吳瀟蕓 易楚繁 付偉金

[專家介紹]付偉金， 醫(yī)學博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，畢業(yè)于復(fù)旦大學，德國魯爾大學和美國德克薩斯大學訪問學者?，F(xiàn)任中國醫(yī)療保健國際交流促進會泌尿健康促進分會術(shù)后快速康復(fù)學部委員，廣西醫(yī)師協(xié)會泌尿外科分會常委，廣西醫(yī)學會泌尿外科分會委員等。主要從事泌尿系統(tǒng)腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。目前主持國家及省部級課題4項，已培養(yǎng)研究生7名，在讀碩士研究生8名。自2005年以來，以第一作者或通信作者身份在國內(nèi)外核心期刊發(fā)表論文60篇，其中SCI收錄8篇。

【摘要】 華蟾素是傳統(tǒng)中藥，具有解毒、抗炎作用，對肝癌、肺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤具有抗癌作用，其機制可能與抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡、破壞細胞周期、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等有關(guān)。近年華蟾素在治療泌尿系腫瘤基礎(chǔ)研究方面取得初步成功，現(xiàn)就其在泌尿系腫瘤中的治療及相關(guān)機制進展作一綜述。

【關(guān)鍵詞】 華蟾素;泌尿系腫瘤;作用機理

中圖分類號：R737 ? 文獻標志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.11.002

【Abstract】 ? Bufalin is a traditional Chinese medicine with detoxification and anti-inflammatory functions. It has anticancer effect on many kinds of malignant tumors， such as liver cancer， lung cancer and pancreatic cancer， etc. Its mechanism may be related to inhibiting tumor cell proliferation， promoting cell apoptosis， destroying cell cycle and reversing multidrug resistance， etc. In recent years， bufalin has achieved initial success in the treatment of urinary tract tumors on basic research fields. This article reviews the progress of bufalin in the treatment of urinary tract tumors and related mechanisms.

【Key words】 bufalin; genitourinary tumors; mechanism of action

隨著醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)中醫(yī)藥材逐漸成為當今治療腫瘤的重要手段及治療策略，主要在于其不僅對腫瘤具有顯著抑制作用，不易產(chǎn)生耐藥性，而且對機體的損傷及副作用小。因此，研究中藥材抗腫瘤效應(yīng)具有廣闊的臨床應(yīng)用價值。華蟾素是由中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮膚腺的分泌物提煉出來的一種生物活性多羥基類固醇，主要成分是蟾毒靈及吲哚生物堿等，屬于地高辛類物質(zhì)，是一種傳統(tǒng)中藥。華蟾素具有消炎、止痛、抗腫瘤等多種功效。近年研究表明，華蟾素對肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌等多種腫瘤細胞具有抑制作用并可誘導(dǎo)其凋亡[1～3]，其作用機制可能為抑制腫瘤相關(guān)信號通路如磷酸肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶標（mTOR）、Wnt/β-catenin等[4～6]，從而影響腫瘤細胞的上皮間質(zhì)變（EMT）、腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移及誘導(dǎo)凋亡、破壞細胞周期、逆轉(zhuǎn)細胞耐藥性等多種惡性生物學行為[1～3]。近年，華蟾素在泌尿系腫瘤基礎(chǔ)研究方面取得初步成功，本文現(xiàn)就華蟾素在泌尿系腫瘤中的治療研究進展作一綜述。

1 華蟾素治療前列腺癌

前列腺癌是歐美國家男性最常見的惡性腫瘤[7]，位居男性因癌死亡的第二位。前列腺癌患者接受雄激素剝除治療（androgern deprivation therapy，ADT）可抑制前列腺癌進展，前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）下降，改善晚期或轉(zhuǎn)移性患者總生存率（overall survival，OS）。但經(jīng)過平均18個月的抗雄激素治療，雖然血清睪酮的濃度維持在去勢水平以下，但患者會從雄激素依賴性（androgen dependence，AD）轉(zhuǎn)變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔╟astration resistance prostate cancer，CRPC），表現(xiàn)為PSA上升，疾病進展如內(nèi)臟及骨轉(zhuǎn)移灶增多等，CRPC患者臨床預(yù)后差，是目前治療的難點。因此發(fā)現(xiàn)新型治療藥物對于提高CRPC患者預(yù)后十分重要[8]。

2003年有學者首次證實華蟾素可抑制雄激素依賴前列腺癌細胞LNCaP及雄激素非依賴DU145和PC3細胞增殖，促進細胞凋亡，細胞凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、caspase-9表達升高，細胞內(nèi)Ca2+濃度增加，認為華蟾素促進細胞凋亡相關(guān)機制可能與華蟾素破壞細胞鈣穩(wěn)態(tài)和促進細胞凋亡相關(guān)酶表達增強有關(guān)，該研究的初步結(jié)果為華蟾素在泌尿系腫瘤中的應(yīng)用揭開了序幕。2008年，YU等[9]研究也證實了華蟾素可抑制前列腺癌細胞增殖，促進細胞凋亡，可能與其上調(diào)Bax、細胞色素c、caspase等凋亡相關(guān)蛋白有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)華蟾素可延緩前列腺癌細胞LNCaP、DU-145和PC3細胞增殖時間，促進Bax、細胞色素c，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白等表達增強。在表達野生型P53基因的LNCaP細胞中，抑癌基因P53表達增強，反義TP53轉(zhuǎn)染LNCaP細胞活力明顯下降;而突變型P53的DU145和PC3細胞內(nèi)Fas表達明顯高于LNCaP細胞。小干擾RNA- Fas（small interfering RNA，siRNA）下調(diào)Fas表達后可提高腫瘤細胞活力。研究結(jié)果證實表達野生型P53的LNCaP細胞的上游誘導(dǎo)因子為P53和Fas，表達突變型P53的DU145和PC3上游誘導(dǎo)因子為Fas。

微小RNA（Micro RNAs，miRNAs）是一種內(nèi)源性非編碼長度為19～25核苷酸的小分子RNA，通過結(jié)合靶蛋白的3'-非翻譯區(qū)（untranslational region，UTR），從而抑制靶蛋白翻譯并誘導(dǎo)mRNA切割形成。研究證實在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，miRNAs充當調(diào)節(jié)分子，起癌基因或抑癌作用[10～11]。miRNAs表達失調(diào)時可刺激細胞增殖和侵襲，增加腫瘤血管生成，從而促進腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。2013年，ZHAI等[12]證實華蟾素抗腫瘤機制可能與調(diào)控miRNAs表達有關(guān)。他們發(fā)現(xiàn)華蟾素作用于前列腺癌PC3細胞后，可下調(diào)PC3細胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2表達，促進細胞凋亡;實時定量PCR（qRT-PCR）發(fā)現(xiàn)華蟾素可誘導(dǎo)MiR-181a的表達增加，呈劑量依賴關(guān)系。而MiR-181a抑制劑可降低caspase-3表達水平，上調(diào)Bcl-2蛋白表達，降低PC3細胞凋亡。提示MiR-181a是一種抑癌分子，參與調(diào)控細胞凋亡相關(guān)因子。當華蟾素作用于前列腺癌細胞時，可使細胞內(nèi)MiR-181a表達下調(diào)，進而抑制Bcl-2蛋白表達，促進凋亡相關(guān)蛋白caspase-3增加，導(dǎo)致細胞凋亡。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度大于200 bp，不編碼蛋白質(zhì)的RNA，已證實lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，它可通過海綿吸附相關(guān)的下游miRNA，影響其表達，稱為內(nèi)源競爭性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），從而影響miRNA調(diào)控靶基因的表達水平，進而實現(xiàn)其生物學功能。從ZHAI等[12]的研究結(jié)果得到啟發(fā)，ZHANG等[13]使用lncRNA基因芯片檢測經(jīng)華蟾素預(yù)處理的前列腺癌細胞PC3細胞，與對照組相比，lncRNA HOTAIR在華蟾素預(yù)處理組的前列腺癌細胞中，表達顯著下調(diào)。過表達lncRNA HOTAIR可逆轉(zhuǎn)華蟾素對前列腺癌DU145和PC3細胞的抑制作用，進一步研究證實lncRNA HOTAIR與miR-520b存在競爭性結(jié)合作用，而miR-520b可抑制成纖維生長因子受體1表達（FGFR1）。他們認為華蟾素作用于前列腺癌細胞后，可下調(diào)lncRNA HOTAIR表達，從而導(dǎo)致miR-520b表達上調(diào)，抑制FGFR1表達后，導(dǎo)致前列腺癌細胞的遷移和侵襲力下降。ZHANG等[14]發(fā)現(xiàn)華蟾素可誘導(dǎo)前列腺癌LNCaP細胞發(fā)生caspase介導(dǎo)的細胞凋亡，同時，降低雄激素受體及PSA、類固醇受體共激活因子（steroid receptor coactivator，SRC）1、3蛋白表達水平;阻滯腫瘤細胞于G2期;誘導(dǎo)CYR61、CTGF衰老相關(guān)基因表達;增加P53及其下游細胞周期調(diào)控蛋白P21cip蛋白豐度，TP53-siRNA轉(zhuǎn)染細胞后下調(diào)衰老相關(guān)半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase activity，SA-βgal）表達;還可降低細胞裸鼠腫瘤模型生長，治療9周腫瘤重量較對照組降低67%（P<0.05），SA-βgal活性增強。研究結(jié)果提示華蟾素可能通過P53/P21cip信號軸誘導(dǎo)腫瘤細胞衰老，抑制細胞增殖。

以上研究證實華蟾素抑制前列腺癌惡性生物學行為的機制可能與促進細胞凋亡、抑制增殖、影響lncRNA和miRNAs表達、促進細胞衰老等有關(guān)，提示其有可能成為治療晚期前列腺癌的新型藥物。

2 華蟾素治療膀胱癌

膀胱癌是泌尿系常見腫瘤，非肌層浸潤性膀胱癌的標準治療是經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)+術(shù)后膀胱灌注，肌層浸潤性膀胱癌的標準治療是根治性膀胱腫瘤切除術(shù)。晚期或轉(zhuǎn)移性膀胱癌臨床預(yù)后差，無有效治療方法。因此發(fā)現(xiàn)新型和有效治療藥物對于提高膀胱癌患者預(yù)后十分重要。

HONG等[15]探討華蟾素對人膀胱癌T24細胞的影響，發(fā)現(xiàn)華蟾素可阻滯細胞于G2/M期;誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9前體蛋白表達濃度顯著增加;JC-1染色提示腫瘤細胞線粒體膜電位下降;抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL及凋亡抑制因子XIAP、cIAP-1和cIAP-2表達下調(diào)，Bax表達上調(diào);誘導(dǎo)細胞表面跨膜受體Fas、死亡受體4（death receptor，DR4）、DR5和促凋亡配體TRAIL的mRNA及蛋白水平呈濃度依賴性增加。研究結(jié)果提示華蟾素抑制膀胱癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡可能與激活線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑和死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑有關(guān)。HUANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)華蟾素作用于膀胱癌T24細胞后，可抑制細胞活力。DAPI/TUNEL雙重染色檢測提示細胞DNA凝集及凋亡增多，阻滯細胞于G0/G1期;上調(diào)抑癌基因Rb表達，下調(diào)細胞周期素D（cyclin D）、細胞周期素E（cyclin E）、細胞周期依賴激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）2、CDK4及磷酸化Rb（p-Rb）的表達，活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多導(dǎo)致產(chǎn)生細胞毒作用;降低線粒體膜電位水平，增加細胞中細胞色素c、凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）、凋亡蛋白酶活化因子1（apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1）水平，促進caspase-3、caspase-7和caspase-9活化，激活線粒體依賴的凋亡通路誘導(dǎo)凋亡。Bufalin還可降低Akt活性及磷酸化Akt（p-Akt）和抗凋亡蛋白Bcl-2水平，增加Bax水平，提示通過改變Bax/Bcl-2比例和降低Akt活性可調(diào)控膀胱癌細胞凋亡。HUANG等[17]對華蟾素誘導(dǎo)膀胱癌T24細胞凋亡及其機制進行探討。研究結(jié)果提示華蟾素通過下調(diào)Bcl-2表達，上調(diào)caspase-3表達，抑制細胞生長，誘導(dǎo)細胞凋亡，可抑制Na+-K+-ATP酶α3亞基表達。而轉(zhuǎn)染α3亞基過表達質(zhì)粒使Na+-K+-ATP酶α3亞基過表達，明顯減弱華蟾素抗腫瘤功能，導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡減少作用。提示華蟾素促進膀胱癌細胞凋亡的機制可能與下調(diào)Na+-K+-ATP酶的表達有關(guān)。

[5] XIE J， LIN W， HUANG L， et al.Bufalin suppresses the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by inhibiting the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway[J].Oncol Lett ， 2018，16（3）： 3867-3873.

[6] WANG J， CHEN C， WANG S， et al.Bufalin Inhibits HCT116 Colon Cancer Cells and Its Orthotopic Xenograft Tumor in Mice Model through Genes Related to Apoptotic and PTEN/AKT Pathways[J].Gastroenterol Res Pract， 2015，2015：457193.

[7] SIEGEL R L， MILLER K D， JEMAL A.Cancer statistics， 2019[J]. CA Cancer J Clin， 2019， 69（1）：7-34.

[8] DAVIS I D， MARTIN A J， STOCKLER M R， et al.Enzalutamide with Standard First-Line Therapy in Metastatic Prostate Cancer[J].N Engl J Med， 2019，381（2）：121-131.

[9] YU C H， KAN S F， PU H F， et al.Apoptotic signaling in bufalin and cinobufagin-treated androgen-dependent and -independent human prostate cancer cells[J].Cancer Sci， 2008，99（12）：2467-2476.

[10] ZHAN W G， YU S N， LU Z H， et al.The miR-217 microRNA functions as a potential tumor suppressor in pancreatic ductal adenocarcinoma by targeting KRAS[J].Carcinogenesis， 2010，31（10）：1726-1733.

[11] HOU L J， ZHAI J J.Aberrant expression profile of translationally controlled tumor protein and tumor-suppressive microRNAs in cervical cancer[J].J Buon， 2015，20（6）：1504-1509.

[12] ZHAI X F， FANG F F， LIU Q， et al.MiR-181a contributes to bufalin-induced apoptosis in PC-3 prostate cancer cells[J].BMC Complement Altern Med， 2013，23（13）：325.

[13] ZHANG J J， ZHOU XH， ZHOU Y， et al.Bufalin suppresses the migration and invasion of prostate cancer cells through HOTAIR， the sponge of miR-520b[J].Acta Pharmacol Sin， 2019，40（9）：1228-1236.

[14] ZHANG Y， DONG Y， MELKUS M W， et al.Role of P53-Senescence Induction in Suppression of LNCaP Prostate Cancer Growth by Cardiotonic Compound Bufalin[J].Mol Cancer Ther， 2018，17（11）：2341-2352.

[15] HONG S H， CHOI Y H.Bufalin induces apoptosis through activation of both the intrinsic and extrinsic pathways in human bladder cancer cells[J].Oncol Rep， 2012，27（1）：114-120.

[16] HUANG W W， YANG J S， PAI S J， et al.Bufalin induces G0/G1 phase arrest through inhibiting the levels of cyclin D， cyclin E， CDK2 and CDK4， and triggers apoptosis via mitochondrial signaling pathway in T24 human bladder cancer cells[J].Mutat Res， 2012，732（1-2）：26-33.

[17] HUANG H， ZHANG W.Bufalin induced apoptosis of bladder carcinoma cells through the inactivation of Na+K+-ATPase[J].Oncol Lett， 2018，16（3）：3826-3832.

[18] ?KANG K H， HAN M H， JEONG J W， et al.Bufalin sensitizes human bladder carcinoma cells to TRAIL-mediated apoptosis[J].Oncol Lett， 2017，14（1）：853-859.

[19] OCHOA C E， JOSEPH R W.Nivolumab in renal cell carcinoma：current trends and future perspectives[J].J Kidney Cancer VHL， 2018， 5（1）：15-18.

[20] RAVAUD A， MOTZER R J， PANDHA H S， et al.Adjuvant sunitinib in high risk renal cell carcinoma after nephrectomy[J].N Engl J Med， 2016，375（23）：2246-2254.

[21] XIANG R F， WANG Y， ZHANG N， et al.MK2206 enhances the cytocidal effects of bufalin in multiple myeloma by inhibiting the AKT/mTOR pathway[J].Cell Death Dis， 2017，8（5）：e2776.

[22] WANG C， WANG Q， LI X， et al.Lycorine induces apoptosis of bladder cancer T24 cells by inhibiting phospho-Akt and activating the intrinsic apoptotic cascade[J].Biochem Biophys Res Commun， 2017，483（1）：197-202.

[23] XIE J， LIN W， HUANG L， et al.Bufalin suppresses the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by inhibiting the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway[J].Oncol Lett， 2018，16（3）：3867-3873.

[24] 王名琦，穆素紅.華蟾素抑制腎癌細胞786-O增殖及促凋亡作用研究[J].臨床腎臟病雜志，2019，19（11）：843-846.

（收稿日期：2020-08-06 修回日期：2020-09-25）

（編輯：潘明志）