陳麗娜，王亞俊，丁會(huì)芹，吳明遠(yuǎn)，王建剛，劉大慶，張 輝

（1.康立泰藥業(yè)有限公司，山東 青島 266112；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101）

白介素12（IL-12）是具有多重免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，研究表明其能通過調(diào)節(jié)固有免疫、獲得性免疫及腫瘤血管生成過程發(fā)揮抗腫瘤作用[1-2]。固有免疫方面，IL-12的P40亞基可作為巨噬細(xì)胞的趨化因子，趨化巨噬細(xì)胞向腫瘤部位移動(dòng)，增強(qiáng)免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗腫瘤作用。獲得性免疫方面，IL-12作為在Th1細(xì)胞分化和Th1型細(xì)胞因子介導(dǎo)的腫瘤免疫和炎癥免疫中發(fā)揮作用的最重要細(xì)胞因子[3]，能誘導(dǎo)NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素（IFN-γ），IFN-γ能上調(diào)MCH-I/II類分子、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）等黏附分子及T-bet等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子的表達(dá)，并能反饋性上調(diào)產(chǎn)生內(nèi)源性IL-12，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。國內(nèi)外已有較多研究均明確闡述了IL-12在抗腫瘤方面的有效性[4-8]。因此，本文就IL-12單藥抗腫瘤，以及聯(lián)合放化療、免疫治療等治療方式聯(lián)合抗腫瘤的動(dòng)物藥效學(xué)研究做一綜述。

1 IL-12單獨(dú)用藥對(duì)荷瘤動(dòng)物模型的藥效學(xué)研究

1.1 IL-12對(duì)黑色素瘤轉(zhuǎn)移的肺癌、肝癌、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤及腎細(xì)胞癌的抑制作用

Gately等[9]研究了IL-12在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤及抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性，證實(shí)了IL-12對(duì)黑色素瘤轉(zhuǎn)移的肺癌、肝癌、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤及腎細(xì)胞癌的抑制作用。首先評(píng)價(jià)IL-12對(duì)B16F10黑色素瘤在肺部轉(zhuǎn)移的抑制作用。靜脈注射腫瘤細(xì)胞后，C57BL/6小鼠從種瘤后第1天開始，一周5次腹腔注射不同劑量的IL-12，共3周。結(jié)果表明，腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)量呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，1 μg劑量組（41個(gè)）與溶劑對(duì)照組（200個(gè)）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）；另一組已轉(zhuǎn)移腫瘤試驗(yàn)中，1 μg劑量組與對(duì)照組相比，腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)量差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0005）。結(jié)果表明，IL-12有潛在的抗腫瘤活性，且這種活性在有明確的腫瘤轉(zhuǎn)移后仍可體現(xiàn)。其次，IL-12對(duì)皮下已生長B16F10腫瘤的抑制性也有劑量相關(guān)性，未出現(xiàn)顯著相關(guān)毒性。繼續(xù)給藥至第50天，小鼠腫瘤生長被一定程度地抑制，極大地延長了小鼠的存活時(shí)間。

IL-12對(duì)M5076網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤的生長及肝轉(zhuǎn)移的抑制作用評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果表明，溶劑對(duì)照組的中位生存期為21 d，并在第26天小鼠全部死亡；IL-12給藥組的中位生存期為38 d。另外皮下注射M5076腫瘤細(xì)胞后，腫瘤的發(fā)展慢于皮下注射B16F10細(xì)胞，因此，給予IL-12治療在種植腫瘤細(xì)胞4周后開始。IL-12仍顯著減緩了腫瘤生長，自發(fā)的肝轉(zhuǎn)移也被有效抑制。上述結(jié)果表明，IL-12可抑制M5076網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤在皮下的生長以及肝轉(zhuǎn)移。

腹腔注射IL-12對(duì)小鼠腎細(xì)胞腺癌腫瘤未完全消失，但有顯著的抑制效果。將IL-12注射于癌周則腫瘤抑制效果非常顯著，60 d后檢測(cè)結(jié)果表明，IL-12給藥組有70 %的小鼠未檢測(cè)到腫瘤。上述結(jié)果表明，IL-12有抗腎細(xì)胞腺癌的活性，且在一定情況下，可導(dǎo)致已形成腫瘤消失。

1.2 IL-12對(duì)結(jié)腸腺癌、肉瘤的抑制作用

Nastala等[10]研究發(fā)現(xiàn)重組白介素12（rIL-12）可誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生從而導(dǎo)致腫瘤凋亡。C57BL/6小鼠腹腔種植MCA-105及MC-38腫瘤細(xì)胞后，給予IL-12可使腫瘤細(xì)胞消亡，并且延長小鼠生存期。IL-12單獨(dú)使用或與IL-2聯(lián)合應(yīng)用抗MC-38腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)果表明，建立肺部腫瘤轉(zhuǎn)移模型后10 d給予IL-12（1.0 μg/d），微小轉(zhuǎn)移腫瘤明顯被抑制。相比于IL-2對(duì)照組，雖然IL-2給藥組也產(chǎn)生了顯著的腫瘤抑制作用，但毒性反應(yīng)較大；低劑量的IL-2及IL-12聯(lián)用在本試驗(yàn)條件下未顯現(xiàn)出更好的抗腫瘤效果。以上結(jié)果均證實(shí)了IL-12對(duì)結(jié)腸腺癌、肉瘤較好的抑制作用。

1.3 IL-12對(duì)纖維肉瘤、卵巢癌的抑制作用

IL-12對(duì)3種腫瘤模型的抑制作用研究[11]，包括病毒誘發(fā)的CSA1M纖維肉瘤，輻射導(dǎo)致的OV-HM卵巢癌及化學(xué)致癌的MCH-1-A1纖維肉瘤。CSA1M和OV-HM腫瘤在經(jīng)過系統(tǒng)的IL-12治療后完全消失，這種治療方式甚至對(duì)生長50 d的大CSA1M腫瘤消亡也是有效的。OV-HM卵巢癌有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移性，在小鼠種植腫瘤細(xì)胞一個(gè)月后即可自發(fā)向淋巴結(jié)和肺部轉(zhuǎn)移形成微小腫瘤，但經(jīng)IL-12治療后，小鼠的原生OV-HM腫瘤完全消失，且未觀察到有腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生。結(jié)果表明，IL-12對(duì)于OV-HM模型在消除原生腫瘤的同時(shí)還可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。但對(duì)于MCH-1-A1纖維肉瘤雖有腫瘤被抑制的情況，但沒有引發(fā)腫瘤消亡。結(jié)果表明，對(duì)于不同的腫瘤模型，IL-12的抗腫瘤效應(yīng)可能是不同的。IL-12抗腫瘤機(jī)制及影響IL-12功效的因素仍需進(jìn)一步深入探索。

1.4 IL-12對(duì)淋巴瘤的作用

Verbik等[12]評(píng)價(jià)了IL-12對(duì)淋巴瘤的作用效果，BALB/c小鼠種植1×103 RAW117-H10淋巴瘤細(xì)胞24 h后，腹腔注射給予IL-12。腫瘤種植后第16天，對(duì)照組的小鼠全部死于肝臟和肺部巨大的腫瘤負(fù)荷；而腫瘤種植60 d后處死給藥組小鼠，病理照片顯示，0.350 μg給藥組小鼠沒有在肺部或肝部出現(xiàn)腫瘤小結(jié)節(jié)。結(jié)果表明，IL-12能有效提高淋巴瘤小鼠的總生存率，并有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

1.5 IL-12對(duì)乳腺癌的作用

Boggio等[13]評(píng)價(jià)了在腫瘤早期、晚期及長期給藥IL-12對(duì)小鼠乳腺癌發(fā)展的影響，將過度表達(dá)HER-2/neu致癌基因的轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠（BALB-neu T小鼠）及攜帶HER-2/neu原癌基因的FVB小鼠（FVB-neu N小鼠）隨機(jī)分組，每周檢查乳腺及腫塊情況＞3 mm即確認(rèn)為腫瘤。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-12可推遲BALB-neu T小鼠乳腺癌的發(fā)生。評(píng)價(jià)了FVB-neu N小鼠接受IL-12治療乳腺癌發(fā)展的情況，在確認(rèn)腫瘤形成后第6周、第22周和第28周腹腔注射IL-12。6周給藥組、22周給藥組與對(duì)照組相比，在腫瘤增殖及無瘤率方面，均存在顯著性差異，但第28周給藥組與對(duì)照組相比無顯著差異。以上結(jié)果提示，對(duì)腫瘤的抑制作用似乎主要依賴于IL-12干預(yù)早期腫瘤血管生成的能力。

1.6 IL-12對(duì)膀胱癌的作用

O’Donnell等[14]研究了IL-12在小鼠膀胱癌模型中的作用，MB49細(xì)胞和MBT2細(xì)胞腫瘤模型給藥試驗(yàn)結(jié)果均表明，IL-12對(duì)膀胱癌的抑制作用為劑量相關(guān)的；在一個(gè)MB49腫瘤模型給藥試驗(yàn)中，于第3，5，7，9和11天給予IL-12 250 ng，小鼠腫瘤完全消失，且在到試驗(yàn)結(jié)束的180 d內(nèi)，無腫瘤生長跡象。

研究者進(jìn)一步探索，將上述試驗(yàn)中存活的C57BL/6J小鼠再次接種MB49腫瘤細(xì)胞，于第7天后給予IL-12，給藥劑量為500/1000 ng，一周5次，共2周。當(dāng)發(fā)現(xiàn)腫瘤生長直徑大于2 cm時(shí)，將小鼠處死。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥組與對(duì)照組相比，小鼠存活率有顯著差異；于第105天后給經(jīng)IL-12治療的存活小鼠再次接種MB49腫瘤，并不再給予IL-12，最初1000 ng給藥組存活的小鼠在此次試驗(yàn)中有了更高的存活率，表明給予IL-12可產(chǎn)生免疫保護(hù)。

2 IL-12與放化療或其他腫瘤治療方法聯(lián)合應(yīng)用的藥效學(xué)研究

早期的非臨床研究顯示IL-12單藥在抗腫瘤非臨床研究中具有很好的治療效果，但是臨床藥效卻并不明顯，并且引發(fā)了嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，研究嘗試將IL-12與其他癌癥治療方法聯(lián)用，如抗體、腫瘤疫苗、其他細(xì)胞因子、化療及放療等。

2.1 IL-12與放化療聯(lián)合治療腫瘤

在多種動(dòng)物腫瘤模型中，IL-12和環(huán)磷酰胺聯(lián)用產(chǎn)生了比IL-12或環(huán)磷酰胺單獨(dú)使用均更優(yōu)的抗腫瘤效應(yīng)。

一項(xiàng)小鼠肉瘤和結(jié)腸癌腫瘤模型研究證實(shí)[15]，在多次的化療周期中，免疫刺激缺乏而非內(nèi)在腫瘤細(xì)胞的耐藥性，是抗腫瘤反應(yīng)喪失的原因。該研究還發(fā)現(xiàn)，無論腫瘤是否有免疫原性，在化療周期中加入IL-12可保持甚至促進(jìn)抗腫瘤反應(yīng)，并顯著延長小鼠生存期。有些腫瘤負(fù)荷較大的小鼠，在第一次環(huán)磷酰胺和IL-12聯(lián)合治療復(fù)發(fā)后，給予第二次治療（治療方案、劑量與第一次相同）可完全清除腫瘤。分析表明，在第一個(gè)治療周期后，兩種藥物聯(lián)用提高了宿主的抗腫瘤免疫活性。Le等[16]研究再次證明，通過IL-12治療而激活的抗腫瘤免疫反應(yīng)，特別是環(huán)磷酰胺和IL-12組合，可對(duì)抗臨床上顯著的大腫瘤負(fù)擔(dān)。預(yù)先存在的腫瘤致敏T細(xì)胞[15,17]對(duì)IL-12和環(huán)磷酰胺加IL-12根除已建立的腫瘤至關(guān)重要。

有研究對(duì)小鼠腫瘤放化療后給予IL-12，取得了較好的結(jié)果[18]。試驗(yàn)采用C57BL/6J小鼠，種植EL4淋巴瘤或Lewis肺癌細(xì)胞，建立腫瘤模型，造模后的小鼠進(jìn)行放化療治療，并給予IL-12。放/化療后每3～4 d進(jìn)行外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)，并測(cè)量腫瘤大小。

（1）低劑量IL-12顯著改善了亞致死劑量照射荷瘤小鼠全血細(xì)胞減少癥，同時(shí)伴隨腫瘤體積減小。在EL4淋巴瘤和Lewis肺癌模型中，相對(duì)于對(duì)照組，所有細(xì)胞因子治療組在研究終點(diǎn)均表現(xiàn)為腫瘤體積整體減??；對(duì)于淋巴瘤模型，IL-12治療（預(yù)給藥、后給藥或預(yù)-后給藥）明顯抑制了腫瘤的生長（%T/C＜50 %），但粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）效果不顯著，所有治療組對(duì)第二次輻射劑量表現(xiàn)出一定的敏感性。在Lewis肺癌模型中，相對(duì)于對(duì)照組，G-CSF和IL-12治療組的腫瘤體積均減小。雖然Lewis肺癌模型中，相對(duì)于對(duì)照組，所有的細(xì)胞因子治療組抑制了腫瘤生長，但只有IL-12預(yù)-后給藥組和G-CSF組對(duì)第二劑量輻射表現(xiàn)出敏感性。在Lewis肺癌模型中，與對(duì)照組相比，只有IL-12后給藥組腫瘤體積減少顯著（%T/C＜50 %）。

（2）與單純化療相比，低劑量IL-12促進(jìn)化療后的荷瘤小鼠造血恢復(fù)并伴隨腫瘤生長體積的抑制。在兩種腫瘤模型的化療研究觀察期結(jié)束時(shí)，與單獨(dú)治療（安慰劑組）相比，IL-12聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療使腫瘤體積顯著減少（%T/C＜50 %），尤其是EL4模型，無論是IL-12預(yù)-后給藥和IL-12后給藥在16天觀察期結(jié)束時(shí)腫瘤體積均顯著減少（%T/C＜50 %）。而對(duì)于肺癌模型，在12 d觀察期內(nèi)，IL-12預(yù)-后給藥組（分次劑量為50 ng/100 ng）和預(yù)給藥組（50 ng）腫瘤體積都顯著減少（%T/C＜50 %）。無論哪種腫瘤模型，G-CSF治療未實(shí)現(xiàn)顯著腫瘤減少，只在肺癌模型中可看到總體不顯著的腫瘤體積減少。IL-12在Lewis肺癌模型中的抗腫瘤效應(yīng)另一個(gè)重要部分是IL-12聯(lián)合環(huán)磷酰胺在單純基本治療的基礎(chǔ)上產(chǎn)生了顯著的抗腫瘤反應(yīng)，盡管事實(shí)上細(xì)胞株無免疫原性（以往報(bào)道IL-12對(duì)Lewis肺癌腫瘤模型的效應(yīng)顯示IL-12對(duì)這種無免疫原性的腫瘤沒有抗腫瘤效果[19]）。因此，該研究IL-12預(yù)-后給藥組在無免疫原性腫瘤的結(jié)果，即%T/C約34 %，表明IL-12與環(huán)磷酰胺聯(lián)合改變了這種無免疫原性肺癌腫瘤模型的免疫原性。

進(jìn)一步對(duì)淋巴瘤模型進(jìn)行第二輪化療及細(xì)胞因子治療，以評(píng)估腫瘤直徑＜20 mm荷瘤小鼠腫瘤的發(fā)展。環(huán)磷酰胺及佐劑細(xì)胞因子給藥方式與上述相同。在第二輪化療時(shí)，小鼠體內(nèi)的可見腫瘤并未消失。因此與該小鼠模型系統(tǒng)的第一輪化療相比，在第二輪環(huán)磷酰胺治療時(shí)，表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞毒性藥物明顯的耐受性。人類癌癥治療中也觀察到對(duì)環(huán)磷酰胺的耐受性。小鼠淋巴瘤研究中，第二輪化療結(jié)束后，即第一輪環(huán)磷酰胺治療后5周和腫瘤接種后7周，試驗(yàn)終止時(shí)IL-12預(yù)-后給藥組和后給藥組分別有37.5 %和50 %的小鼠無腫瘤，而安慰劑組未發(fā)現(xiàn)無腫瘤的小鼠。因此，在這種侵襲性淋巴瘤模型中，IL-12給藥結(jié)合環(huán)磷酰胺是非常有效的治療方法，產(chǎn)生的抗腫瘤效應(yīng)比單純環(huán)磷酰胺療法更有效。

在一項(xiàng)硼替佐米與IL-12聯(lián)合抗腫瘤的臨床前研究中[20]，硼替佐米單藥使用導(dǎo)致了腫瘤生長的顯著抑制，分別在治療15和21 d后腫瘤體積減少約65 %和約60 %。在同一時(shí)間點(diǎn)，硼替佐米與IL-12聯(lián)合治療則分別使腫瘤生長減少約75%和約84 %。在2周時(shí)終止硼替佐米治療后，腫瘤恢復(fù)生長。聯(lián)合治療則完全阻止了腫瘤生長的這種反彈，且在整個(gè)過程中腫瘤體積持續(xù)減少。

2.2 IL-12與其它免疫療法聯(lián)合治療腫瘤

基于IL-12組合免疫療法的當(dāng)前趨勢(shì)通?？煞譃閮煞N，一種旨在增強(qiáng)抗腫瘤應(yīng)答，如將IL-12應(yīng)用于癌癥疫苗過繼性T細(xì)胞療法[21]；另一種將IL-12作為免疫治療劑、生物治療藥等的補(bǔ)充，其抗腫瘤機(jī)制與IL-12單藥抗腫瘤機(jī)制不同[22-23]。

最近，IL-12與單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用的動(dòng)物研究獲得了有希望的結(jié)果，這些單抗包括抗CTLA-4和抗PD-L1等[24-25]。IL-12（確切地說，通過注射編碼IL-12的Semliki Forest病毒）聯(lián)合激動(dòng)劑抗CD137單抗治療黑色素瘤和肺癌模型小鼠，也獲得了增強(qiáng)IL-12的抗腫瘤作用[26]。值得注意的是，目前臨床腫瘤學(xué)腫瘤免疫治療策略中對(duì)表面分子的阻斷和刺激單克隆抗體均進(jìn)行了深入研究。有研究嘗試轉(zhuǎn)移編碼IL-12的mRNA，OncoSec Medical（NCT03132675）也已發(fā)表腫瘤內(nèi)基因電穿孔策略。初步臨床數(shù)據(jù)表明，IL-12質(zhì)粒聯(lián)合抗PD-1單克隆抗體（pembrolizumab）和對(duì)黑色素瘤患者有效的治療效果[27]。

3 結(jié)語

綜上所述，IL-12單獨(dú)用藥的非臨床抗腫瘤藥效研究多集中在早期階段，且抗腫瘤作用十分顯著。然而，進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段后，IL-12單藥對(duì)各類腫瘤的治療效果并不理想，且給藥劑量較大，不良反應(yīng)明顯。有關(guān)IL-12單獨(dú)用藥的療效，未來仍需大樣本量的臨床前及臨床研究進(jìn)一步確證。研究逐步轉(zhuǎn)向?qū)L-12與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用，以發(fā)揮其保護(hù)和恢復(fù)造血功能、促進(jìn)機(jī)體免疫、調(diào)動(dòng)腫瘤免疫的同時(shí)，能抑制腫瘤生長、提高聯(lián)合治療方式的應(yīng)答率的雙重優(yōu)勢(shì)，最終在動(dòng)物試驗(yàn)中顯示出了較好的抗腫瘤效應(yīng)。IL-12與放化療及其他腫瘤免疫療法聯(lián)合使用，明顯提高了藥物抗腫瘤活性。鑒于IL-12在先天性和獲得性免疫中的重要橋梁作用，IL-12有一定的抗腫瘤活性，尤其是作為免疫佐劑與放化療、免疫治療聯(lián)用時(shí)，可顯著抑制腫瘤生長，阻止腫瘤惡性轉(zhuǎn)移，有效延長生存期。因此，IL-12與放化療、免疫治療及細(xì)胞治療等的聯(lián)合應(yīng)用是未來抗腫瘤的主要發(fā)展方向。隨著對(duì)IL-12的研究深入，IL-12將成為有重要臨床意義的抗腫瘤新藥。