李 清 張紅星 張勵(lì)才 周 芳

（1 徐州醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，徐州 221004；2 江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，徐州 221004）

國際疼痛學(xué)會(huì)將神經(jīng)病理性疼痛定義為由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病引起的慢性疼痛，常表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺過敏等臨床癥狀[1]。研究報(bào)道神經(jīng)病理性疼痛在人群中的患病率約為7%～10%，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前的治療手段包括藥物及神經(jīng)阻滯等治療效果有限，為病人及社會(huì)帶來較大的負(fù)擔(dān)[2]，因此探索新的、更有效的分子及藥物治療靶點(diǎn)具有臨床意義。

組蛋白去乙?；?(histone deacetylases, HDACs)是一類蛋白酶，基于序列同源性被分為4 類，其中組蛋白去乙?；? (histone deacetylase 6, HDAC6) 是II 類中的一員。與HDACs 中其他成員不同，HDAC6主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，在結(jié)構(gòu)和功能上均具有獨(dú)特性，其具有兩個(gè)催化脫乙酰酶結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)鋅指泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域[3]，且在細(xì)胞質(zhì)中與多種非組蛋白底物結(jié)合，如α-微管蛋白、泛素、熱休克蛋白90 (HSP90)等，從而對(duì)其進(jìn)行調(diào)控[4]。HDAC6 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了其能參與調(diào)節(jié)許多重要的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞生長、代謝、遷移、氧化緩沖能力，錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解以及免疫突觸形成等[5]。所以HDAC6 成為神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)變性之間維持平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，后又發(fā)現(xiàn)HDAC6 參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控[6,7]。這為本研究神經(jīng)病理性疼痛提供了分子基礎(chǔ)。觸液核 (cerebrospinal fluid-contacting nucleus, CSF-contacting nucleus) 是張勵(lì)才等[8]以霍亂毒素亞單位B 結(jié)合辣根過氧化酶復(fù)合物 (horseradish peroxidase-conjugated toxin subunit B, CB-HRP) 作為示蹤劑，通過側(cè)腦室引入，在國際上首次發(fā)現(xiàn)并命名的腦內(nèi)特殊神經(jīng)核團(tuán)。既往研究表明觸液核有多種神經(jīng)活性物質(zhì)表達(dá)，且參與神經(jīng)病理性疼痛等生命活動(dòng)的調(diào)控[9～12]。但HDAC6 是否在觸液核這一新的核團(tuán)中表達(dá)，以及是否參與觸液核介導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛還未見研究報(bào)道。因此，本研究將采用免疫熒光技術(shù)結(jié)合行為藥理學(xué)方法探討HDAC6 在觸液核中的表達(dá)以及觸液核HDAC6 在大鼠神經(jīng)病理性疼痛中的作用。

方 法

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠48 只，體重240～290 g，由山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（魯）20140007。將大鼠置于12 h/12 h光照/黑暗交替、22～24℃的安靜環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

分組：①為了觀察正常及神經(jīng)病理性疼痛大鼠觸液核中HDAC6 的表達(dá)情況，將大鼠分為：Normal組、Sham 組和CCI組(n = 6)；②關(guān)于Tubastatin A拮抗HDAC6 對(duì)大鼠痛閾影響的研究，將大鼠分為：Vehicle 組和Tubastatin A 組(n = 6)；③為了觀察觸液核HDAC6過表達(dá)對(duì)大鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響，將大鼠分為：Sham + CMV-MCS 組、CCI + CMVMCS 組以及CCI + CMV-HDAC6 組(n = 6)。

2. 實(shí)驗(yàn)試劑

CB-HRP（Sigma, 美國）；羊抗CB 一抗（Abcam, 英國）；HDAC6 小鼠多克隆抗體一抗（Thermo, 美國）；驢抗羊AlexaFluor546 二抗（Life Technologies, 美國）；驢抗小鼠AlexaFluor488 二抗（Life Technologies, 美國）；Tubastatin A（Selleck, 中國）；對(duì)照病毒pAAV-CMV-MCS-3FLAG-CW3SL（和元生物，中國）；HDAC6 過表達(dá)病毒pAAV-CMVHDAC6-3FLAG-CW3SL（和元生物，中國）。

3. 實(shí)驗(yàn)方法

（1）慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎 (chronic constriction injury, CCI) 模型建立：參考Bennett 等[13]的方法，雄性SD大鼠稱重，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛 (300 mg/kg)，選取大鼠左后肢，于后外側(cè)行切口，在股骨后游離坐骨神經(jīng)主干，用4-0 絲線做4 道環(huán)形結(jié)扎，各絲線間相距約1 mm，結(jié)扎強(qiáng)度以大腿肌肉或足趾產(chǎn)生輕微收縮為宜，隨后消毒，縫合傷口。假手術(shù)組僅對(duì)大鼠進(jìn)行坐骨神經(jīng)分離，不進(jìn)行結(jié)扎，其余步驟均相同。

（2）側(cè)腦室給藥：SD 大鼠稱重，腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)進(jìn)行麻醉。待麻醉后將大鼠固定于腦立體定位儀上，頭頂部備皮、消毒，于頭頂部皮膚做正中切口，暴露前囟點(diǎn)，參照Paxinos 腦圖譜[14]確定側(cè)腦室位置：Bregma:1.2±0.4 mm, Right to median sagittal plane: 1.4±0.2 mm, Depth: 3.2±0.4 mm。用微量注射器抽取藥液進(jìn)行緩慢注射，注射完畢留針5 min，隨后消毒，縫合傷口，放回籠中待清醒。HDAC6 拮抗劑Tubastatin A 的注射，按1 mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)稱取相應(yīng)劑量的Tubastatin A 粉末，先用4%的DMSO對(duì)其進(jìn)行溶解，然后加入30%的PEG 300，最后加入67%的雙蒸水，混勻。在注射Tubastatin A 的前1 天按上述方法在側(cè)腦室位置鉆一小孔，傷口不予縫合，并用紅霉素軟膏覆蓋傷口，第2 天注射時(shí)用七氟烷維持大鼠麻醉，進(jìn)行藥物注射。待1 h后進(jìn)行行為學(xué)測量。

（3）組織制備及免疫熒光：大鼠于側(cè)腦室注射30%CB-HRP 后48 h，進(jìn)行腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，經(jīng)升主動(dòng)脈灌注行組織固定。首先使用300 ml 生理鹽水進(jìn)行快速灌注，以快速?zèng)_凈動(dòng)物體內(nèi)血液。接著灌注4%多聚甲醛300 ml 進(jìn)行組織的前固定，前100 ml 快速灌注，后200 ml 慢滴。灌注結(jié)束后取觸液核所在節(jié)段腦組織，于4%多聚甲醛4℃冰箱內(nèi)后固定4～6 h，后換入30%蔗糖溶液脫水。待組織沉底，取組織進(jìn)行冰凍切片，片厚30 μm，組織切片用0.01 M PBS 溶液漂洗3 遍，每遍5 min。加入10%驢血清室溫封閉3.5 h，接著混合加入小鼠源HDAC6 一抗(1:400)和羊源CB 一抗(1:600)，4℃環(huán)境孵育過夜。第2 天用0.01 M PBS 溶液將組織切片漂洗3 遍后，加入驢抗小鼠Alexa Fluor 488 (1:800)和驢抗羊Alexa Fluor 546 二抗(1:500)，避光室溫下敷育1.5 h。然后0.01 M PBS溶液充分漂洗，貼片，封片。用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍片。

（4）機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)測定：參照Up-down 法[15]進(jìn)行測量。將大鼠放置于金屬測試架上，并用透明隔板將大鼠隔開。測試前大鼠需適應(yīng)環(huán)境30 min，待大鼠探查等其他活動(dòng)基本消失后，開始測量。采用von Frey細(xì)絲刺激大鼠足底，逐漸加壓使細(xì)絲彎曲呈90 度，維持刺激時(shí)間5 s，若大鼠出現(xiàn)抬足或舔舐足底行為，則記為陽性反應(yīng)。連續(xù)刺激時(shí)，測量間隔為5 min。

（5）熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)測定：按Hargreaves 等[16]的方法進(jìn)行測量。將待測大鼠放置于測試架上，使其適應(yīng)環(huán)境30 min，待充分適應(yīng)環(huán)境后開始測量。將已開啟的熱輻射刺激儀對(duì)準(zhǔn)大鼠左后足，當(dāng)大鼠突然抬足或舔舐足底時(shí)，計(jì)時(shí)停止。每只大鼠的左后足均進(jìn)行5 次測量，兩次測量間隔為10 min，將測量的數(shù)值進(jìn)行平均值計(jì)算。設(shè)置熱輻射刺激儀測定TWL 的上限時(shí)間為25 s，防止?fàn)C傷大鼠足底。

4. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graph Pad Prism 7.0 作圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示。行為數(shù)據(jù)的比較采用雙因素方差分析 (two-way repeated measures ANOVA)，神經(jīng)元雙標(biāo)率的比較采用單因素方差分析。以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 正常及神經(jīng)病理性疼痛大鼠觸液核HDAC6的表達(dá)情況

如圖1 所示，紅色為CB-HRP 標(biāo)記的觸液核、綠色熒光標(biāo)記的為HDAC6 陽性神經(jīng)元、黃色為CB-HRP/HDAC6 雙標(biāo)神經(jīng)元。與正常組和Sham 組相比，CCI 組大鼠觸液核CB-HRP/HDAC6 雙標(biāo)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。

2. Tubastatin A 拮抗HDAC6 對(duì)正常大鼠痛閾的影響

側(cè)腦室注射Tubastatin A 的大鼠，在1 h 后對(duì)其進(jìn)行痛閾的測量，發(fā)現(xiàn)與Vehicle 組相比，注射Tubastatin A 的大鼠MWT 和TWL 值明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)；與同組大鼠基礎(chǔ)痛閾 (baseline, BL)相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。24 h 后再次對(duì)大鼠進(jìn)行痛閾測量，發(fā)現(xiàn)降低的痛閾基本恢復(fù)至正常水平（見圖2）。

3. 觸液核HDAC6 過表達(dá)對(duì)大鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響

將大鼠隨機(jī)分為Sham + CMV-MCS 組、CCI + CMV-MCS 組以及CCI + CMV-HDAC6 組。3 組大鼠分別對(duì)應(yīng)于側(cè)腦室注射HDAC6 過表達(dá)病毒及對(duì)照病毒。并在病毒表達(dá)2 周后對(duì)CCI + CMV-MCS組和CCI + CMV-HDAC6 組大鼠進(jìn)行CCI 造模，于病毒表達(dá)3 周，即CCI 術(shù)后1 周痛閾最低時(shí)，對(duì)大鼠進(jìn)行痛閾測量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Sham + CMV-MCS組大鼠相比，CCI + CMV-MCS 組大鼠痛閾明顯降低(P < 0.05)，而觸液核HDAC6 過表達(dá)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠疼痛狀況得到明顯改善（見圖3）。

討 論

本研究利用CCI 模型模擬神經(jīng)病理性疼痛，通過免疫熒光技術(shù)觀察到正常大鼠即有HDAC6 的表達(dá)，且在神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下，觸液核HDAC6表達(dá)明顯減少。與此一致的是，拮抗觸液核HDAC6，CCI 大鼠的痛閾明顯降低。以往關(guān)于觸液核參與神經(jīng)病理性疼痛的研究中，CCI 模型引起的神經(jīng)病理性疼痛在術(shù)后1 周痛閾達(dá)到最低[9,10,12]，因此在觸液核過表達(dá)HADC6 的情況下，選擇CCI 術(shù)后1 周對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)觸液核過表達(dá)HDAC6 能夠改善神經(jīng)病理性疼痛。

既往關(guān)于HDAC6 的研究多集中于其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，只有少量HDAC6 與神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)的研究。Krukowski 和Van 等[6,7]發(fā)現(xiàn)通過拮抗HDAC6 能夠改善化療藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛。在Krukowski 和Van 等的實(shí)驗(yàn)中，腫瘤化療藥物會(huì)破壞神經(jīng)元的軸突運(yùn)輸和微管動(dòng)力學(xué)，從而導(dǎo)致化療藥物的神經(jīng)毒性，出現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛。而α-微管蛋白的乙酰化修飾是調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突運(yùn)輸和微管動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵機(jī)制之一。與其他HDACs 相比，HDAC6 對(duì)包括α-微管蛋白在內(nèi)的非組蛋白具有特異性，是調(diào)節(jié)α-微管蛋白乙?；降闹匾竅17]。因此通過抑制HDAC6，能夠增加外周神經(jīng)中的α-微管蛋白乙?；絒18]，從而增加神經(jīng)元軸突的運(yùn)輸能力，提高微管穩(wěn)定性，改善化療藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛。而這與Zerong 等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相矛盾，Zerong 等[19]發(fā)現(xiàn)在HDAC6 表達(dá)明顯減少、α-微管蛋白高度乙酰化、微管穩(wěn)定性得到提高的情況下，神經(jīng)病理性疼痛大鼠疼痛閾值明顯降低。這可能是由于兩者所涉及的神經(jīng)病理性疼痛模型不同，不同的動(dòng)物模型其疼痛特點(diǎn)及所涉及的機(jī)制側(cè)重點(diǎn)有所不同[20]，Krukowski 和Van 等研究的是化療藥物誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛，而Zerong 等使用的是坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型。

圖1 正常大鼠及神經(jīng)病理性疼痛大鼠觸液核HDAC6 的表達(dá)(n = 6, ±SD)(A1, A2, A3) CB-HRP 標(biāo)記的觸液核（紅色）；(B1, B2, B3) HDAC6 陽性神經(jīng)元（綠色）；(C1, C2, C3)兩者雙標(biāo)神經(jīng)元（黃色） 標(biāo)尺 = 50 μm；(D) 三組大鼠觸液核HDAC6 雙標(biāo)陽性率比較**P < 0.01，與CCI 組相比Fig. 1 The expression of HDAC6 in the CSF-contacting nucleus of normal and neuropathic pain rats (n = 6, ±SD)(A1, A2, A3) The CSF-contacting nucleus (red); (B1, B2, B3) HDAC6+cells (green); (C1, C2, C3) double-labeling (yellow). Scale bar = 50 μm; (D) Comparison on the rates of co-staining positive neurons in the CSF-contacting nucleus of three groups of rats.**P < 0.01, compared with the group CCI.

圖2 HDAC6 拮抗劑Tubastatin A 對(duì)正常大鼠痛閾的影響(n = 6, ±SD)(A) Tubastatin A 對(duì)大鼠MWT 的影響；(B) Tubastatin A 對(duì)大鼠TWL 的影響*P < 0.05, 與Vehicle 組相比；#P < 0.05, 與Tubastatin A 組BL 時(shí)間點(diǎn)相比Fig. 2 Effects of HDAC6 antagonist Tubasatin A on pain threshold in rats (n = 6, ±SD)(A) Effect of Tubastatin A on MWT in rats; (B) Effect of Tubastatin A on TWL in rats. *P < 0.05, compared to the group Vehicle; #P < 0.05, compared to the BL time point of Tubastatin group A.

圖3 觸液核HDAC6 過表達(dá)對(duì)大鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響 (n = 6, ±SD)(A1, A2, A3) CB-HRP 標(biāo)記的觸液核（紅色）；(B1, B2, B3) HDAC6 陽性神經(jīng)元（綠色）；(C1, C2, C3)兩者雙標(biāo)神經(jīng)元（黃色） 標(biāo)尺 = 100 μm；(D)各組大鼠術(shù)前及CCI 術(shù)后1 周MWT 比較；(E)各組大鼠術(shù)前及CCI 術(shù)后1周TWL 比較***P < 0.001, 與Sham + CMV-MCS 組相比；#P < 0.05，##P < 0.01，與CCI + CMV-MCS 組相比Fig. 3 The effect of HDAC6 overexpression in the CSF-contacting nucleus on the neuropathic pain rats (n = 6, ±SD)(A1, A2, A3) The CSF-contacting nucleus (red); (B1, B2, B3) HDAC6+ cells (green); (C1, C2, C3) double-labeling (yellow). Scale bar = 100 μm; (D) Comparison of the MWT of rats in each group before surgery and one week after CCI; (E) Comparison of the TWL of rats in each group before surgery and one week after CCI.***P < 0.001, compared with the group Sham + CMV-MCS；#P < 0.05, ##P < 0.01, compared with the group CCI + CMVMCS.

觸液核是一類胞體位于腦實(shí)質(zhì)，而突起跨過室管膜屏障伸向腦脊液中的特殊核團(tuán)。它不僅與腦脊液有聯(lián)系，而且與其他非觸液神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、血管等之間也存在聯(lián)系。因此，觸液核可能在神經(jīng)、體液兩大調(diào)節(jié)功能中發(fā)揮重要作用。通過CBHRP 逆行示蹤結(jié)合免疫熒光技術(shù)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種神經(jīng)活性物質(zhì)在觸液核均有表達(dá)，且部分參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控[9～12,21～23]。本研究通過側(cè)腦室注射CB-HRP 并采用免疫熒光技術(shù)觀察大鼠觸液核中HDAC6 的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常大鼠觸液核即有HDAC6 的表達(dá)，且在神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下，大鼠觸液核中HDAC6 的表達(dá)明顯減少。這提示觸液核HDAC6 可能在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮作用，為研究神經(jīng)病理性疼痛提供了新的分子基礎(chǔ)。

綜上所述，觸液核表達(dá)HDAC6，且參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控。這為研究神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制提供了新的分子基礎(chǔ)，為臨床治療神經(jīng)病理性疼痛提供了新的藥物靶點(diǎn)。但考慮到神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制的復(fù)雜性以及觸液核的結(jié)構(gòu)特殊性，因此還需要更進(jìn)一步的研究。