黃 佳 潘 玫 汪利群 涂云霞

(江西省婦幼保健院生殖健康科，南昌 330006)

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，目前全球每年大約有47萬例宮頸癌新增病例[1]。研究數(shù)據(jù)表明，宮頸癌是導致女性死亡的主要疾病之一，目前全球每年因?qū)m頸癌失去生命的患者數(shù)超過20萬例[2,3]。隨著科技的進步，醫(yī)療水平的提升，宮頸癌的治療效果顯著改善，但死于宮頸癌轉移和復發(fā)的患者仍然較多[4]。上皮間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉移有著密切的聯(lián)系[5,6]?，F(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)，參與 EMT 過程的信號通路包括Wnt、TGF-β、notch等信號通路，其中Wnt信號通路是一條經(jīng)典的通路。Wnt信號通路可以調(diào)節(jié)宮頸癌細胞的侵襲性和轉移能力[7]。丙泊酚是一種常見的靜脈麻醉藥，多用于腫瘤切除手術前的麻醉。近年來研究表明，丙泊酚可以抑制腫瘤細胞的生長和轉移。汪威等[8]研究表明：丙泊酚可以抑制wnt/β-catenin 通路，實現(xiàn)抑制腫瘤細胞的侵襲性和轉移力。本文旨在研究丙泊酚抑制wnt/β-catenin 通路對宮頸癌HELA細胞生長和運動能力的調(diào)節(jié)作用，以期了解丙泊酚抑制wnt/β-catenin 通路對宮頸癌HELA細胞生長和運動能力的作用機理，從而為宮頸癌患者治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要細胞 宮頸癌HELA細胞購自中國科學院細胞庫。

1.1.2動物 成年雌性Wistar大鼠60只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK(京)2017-0022，普通級，分12個籠子飼養(yǎng)，每個籠子5只，于本院動物中心在15～18℃，相對濕度為35%～40%條件下飼養(yǎng)。

1.1.3主要試劑與儀器 丙泊酚(樂維靜；國藥準字H20030115)購自四川國瑞藥業(yè)有限責任公司；Caspase-3、Caspase-9、Ki67、PCNA購自Abcam公司；Annexin V-FITC、MMP-9和VEGF抗體均購自Santa Cruze Biotechnology 公司；凋亡檢測試劑盒購自杭州四季青生物工程材料有限公司；磷酸緩沖液PBS購自天津科密歐有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基購自上海博升生物；CCK 試劑盒購自上海撫生實業(yè)有限公司。低溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司；光學顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；熒光分光光度計購自上海儀電分析儀器有限公司；流式細胞儀購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2方法

1.2.1分組干預 將人宮頸癌HELA細胞分為：空白組(Control)、低劑量丙泊酚組(propofol 2.5 μg/ml)、中劑量丙泊酚組(propofol 5 μg/ml)、高劑量丙泊酚組(propofol 10 μg/ml)，分別為0、2.5、5、10 μg/ml 的丙泊酚預處理。

將60只成年雌性Wistar大鼠分為：空白組(Control)、低劑量丙泊酚組(propofol 10 mg/kg)、中劑量丙泊酚組(propofol 20 mg/kg)、高劑量丙泊酚組(propofol 50 mg/kg)，分別腹腔注射0、10、20、50 mg/kg 的丙泊酚。

1.2.2細胞培養(yǎng) 將人宮頸癌HELA細胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.3建立模型 建立宮頸癌移植瘤大鼠動物模型及判斷建模是否成功參考高巋然等[9]實驗方法。取對數(shù)生長期的宮頸癌HELA細胞，消化、離心后在大鼠皮下注射接種 2.5×1010個/ml，隔日觀察腫瘤生長情況以及大鼠的一般情況。

1.2.4CCK8檢測細胞增殖 常規(guī)培養(yǎng)宮頸癌HELA細胞，當細胞生長融合度大于80%時，使用胰蛋白酶消化后離心，PBS溶液洗滌，然后使用培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度1×104個/ml。在96孔板上，每孔加入細胞懸液90 μl，每組設4個復孔。分別加入0、2.5、5、10 μg/ml的丙泊酚。每孔加入10 μl CCK8試劑輕敲培養(yǎng)板混勻，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，取出測定其在450 nm 波長處的吸光度，并按照CCK 試劑盒說明書計算細胞增殖情況。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 恒溫離心機保持4℃，1 000 r/min離心 5 min 收集細胞；收集細胞后加入100 μl Binding Buffer重懸細胞并加入5 μl Annexin V-FITC和 5 μl PI，輕輕混勻；室溫避光孵育 15 min并加入400 μl Binding Buffer用流式細胞儀檢測。

1.2.6Transwell檢測細胞運動能力 參照Hu等[10]的Transwell研究方法。將細胞培養(yǎng)24 h后，制成無FBS懸浮液恒溫培養(yǎng)1 d后，隨機選取視野使用顯微鏡觀察細胞形態(tài)，同時統(tǒng)計細胞數(shù)量。

1.2.7大鼠模型試驗 將60只成年雌性Wistar大鼠皮下注射宮頸癌HELA細胞建立移植瘤模型，分別將低中高劑量丙泊酚10、20、50 mg/kg腹腔注射，并設置空白對照組，注射等量的生理鹽水。30 d后檢測腫瘤重量。

1.2.8Western blot 檢測蛋白表達水平 按照Western blot 檢測方法操作，蛋白質(zhì)條帶用掃描儀進行掃描，采用Imagaquent 5.1軟件對Ki67、PCNA、Caspase-3、Caspase-9、MMP-9、VEGF蛋白質(zhì)條帶灰度進行相對定量分析。以目的蛋白條帶與GAPDH灰度比值表示蛋白相對表達水平。

1.2.9免疫組化觀察 本實驗中免疫組化采用PV 法染色，將石蠟切片5 μm，常規(guī)脫蠟后使用3%過氧化氫甲醇溶液室溫浸泡15 min并使用 4%胃蛋白酶消化15 min，滴加一抗 VEGF(效價1∶50)，Ki67 (效價1∶50)置于濕盒中恒溫冰箱保存12 h，使用0.01 mol/L PBS清洗后滴加二抗葡聚糖-酶復合物，37℃孵育60 min，再次使用0.01 mol/L PBS清洗，顯色后使用蘇木素復染1 min脫水并封片。

1.3統(tǒng)計學分析 本研究采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析，方差分析使用單因素方差分析，若P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1丙泊酚對宮頸癌HELA細胞生長情況的影響 CCK8檢測結果顯示，與空白組比較，使用不同濃度丙泊酚處理24 h、48 h及72 h對宮頸癌HCLA細胞生長能力均無顯著影響(P>0.05)；使用丙泊酚處理96 h后的宮頸癌HELA細胞生長能力顯著低于空白組，且高劑量丙泊酚組宮頸癌HELA細胞生長能力顯著低于中劑量丙泊酚組和低劑量組，中劑量丙泊酚組宮頸癌HELA細胞生長能力顯著低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1A。與空白組相比，丙泊酚處理組Ki67及PCNA蛋白表達水平顯著降低，且高劑量組顯著低于中劑量組，中劑量組顯著低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1B。

圖1 丙泊酚對宮頸癌HELA細胞生長的影響Fig.1 Effects of propofol on growth of cervical cancer HELA cellsNote:A.Cell proliferation detected by CCK8;B.Expressions of Ki67 and PCNA proteins vs Control，*.P<0.05.

2.2丙泊酚對宮頸癌HELA細胞凋亡情況的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，丙泊酚預處理組細胞凋亡率顯著高于空白組，高劑量丙泊酚組宮頸癌HELA細胞凋亡率顯著高于中劑量組，中劑量組宮頸癌HELA細胞凋亡率顯著高于低劑量組(P<0.05)，見圖2A；與空白組相比，丙泊酚處理組活化的Caspase-3和Caspase-9水平顯著升高且高劑量丙泊酚組活化的Caspase-3和Caspase-9水平顯著高于中劑量組，中劑量組活化的Caspase-3和Caspase-9水平顯著高于低劑量組(P<0.05)見圖2B。

圖2 丙泊酚對宮頸癌HELA細胞凋亡情況的影響Fig.2 Effects of propofol on apoptosis of cervical cancer HELA cellsNote:A.Detection of apoptosis by flow cytometry；B.Expressions of related apoptosis proteins Caspase-3 and Caspase-9.*.P<0.05 vs Control.

2.3丙泊酚對宮頸癌HELA細胞運動情況的影響 Transwell檢測結果顯示，相比空白組，丙泊酚預處理組單位面積侵襲細胞數(shù)目顯著降低，高劑量組單位面積侵襲細胞數(shù)目顯著低于中劑量組，中劑量組單位面積侵襲細胞數(shù)目顯著低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3A；與空白組相比，丙泊酚處理組MMP-9、VEGF蛋白表達水平顯著降低，高劑量組MMP-9、VEGF蛋白表達水平顯著低于中劑量組，中劑量組MMP-9、VEGF蛋白表達水平顯著低于低劑量組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3B。

圖3 丙泊酚對宮頸癌HELA細胞運動能力影響Fig.3 Effects of propofol on motor ability of cervical cancer HELA cellsNote:A.Cell motor ability detected by Transwell；B.Expressions of cell migration-related proteins MMP-9 and VEGF.*.P<0.05 vs Control.

2.4丙泊酚對宮頸癌HELA細胞wnt/β-catenin 通路的影響 與空白組相比，丙泊酚預處理組wnt1、β-catenin和c-Myc蛋白表達水平顯著降低，高劑量組顯著低于中劑量組，中劑量組顯著低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 丙泊酚對宮頸癌HELA細胞wnt/β-catenin 通路影響Fig.4 Effects of propofol on wnt/β-catenin pathway in cervical cancer HELA cellsNote:*.P<0.05 vs Control.

2.5丙泊酚對大鼠體內(nèi)腫瘤的影響情況 與空白組相比，丙泊酚預處理組大鼠腫瘤質(zhì)量顯著降低，高劑量組顯著低于中劑量組，中劑量組顯著低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5A。免疫組化染色可以看出，空白組Ki67和VEGF均被染成淡黃色，呈顯著陽性表達，丙泊酚預處理組Ki67和VEGF呈藍色，且隨著丙泊酚濃度增加藍色逐漸加深，見圖5B。與空白組相比，丙泊酚預處理組Ki67和VEGF陽性細胞數(shù)目百分比顯著降低，且高劑量組顯著低于中劑量組，中劑量組顯著低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5C。

圖5 丙泊酚對大鼠體內(nèi)宮頸癌腫瘤的影響Fig.5 Effects of propofol on cervical cancer tumor in ratsNote: A.Tumor weight in rats；B.Positive rates of Ki67 and VEGF in cervical cancer tissues of rats;C.Expressions of Ki67 and VEGF in cervical cancer tissues by immunohistochemistry (× 400).*.P<0.05 vs Control.

3 討論

增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是細胞增殖分化的重要蛋白之一，PNCA指數(shù)越高，細胞的分裂增殖越快[11]。當PNCA指數(shù)持續(xù)升高會使細胞在形態(tài)和結構機能上改變并且使得細胞獲得無限增殖的能力[12]。增殖細胞周期相關核抗原(Ki67)是一種細胞核內(nèi)與細胞分裂增殖相關的蛋白抗原，可以反映細胞增殖能力，當Ki67表達升高，說明細胞增殖能力增強，Ki67表達降低則說明該細胞增殖能力降低。石小燕等[13]研究表明：Ki67的表達與細胞增殖密切相關，是調(diào)節(jié)細胞周期的重要組成部分。本實驗中可以看出使用丙泊酚處理后宮頸癌HELA細胞中Ki67及PCNA蛋白表達顯著降低，且在一定濃度范圍內(nèi)隨著丙泊酚處理濃度增加Ki67及PCNA蛋白表達顯著降低。表明了丙泊酚可以通過降低Ki67及PCNA蛋白表達水平抑制宮頸癌HELA細胞的增殖能力，且呈濃度依賴性。

細胞凋亡是受基因調(diào)控的一種程序性死亡，其中Caspase是細胞凋亡的核心。Caspase-3、Caspase-9是Caspase家族的凋亡因子[14]。王銘等[15]研究表明：Caspase-9是Caspase家族中最常見的凋亡啟動子。在Caspase家族中主要執(zhí)行凋亡的基因為Caspase-3[16]。有活性的Caspase-9裂解使得 proCaspase-3產(chǎn)生有活性的Caspase-3并通過剪切另外的Caspase底物，引起級聯(lián)反應，最終導致移植瘤發(fā)生凋亡，達到控制腫瘤細胞凋亡的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用丙泊酚處理后宮頸癌HELA細胞中有活性的Caspase-3、Caspase-9含量顯著增加，說明丙泊酚處理可以促進宮頸癌HELA細胞的凋亡，同時隨著丙泊酚處理濃度的增加，有活性的Caspase-3、Caspase-9含量顯著增加，表明丙泊酚促進宮頸癌HELA細胞的凋亡呈濃度依賴性。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一類具有降解細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)能力的蛋白水解酶。MMPs與腫瘤細胞的浸潤、遷移、運動及血管生成等有著密切的關系[18]。劉進忠等[19]研究表明：腫瘤細胞發(fā)生侵襲轉移首先需要降解ECM并破壞基底膜。MMP-9則是降解 ECM最重要的蛋白酶類。當MMPs激活后形成的MMP-9降解、破壞腫瘤表面成分后會使得腫瘤細胞沿缺失的基底膜向周圍組織浸潤，促進癌細胞侵襲和轉移。本研究發(fā)現(xiàn)使用丙泊酚處理后宮頸癌HELA細胞MMP-9顯著降低，且隨著丙泊酚的濃度增加MMP-9表達水平顯著降低，說明丙泊酚可以抑制宮頸癌HELA細胞表達MMP-9，達到抑制腫瘤侵襲和遷移的效果，且在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性。

劉洪偉等[20]研究表明激活Wnt/β-catenin 信號通路對細胞的分化和生長有著密切的關系，研究證實，抑制 Wnt1 信號通路可以抑制腫瘤細胞增殖并誘導腫瘤細胞的凋亡。劉春蘭等[21]研究表明：免疫組化方法分析 Wnt1 和 β-catenin 在宮頸癌細胞中表達顯著高于正常宮頸細胞，且與疾病的發(fā)展呈正相關。研究證實在宮頸鱗狀上皮的惡性轉換過程中Wnt1 和 β-catenin參與其中，同時在宮頸癌的發(fā)展過程中起了促進作用。本研究發(fā)現(xiàn)使用丙泊酚處理后宮頸癌HELA細胞中Wnt1 和 β-catenin蛋白及該通路相關蛋白c-Myc表達顯著降低，說明丙泊酚可以抑制Wnt/β-catenin 信號通路，同時隨著丙泊酚處理濃度的增加，Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白表達量進一步減少，說明Wnt/β-catenin 信號的抑制程度會隨著丙泊酚濃度的升高而增加，且呈劑量依賴性。

綜上所述，丙泊酚可通過抑制Wnt/β-catenin 通路實現(xiàn)抑制宮頸癌HELA細胞生長和運動能力，其作用機制可能與促進凋亡因子Caspase-3和Caspase-9表達，抑制細胞侵襲和遷移相關蛋白的表達，同時抑制Wnt/β-catenin 通路有關蛋白的表達有關。但調(diào)控宮頸癌HELA細胞相關通路較多，在后續(xù)的實驗中可以進一步探討丙泊酚通過調(diào)節(jié)其他通路對宮頸癌HELA細胞生長、侵襲、遷移及凋亡機制的影響。