王 景 曹廣超 蔣光慧 于啟東 李曉云 胡小紅

(臨沂市婦女兒童醫(yī)院藥劑科，臨沂 276000)

蛇床子歸腎經(jīng)，有溫腎壯陽、散寒祛風、燥濕殺蟲之功效，臨床主治男性陽痿、女性滴蟲性陰道炎、陰道瘙癢、外陰濕疹等。蛇床子素(osthole，OST)又名甲氧基歐芹酚，在蛇床子果實中含量約為1%，現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，OST具有多種藥理作用，如增強免疫、抗炎、心血管保護、抗骨質(zhì)疏松、鎮(zhèn)靜、抗肝炎和抗脂肪肝等。研究表明，OST還顯示出較強的抗腫瘤活性，但關(guān)于其對宮頸癌抑制作用的報道較少[1，2]。本實驗研究OST對人宮頸癌Hela-S3 細胞的體外作用效果，進一步闡述其誘導腫瘤細胞凋亡的可能分子機制，以期為其臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 人宮頸癌 Hela-S3 細胞株為哈爾濱醫(yī)科大學贈送；OST(質(zhì)量分數(shù)≥98%)、胰蛋白酶(Sigma 公司)；胎牛血清(杭州四季青)；MTT試劑(Gibco 公司)；BCA蛋白檢測試劑盒、ECL化學發(fā)光顯示液(美國Thermo Pierce)；LEHD-pDNA及 DEVD-pDNA底物(美國Biomol)；AO/PI(日本TaKaRa)；Bradford 蛋白定量試劑盒(南京建成生物)；PARP、Bcl-2、Survivin、Bax、Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3單克隆抗體(美國Santa Cruz)；細胞周期檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)；酶標儀(美國Bio-Rad)；流式細胞儀(美國BD)；免疫印跡成像系統(tǒng)(美國Carestrean)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組 Hela-S3 細胞接種于RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素和300 mg/L谷氨酰胺)，37℃、5% CO2傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗；對照組不加OST，OST各組按照實驗要求加入不同濃度OST。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖 收集對數(shù)生長期 Hela-S3 細胞，調(diào)整細胞濃度為1×104個/ml，接種于96孔板，37℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度OST(0、20、40、80、120、160、200、240 μg/ml)，各濃度設(shè) 6 個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng) 24、48 h后，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT 溶液，培養(yǎng)4 h后棄上清，加入DMSO 100 μl充分溶解，酶標儀檢測570 nm處吸光度。抑制率(%)=(1-A蛇床子素組平均值/A對照組平均值)×100%。

1.2.3DAPI染色觀察細胞凋亡 取對數(shù)生長期Hela-S3細胞，調(diào)整細胞密度為5×104個/ml，接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后加入含OST(0、80、120、160 μg/ml)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS 洗滌2次，無水甲醇固定30 min。去除甲醇后，PBS 洗滌2次，固定的細胞采用1 μg/ml DAPI室溫避光反應30 min，PBS洗滌 2 次，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4AO/PI檢測細胞凋亡 收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞濃度為2×104個/孔，接種于6孔板制作爬片，當細胞生長至80%單層貼壁時，分別用不同濃度OST(0、80、120、160 μg/ml)處理24 h，將蓋玻片用滅菌PBS緩沖液洗滌，避光滴加30 μl AO/PI，反扣在載玻片上，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 對數(shù)生長期Hela-S3細胞接種于 6 孔板，過夜貼壁后加入OST(120、200 μg/ml)處理48 h。胰酶消化收集細胞，PBS洗滌后用Binding buffer重懸細胞，根據(jù)試劑盒說明書操作，加入Annexin V和PI混勻，避光孵育，所有操作均在冰上完成，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。

1.2.6比色法檢測Caspase-3、Caspase-9活性 激活的Caspase-3和Caspase-9可分別酶解特異性底物LEHD-pDNA及DEVD-pDNA。分別將對照組和OST組(80、120 μg/ml)細胞用Lysis buffer稀釋至4×106個，重懸，冰上裂解10 min，4℃離心得到富含蛋白質(zhì)的上清。于96孔板中加入Reaction buffer，及上清50 μl，按照Bradford試劑盒說明書操作，于酶標儀 405 nm處檢測吸光度。

1.2.7免疫熒光法觀察細胞ROS表達 取對數(shù)生長期Hela-S3細胞接種于6孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后棄上清，分別加入OST(0、80、120 μg/ml)處理48 h，胰酶消化后無血清培養(yǎng)基重懸，加入DCFH-DA繼續(xù)孵育2 h，PBS洗滌，熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.8Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達 Hela-S3細胞用不同濃度OST(0、80、120、160 μg/ml)處理48 h，采用RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h 后加入一抗，4℃孵育過夜，二抗常溫孵育 2 h，TBST漂洗3次，ECL顯色，暗室下曝光、拍照。

2 結(jié)果

2.1MTT法檢測OST對Hela-S3細胞增殖的影響 與對照組相比，培養(yǎng)24、48 h后，不同濃度OST(20、40、80、120、160、200、240 μg/ml)對Hela-S3細胞的增殖抑制率明顯上升，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖1。

圖1 OST對Hela-S3細胞增殖抑制率的影響Fig.1 Effect of OST on inhibition rate of proliferation of Hela-S3 cellsNote:Compared with control,*.P<0.05，**.P<0.01.

2.2DAPI染色觀察Hela-S3細胞凋亡 與對照組相比，不同濃度(80、120、160 μg/ml)OST組Hela-S3細胞核發(fā)生染色質(zhì)碎裂、核膜腫脹等明顯變化，且呈濃度依賴性，提示OST具有促凋亡效應，見圖2。

圖2 OST對Hela-S3細胞凋亡的影響(×400)Fig.2 Effect of OST on apoptosis of Hela-S3 cells(×400)

2.3AO/PI檢測細胞凋亡 對照組細胞多數(shù)呈綠色熒光，而經(jīng)不同濃度(80、120、160 μg/ml)OST處理后，部分細胞呈橙紅色或橙黃色熒光，且隨OST濃度升高，綠色熒光細胞數(shù)明顯減少，見圖3。

圖3 AO/PI檢測OST對Hela-S3細胞凋亡的影響(×400)Fig.3 Effect of OST on apoptosis of Hela-S3 cells detected by AO/PI(×400)

2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 對照組、OST 120、

200 μg/ml組Hela-S3細胞48 h凋亡率分別為4.15%、31.53%、53.46%，對照組與OST 120、200 μg/ml 組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 流式細胞術(shù)檢測OST對Hela-S3細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of OST on apoptosis of Hela-S3 cells detected by flow cytometry

2.5比色法檢測Caspase-3、Caspase-9相對活性 與對照組相比，不同濃度OST(120、160、200 μg/ml)組Hela-S3細胞Caspase-3、Caspase-9相對活性均明顯上升(P<0.05)，見圖5。

圖5 比色法檢測Caspase-3、Caspase-9相對活性Fig.5 Relative activities of Caspase-3,Caspase-9 detected by colorimetryNote:Compared with control,*.P<0.05.

2.6免疫熒光法檢測細胞ROS 對照組細胞多數(shù)呈綠色熒光，稍顯暗淡，經(jīng)不同濃度(80、120 μg/ml)OST處理后，細胞熒光強度逐漸升高，見圖6。

圖6 Hela-S3細胞ROS表達(×400)Fig.6 Expression of ROS in Hela-S3 cells(×400)

2.7Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達 與對照組相比，OST80、120、160 μg/ml組Bcl-2、Survivin蛋白表達下降，而Bax、 Cleaved-PARP、Cleaved-Capase-3蛋白表達上升。各組PARP蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，見圖7。

圖7 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達Fig.7 Apoptotic-related proteins expressions detected by West-ern blotNote:1.Control；2.80 μg/ml OST；3.120 μg/ml OST；4.160 μg/ml OST.Compared with control group,*.P<0.05.

3 討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，嚴重威脅女性生命健康。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年約有50萬新發(fā)病例，27萬死亡病例，其中80%發(fā)生在發(fā)展中國家[3]。盡管宮頸癌治療的手術(shù)技巧和放療技術(shù)不斷提高，但其5年生存率未見明顯提高[4]?；熢趯m頸癌治療中具有重要作用，但化療藥物靶向性較低，毒副作用及多藥耐藥問題在很大程度上制約了其化療效果，因此，尋找有效的抗腫瘤中藥成為研究熱點。

OST是來源于傘形科1年生草本植物蛇床的果實，其藥效是近年研究熱點，在骨細胞、免疫、心血管及腫瘤等方面報道較多[5-7]。本研究觀察OST對Hela-S3細胞的體外效果，發(fā)現(xiàn)OST具有抑制Hela-S3細胞增殖、促進凋亡的作用，故對其相關(guān)作用機制進行了初步探討。本研究發(fā)現(xiàn)，OST可明顯抑制Hela-S3細胞增殖，且在 20～240 μg/ml 時隨濃度增加，細胞增殖抑制率逐漸升高，呈劑量依賴性；DAPI染色結(jié)果顯示，不同濃度(80、120、160 μg/ml)OST組Hela-S3細胞核較對照組發(fā)生染色質(zhì)碎裂、核膜腫脹等明顯變化，說明OST具有促凋亡作用；AO/PI結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度(80、120、160 μg/ml)OST治療后，部分細胞呈橙紅色或橙黃色熒光，且隨OST濃度升高，綠色熒光細胞數(shù)明顯減少，與DAPI染色結(jié)果基本一致，說明OST具有促凋亡作用。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，對照組、120、200 μg/ml OST組宮頸癌細胞48 h凋亡率分別為4.15%、31.53%、53.46%，對照組與OST各組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示說明隨OST濃度升高，凋亡細胞數(shù)明顯增加。Caspase-3為凋亡執(zhí)行酶，Caspase-9為內(nèi)源性標志物[8]。本研究比色法檢測結(jié)果顯示，不同濃度OST(120、160、200 μg/ml)組Hela-S3細胞Caspase-3、Caspase-9相對活性較對照組明顯上升(P<0.05)，提示OST促凋亡作用可能與內(nèi)源性途徑有關(guān)。

ROS是一類具有比氧分子更活潑化學反應性的含氧物，是體內(nèi)重要的自由基，當機體平衡被打破時，ROS含量持續(xù)升高，促發(fā)細胞轉(zhuǎn)化、導致惡性腫瘤[9-11]。免疫熒光法檢測細胞ROS顯示，經(jīng)不同濃度(80、120 μg/ml)OST處理后，細胞熒光強度逐漸升高，說明OST可能通過誘導ROS誘導宮頸癌細胞凋亡。

細胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過作用于半胱天冬酶家族(Caspase)、抑制凋亡蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein，IAP)及Bcl-2 家族參與細胞凋亡過程。Bcl-2 和Bax基因均在細胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮重要作用[12]。其中Bcl-2為抑制凋亡蛋白，Bax為促凋亡蛋白。Western blot檢測結(jié)果顯示，80、120、160 μg/ml OST組中Bcl-2、Survivin蛋白表達較對照組下降，而Bax、Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3蛋白表達上升，說明OST對Hela細胞凋亡蛋白起重要作用，Bcl-2/Bax表達失衡可促發(fā)凋亡，上調(diào)Cleaved-Capase-3表達；Survivin 是抑制IAP家族成員，初步研究表明其具有誘導腫瘤基質(zhì)血管形成、減少對放化療敏感性、促進細胞增殖等功能[13]。同時Survivin 還可直接抑制 Caspase-3和Caspase-7等活性從而抑制細胞凋亡[14，15]。研究報道，Caspase-3 被激活生成活性片段Cleaved-Caspase-3，而Caspase-3 最主要的底物是多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)，凋亡過程中Caspase-3被活化,PARP酶被剪切失去活性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)OST可明顯抑制Survivin蛋白表達，提示OST抑制Hela細胞增殖、促進凋亡可能與抑制Survivin蛋白有關(guān)，與Survivin 蛋白促進腫瘤細胞凋亡的報道結(jié)論基本一致[17]。OST在Hela細胞中可能激活Caspase-3生成Cleaved-Caspase-3及Cleaved-PARP，進一步切割DNA，最終誘導Hela細胞凋亡。

綜上，OST具有誘導宮頸癌細胞凋亡及增殖抑制作用，此抗腫瘤效應可能與上調(diào)促凋亡蛋白表達、下調(diào)抗凋亡蛋白表達相關(guān)，對OST抗腫瘤治療研究具有一定參考價值。