素抵抗[10]，增加炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的表達[11]，促進大血管動脈硬化發(fā)生發(fā)展[12]。本實驗研究中，HP-OMVs刺激的D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1表達水平顯著增加，多因素分析示LR11與IL-1β、IL-6、VCAM-1呈顯著正相關(guān)(r=0.967、0.733、0.683)，多元逐步回歸分析示LR11與IL-1β關(guān)系最密切(B=0.046，t=7.064，P<0.01)。并且，腺苷酸環(huán)化酶阻滯劑(SQ22536)可顯著下調(diào)HP-OMVs刺激的D-HAEC的LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1表達水平，以上研究結(jié)果示幽門螺桿菌感染可能通過調(diào)控cAMP信號通路增高LR11、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α及VCAM-1的表達水平，促進糖尿病大血管動脈硬化的發(fā)生發(fā)展，其中，IL-1β可能是影響LR11的主要因素。另外，有研究報道LR11可調(diào)控血管平滑肌細胞的增值、遷移，在本研究中觀察到HP-OMVs與2型糖尿病患者大動脈內(nèi)皮細胞共同培養(yǎng)時促進細胞增殖，這是否與LR11調(diào)控血管平滑肌細胞增值、遷移的作用有關(guān)尚不清楚。我們的前期臨床研究結(jié)果提示血清LR11水平與2型糖尿病及頸動脈IMT相關(guān)[13-15]。幽門螺桿菌與冠心病風(fēng)險相關(guān)性薈萃分析示[16]，幽門螺桿菌可增加冠心病早期發(fā)展的風(fēng)險，尤其是在普通人群中，而其后期影響可能被其他動脈硬化相關(guān)危險因素所削弱，其中最主要的影響因素是年齡。多項HP與動脈硬化相關(guān)性研究存在著爭議的原因可能為各項研究未能分層分析年齡因素。我們的研究結(jié)果顯示HP與動脈硬化相關(guān)，因此HP的防治有可能會降低2型糖尿病患者大血管動脈硬化發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險。