顧長海 李忠 陳冬玲

摘 要 目的：探討姜黃素對H2O2致H9c2心肌細胞損傷的抗凋亡作用及對核因子κB（NF-κB）信號通路的調(diào)節(jié)作用。方法：將大鼠H9c2心肌細胞隨機分為正常對照組、損傷模型組和姜黃素低、中、高劑量組（25、50、100 μmol/L）。正常對照組不作任何干預;損傷模型組細胞以50 μmol/L H2O2誘導12 h以建立損傷模型;姜黃素各劑量組經(jīng)相應濃度藥物預處理24 h后，再以50 μmol/L H2O2誘導12 h。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，采用MTT法和TUNEL法分別檢測細胞的存活率和凋亡率;采用WTS-8法和顯色法分別檢測細胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量;采用免疫熒光法檢測細胞中微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）陽性表達的相對熒光強度;采用實時定量聚合酶鏈式反應法檢測細胞中NF-κB p65 mRNA的表達水平;采用Western blotting法檢測細胞中NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）蛋白的表達水平。結(jié)果：與正常對照組比較，損傷模型組細胞的存活率和SOD活性均顯著降低，細胞凋亡率、MDA含量、LC3陽性表達相對熒光強度以及NF-κB p65 mRNA和NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表達水平以及p-NF-κB/NF-κB比值均顯著升高（P<0.05）。與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組細胞存活率和SOD活性均顯著升高，細胞凋亡率、MDA含量、LC3陽性表達相對熒光強度以及NF-κB p65 mRNA和NF-κB/p65、p-NF-κB p65蛋白的表達水平以及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：姜黃素能夠提高H2O2致?lián)p傷H9c2心肌細胞的存活率、降低其凋亡率，提高心肌細胞中SOD活性并降低MDA含量;上述作用可能與調(diào)節(jié)心肌細胞NF-κB信號通路有關。

關鍵詞 姜黃素;H9c2細胞;心肌細胞損傷;抗凋亡作用;核因子κB信號通路

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To investigate the anti-apoptotic effect of curcumin on H2O2-induced H9c2 cardiomyocyte injury and the regulation of NF-κB signaling pathway. METHODS： H9c2 cardiomyocyte were randomly divided into normal control group， injury model group， curcumin low-dose， medium-dose and high-dose groups （25， 50， 100 μmol/L）. Normal control group didnt received any intervention. The cells in injury model group were induced with 50 μmol/L H2O2 for 12 h to establish the injury model. The cells in curcumin groups were treated with relevant concentration of drugs for 24 h， and then induced with 50 μmol/L H2O2 for 12 h. After cultured for 24 h， survival rate and apoptotic rate of cells were measured by MTT method and TUNEL method; SOD activity and MDA content were determined by WTS-8 assay and color test; relative fluorescence intensity of LC3 positive expression was detected by immunofluorescence method; mRNA expression of NF-κB p65 in cells was detected by real-time PCR; Western blotting assay was used to detect the protein expression of NF-κB p65 and p-NF-κB p65 in cells. RESULTS： Compared with normal control group， survival rate and SOD activity were decreased significantly in injury model group， while apoptotic rate， MDA content， relative fluorescence intensity of LC3 positive expression， mRNA expression of NF-κB， protein expression of NF-κB p65 and p-NF-κB p65 as well as p-NF-κB/NF-κB were increased significantly （P<0.05）. Compared with injury model group， survival rates and SOD activities were increased significantly in curcumin groups， while apoptotic rates， MDA contents， relative fluorescence intensities of LC3 positive expression， mRNA expression of LC3 positive cells， protein expression of NF-κB p65 and p-NF-κB p65 as well as p-NF-κB p65/NF-κB p65 were decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Curcumin can increase the survival rate of H2O2-induced H9c2 cardiomyocyte injury， decrease its apoptotic rate， increase SOD activity and decrease MDA content in cardiomyocytes. Above effects may be related to the regulation of NF-κB signaling pathway.

KEYWORDS ? Curcumin; H9c2 cells; Cardiomyocyte injury; Anti-apoptotic effect; NF-κB signaling pathway

心血管疾病嚴重危害人類健康，是目前病死率最高的疾病[1]。心血管疾病發(fā)生機制非常復雜，心肌細胞損傷是各種心血管疾病的病理生理學基礎[2]。有研究指出，氧化應激可引起心肌細胞凋亡，損傷心肌細胞功能并引發(fā)心力衰竭等心血管系統(tǒng)疾病[2]。核因子κB（NF- ?κB）信號通路是調(diào)節(jié)體內(nèi)多種組織細胞損傷及氧化應激狀態(tài)的重要信號通路。已有研究證實，NF-κB信號通路的異常激活與心肌細胞損傷的發(fā)生密切相關[3-4]。姜黃素是從姜科、天南星科植物的根莖中提取得到的化合物，具有抗炎、抗氧化應激等多種藥理作用[5]。近年來研究表明，該化合物對心肌細胞損傷具有顯著的改善和修復作用[6]，但其對受損心肌細胞的保護作用及NF-κB信號通路的影響目前尚未見明確報道。為此，本研究擬初步探討姜黃素對H2O2致心肌細胞損傷的抗凋亡作用以及其對NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)作用，旨在為該化合物的臨床應用及心肌細胞損傷的藥理作用研究提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Gallios型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）;Multiskan FC型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;HERAcell型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan Sky型酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司];ECO 48型聚合酶鏈式反應（PCR）儀（英國PCRmax公司）;MP4型垂直電泳儀、ChemiDocTouch型化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）;XSP-12CAC型光學顯微鏡（上海締倫光學儀器有限公司）;TCS SP5型激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）;QL-9001型振蕩器（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

姜黃素對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：20191022，純度：≥96%）;MTT檢測試劑盒（北京群曉科苑生物技術有限公司，批號：YS171211A）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司，批號：180223CC）;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒（南京威特曼生物技術有限公司，批號：180115001）;細胞裂解液（南京碧云天生物技術研究所，批號：180221A）;胰酶細胞消化液（批號：C0201）、免疫染色洗滌液（批號：P0106）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0012）、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（批號：C1088）、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（WST-8法）（批號：S0101）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（批號：S0131S）、NF-κB p65兔單克隆抗體（批號：AF1234）、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）兔單克隆抗體（批號：AF5881）和GAPDH兔單克隆抗體（批號：AF1186）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（批號：A0208）、Alexa Fluor 350標記的山羊抗兔免疫熒光染色試劑盒（含熒光標記的IgG二抗，批號：P0175）、青霉素-鏈霉素混合溶液（批號：C0222）、二甲亞砜（DMSO，批號：ST038）、胎牛血清（批號：C0227）、封閉液（批號：P0260）、抗熒光猝滅劑（批號：P0126）、TritonX-100試劑（批號：P0096）、TdT酶（批號：D3106）、熒光標記液配制檢測液、Trizol試劑（批號：R0016）、RNA酶水（批號：R0022）、Western blotting顯色液（批號：P0018M）均購自上海碧云天生物科技有限公司;微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）兔單克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：14600-1-AP）;DMEM/F12培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司，批號：31600）;4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）熒光染料（美國Abcam公司，批號：AF30A5123）;上、下游引物均由賽默飛世爾科技（中國）有限公司設計、合成;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為雙蒸水。

1.3 細胞

大鼠H9c2心肌細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，于-80 ℃凍存。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)與傳代

取凍存的H9c2細胞，于37 ℃溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL無菌離心管中，加至適量含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）中，以800 r/min離心5 min。棄去上清液，細胞加入適量完全培養(yǎng)基重懸后，接種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），定期更換新鮮的完全培養(yǎng)基，待細胞生長融合至70%～80%時進行傳代。

2.2 分組、造模與給藥

參照文獻方法[7]，收集對數(shù)生長期的H9c2細胞，隨機分為正常對照組、損傷模型組[50 μmol/L H2O2（以不含血清和青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋）]和姜黃素低、中、高劑量組[25、50、100 μmol/L（以適量DMSO溶解后，再以不含血清和青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋）;劑量參照本課題組前期預試驗結(jié)果設置]。其中，正常對照組細胞不作任何干預，常規(guī)培養(yǎng);損傷模型組細胞經(jīng)50 μmol/L H2O2誘導培養(yǎng)12 h以復制細胞損傷模型;姜黃素各劑量組經(jīng)相應濃度藥物預處理24 h后，再以50 μmol/L H2O2誘導培養(yǎng)12 h。

2.3 細胞存活率的檢測

采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期的H9c2細胞，按1×104個/孔接種于96孔板中，按“2.2”項下方法分組、造模、給藥，并另設調(diào)零組（只加入不含血清和青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，不加細胞懸液），每組設3個復孔。培養(yǎng)24 h后，于避光條件下加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于培養(yǎng)箱中室溫避光孵育4 h后，棄去上清液，然后每孔加入DMSO 150 μL，置于振蕩器上振蕩5 min。使用酶標儀于490 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值并計算細胞存活率：細胞存活率=（試驗組細胞平均OD值-調(diào)零組細胞平均OD值）/（正常對照組細胞平均OD值-調(diào)零組細胞平均OD值）×100%。上述試驗重復3次。

2.4 細胞凋亡率的檢測

采用TUNEL法檢測。取對數(shù)期生長的H9c2細胞，按5×104個/孔接種于放有細胞爬片的6孔板中，按“2.2”項下方法分組、造模、給藥，每組設3個復孔。培養(yǎng)24 h后，取出細胞爬片，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗2次后，置于4%多聚甲醛溶液中于室溫固定30 min;用PBS清洗2次，用含0.3%TritonX-100試劑的PBS室溫孵育5 min;每孔加入TdT酶5 μL和熒光標記液配制檢測液45 μL，于37 ℃避光孵育1 h，滴加DAPI熒光染料避光孵育5 min;用PBST溶液清洗5 min×4次以除去多余的染料，再以PBS清洗3次，經(jīng)中性樹脂封片。采用激光掃描共聚焦顯微鏡對樹脂片進行成像分析，對TUNEL陽性細胞（即鏡下細胞核呈綠色熒光的凋亡細胞）進行計數(shù)并計算細胞凋亡率。上述試驗重復3次。

2.5 細胞中SOD活性及MDA含量的檢測

取對數(shù)生長期的H9c2細胞，按5×105個/孔接種于6孔板中，按“2.2”項下方法分組、造模、給藥，每組設3個復孔。培養(yǎng)24 h后，收集細胞并加入細胞裂解液適量，于冰上裂解30 min后，于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液。經(jīng)BCA法測定蛋白濃度后，分別按WTS-8法和顯色法以酶標儀檢測SOD活性和MDA含量，嚴格按照相應試劑盒說明書操作。上述試驗重復3次。

2.6 細胞中LC3陽性表達相對熒光強度的檢測

采用免疫熒光法檢測。取對數(shù)期生長的H9c2細胞，按5×104個/孔接種于放有細胞爬片的6孔板中，按“2.2”項下方法分組、造模、給藥，每組設3個復孔。培養(yǎng)24 h后，取出細胞爬片，于4%多聚甲醛溶液中固定15 min，用PBS清洗5 min×3次;用封閉液室溫封閉60 min，加入LC3一抗（稀釋度為1 ∶ 500），于4 ℃孵育過夜;用PBST溶液清洗后，加入Alexa Fluor 350標記的IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 2 000），室溫避光孵育1 h;滴加DAPI熒光染料，避光孵育5 min;用PBST溶液清洗5 min×4次以除去多余的染料，加入抗熒光猝滅劑適量終止反應。使用熒光顯微鏡觀察并拍照，采用Image J 1.6.0軟件分析試驗組與正常對照組陽性細胞的相對熒光強度（LC3表達陽性的細胞染色后呈綠色熒光）。上述試驗重復6次。

2.7 細胞中NF-κB p65 mRNA表達水平的檢測

采用實時定量PCR法檢測。取對數(shù)期生長的H9c2細胞，按1×106個/孔接種于6孔板中，按“2.2”項下方法分組、造模、給藥，每組設5個復孔。培養(yǎng)24 h后，收集細胞至1.5 mL離心管中，加入Trizol試劑1 mL，靜置30 min，加入氯仿適量（約為離心管中試劑總體積的1/5），渦旋振蕩15 s后，以12 000 r/min離心15 min。取上清液，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻后冰浴10 min;以12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀加入70%乙醇1 mL，混勻;以12 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀風干后加入無RNA酶水溶解，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再按RT-PCR試劑盒說明書操作進行PCR擴增。擴增體系（共100 ?L）：10×擴增緩沖液10 ?L，4×dNTPs 8 ?L，上、下游引物各1 ?L，模板cDNA 1 ?L，Taq DNA聚合酶 1 ?L，加水至100 ?L。擴增條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環(huán);72 ℃再延伸10 min。NF-κB p65上游引物為5′-GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCT-3′，下游引物為5′-GCCAAATCCGTTCACACCGACCT-3′，產(chǎn)物長度為79 bp;β-actin上游引物為5′-TGGAGTCGGATAACTGCTCAGGAG-3′，下游引物為5′-AGACTGGAGTTCACCTGTGGATGG-3′，產(chǎn)物長度為102 bp。采用Applied Biosystems 7500 2.0.6熒光分析軟件進行分析，以β-actin為內(nèi)參，按2-ΔΔCt法計算NF-κB p65 mRNA的表達水平。上述試驗重復3次。

2.8 細胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達水平的檢測

采用Western blotting法檢測。取對數(shù)生長期的H9c2細胞，按1×104個/孔接種于6孔板中，按“2.2”項下方法分組、造模、給藥，每組設3個復孔。培養(yǎng)24 h后，收集細胞，加入裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取蛋白50 μg，于100 ℃變性5 min后，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用封閉液室溫封閉1 h;加入NF-κB p65、p-NF-κB p65、GAPDH一抗（稀釋度均為1 ∶ 500），4 ℃孵育過夜;用PBST溶液清洗后，加入HRP標記的二抗（稀釋度為 ?1 ∶ 2 000），室溫孵育1 h;用PBST溶液清洗后，以顯色液顯影。利用化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像并使用Image J 1.6.0軟件分析，以目標蛋白與內(nèi)參（GAPDH）的灰度值比值表示目標蛋白的表達水平，以p-NF-κB p65與NF-κB p65蛋白的灰度值比值表示NF-κB p65的磷酸化水平。上述試驗重復3次。

2.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Graphpadprism 5軟件作圖。計量資料以x±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組細胞存活率和凋亡率比較

與正常對照組比較，損傷模型組中TUNEL陽性細胞數(shù)明顯增多，細胞存活率顯著降低，而凋亡率顯著升高（P<0.05）;與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組中TUNEL陽性細胞數(shù)明顯減少，細胞存活率均顯著升高，而凋亡率均顯著降低（P<0.05），且隨著姜黃素劑量的增加，有細胞存活率逐漸升高、凋亡率逐漸降低的趨勢。各組細胞存活率和凋亡率的檢測結(jié)果見表1，TUNEL法顯微圖見圖1（圖中，DAPI標記細胞核，TUNEL表示凋亡陽性細胞，Merge表示兩者疊加）。

3.2 各組細胞中SOD活性和MDA含量比較

與正常對照組比較，損傷模型組細胞中SOD活性顯著降低，而MDA含量顯著升高（P<0.05）;與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組細胞中SOD活性顯著升高，而MDA含量顯著降低（P<0.05），且隨著姜黃素劑量的增加，有細胞中SOD活性逐漸升高、MDA含量逐漸降低的趨勢。各組細胞中SOD活性和MDA含量的檢測結(jié)果見表2。

3.3 各組細胞中LC3陽性表達相對熒光強度比較

與正常對照組比較，損傷模型組細胞中LC3陽性表達明顯增多，其相對熒光強度顯著升高（P<0.05）;與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組細胞中LC3陽性表達有所減少，其相對熒光強度均顯著降低（P<0.05），且隨著姜黃素劑量的增加，LC3陽性表達相對熒光強度有逐漸減弱的趨勢。各組細胞中LC3陽性表達相對熒光強度的檢測結(jié)果見表3、圖2（圖中，DAPI標記細胞核，LC3表示LC3陽性表達細胞，Merge為兩者疊加）。

3.4 各組細胞中NF-κB p65 mRNA以及NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表達水平比較

與正常對照組比較，損傷模型組細胞中NF-κB p65 mRNA和NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表達水平以及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均顯著升高（P<0.05）;與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組細胞中上述指標的表達水平以及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均顯著降低（P<0.05），且隨著姜黃素劑量的增加，上述指標水平均有逐漸降低的趨勢。各組細胞中NF-κB p65 mRNA和NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達水平的檢測結(jié)果見表3，蛋白表達的電泳圖見圖3。

4 討論

隨著心血管疾病發(fā)病率的逐年升高，心肌細胞損傷與冠心病、心力衰竭、高血壓等多種心血管疾病的關系逐漸成為研究熱點。有研究指出，長期的氧化損傷狀態(tài)會導致心肌組織細胞大量死亡，若不及時干預，可能會導致心肌功能喪失，引發(fā)心力衰竭等疾病;同時，心肌細胞的大量凋亡會釋放多種炎癥介質(zhì)，可進一步加重心肌組織的氧化應激損傷[8]。此外，心肌功能異?？赡軙е履X等多個組織、器官發(fā)生供血不足，進而引起其缺血性損傷，導致患者病死率升高[8]。

姜黃素是從姜科植物郁金Curcuma aromatica Salisb.的塊根、姜黃C. longa L.的根莖、莪術C. zedoaria （Berg.） Rosc.的根莖和天南星科植物菖蒲Acorus calamus L.的根莖中提取分離得到的單體化合物[5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，姜黃素具有抗炎、抗氧化、調(diào)脂、抗病毒、抗感染、抗腫瘤、抗凝、抗肝纖維化、抗動脈粥樣硬化等多種藥理作用[6，9]。近年來研究報道，姜黃素對膿毒癥、心肌缺血再灌注損傷、氧化應激損傷等多種原因引起的心肌細胞損傷有明顯的改善作用[10-12]，提示姜黃素對心肌細胞損傷的藥理作用及機制值得進一步深入探討。

H2O2誘導的心肌細胞氧化損傷是目前實驗室常用的一種心肌細胞損傷造模方法。H2O2作為易穿透細胞膜的活性氧成分，由于其性質(zhì)穩(wěn)定且易得，是細胞損傷模型常用的誘導劑[13]。H2O2誘導的損傷模型是研究體外細胞損傷最常用的模型，可最大程度地模擬體內(nèi)細胞損傷的病理生理過程[14]。本研究選用來源于胚胎期大鼠心臟組織的H9c2細胞作為研究對象，探討姜黃素對H2O2致心肌細胞損傷的抗凋亡作用。SOD活性和MDA含量可反映細胞氧化損傷水平及對氧化應激的自我調(diào)節(jié)能力，SOD活性降低、MDA含量升高，則表示心肌細胞自我修復能力降低[15]。本研究結(jié)果表明，與正常對照組比較，損傷模型組細胞存活率和SOD活性均顯著降低，細胞凋亡率和MDA含量均顯著升高;與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組細胞存活率和SOD活性均顯著升高，細胞凋亡率和MDA含量均顯著降低。這提示姜黃素能夠改善H9c2細胞氧化應激損傷，抑制細胞凋亡，提高其存活率。

有研究指出，細胞自噬與細胞凋亡之間存有復雜的交互調(diào)控關系，自噬作為一種程序性細胞死亡模式，也參與了心肌細胞損傷的發(fā)生、發(fā)展[16]。在正常的生理狀態(tài)下，細胞維持低自噬狀態(tài)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，自噬增強會導致內(nèi)環(huán)境紊亂并促使細胞死亡，而細胞自噬主要依賴于自噬相關基因編碼的蛋白調(diào)控[17]。LC3是自噬膜表面標記分子，其水平的改變能在一定程度上反映細胞的自噬狀態(tài)及水平[16-17]。本研究結(jié)果表明，與正常對照組比較，損傷模型組細胞中LC3陽性表達的相對熒光強度顯著升高;與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組細胞中LC3陽性表達的相對熒光強度顯著降低，并有一定的劑量依賴趨勢。這提示H2O2誘導的心肌細胞凋亡可能與細胞自噬密切相關;姜黃素能夠抑制這種自噬，進而減少細胞的凋亡。

NF-κB信號通路存在于哺乳動物體內(nèi)的多種組織細胞中，能夠選擇性地與B細胞κ輕鏈增強子結(jié)合，進而調(diào)控與炎癥反應和免疫應答相關基因的表達[18]。NF-κB信號通路的激活與細胞外多種信號因子的變化有關，而細胞外信號因子則與細胞膜上的受體結(jié)合，開啟了一連串下游的反應，即在細胞因子、輻射、重金屬、病毒等多種外界因子的刺激下，NF-κB信號通路會被激活，進而調(diào)控其上下游相關細胞通路及蛋白的表達[19]。然而，NF-κB信號通路的錯誤調(diào)節(jié)會引發(fā)自身免疫性疾病、慢性炎癥等的發(fā)生，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和膝骨關節(jié)炎滑膜炎的發(fā)生機制就與NF-κB信號通路激活及相關蛋白水平異常升高有關[20-21]。NF-κB信號通路的異常激活與心肌細胞損傷的發(fā)病機制密切相關，例如韓笑等[22]的研究表明，缺血再灌注損傷模型大鼠心肌NF-κB信號通路被激活，加重了大鼠心肌組織的炎癥反應及病理損傷，而抑制NF-κB信號通路的激活則能減輕其心肌細胞的損傷;宋光蘭等[23]報道了花旗松素能通過抑制NF-κB信號通路來改善缺氧復氧誘導的H9c2心肌細胞損傷。由此可見，NF-κB信號通路在心肌細胞損傷的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。有研究指出，NF-κB p65 mRNA和NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表達水平均能夠直接反映NF-κB信號通路的表達狀態(tài)，p-NF-κB p65/NF-κB p65比值則能夠表示NF-κB p65的磷酸化水平，上述指標的異常升高均能直接反映出NF-κB信號通路的異常激活[24]。本研究結(jié)果表明，與正常對照組比較，損傷模型組細胞中NF-κB p65 mRNA和NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表達水平以及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均顯著升高;與損傷模型組比較，姜黃素各劑量組上述指標均顯著降低。這表明姜黃素改善H2O2致心肌細胞損傷的機制可能與調(diào)節(jié)NF-κB信號通路密切相關。

綜上所述，姜黃素能夠提高H2O2致?lián)p傷H9c2心肌細胞的存活率，降低其凋亡率，并提高SOD活性、降低MDA含量，其作用機制可能與調(diào)節(jié)心肌細胞NF-κB信號通路有關。目前，臨床上還沒有療效及機制確切的用于治療心肌細胞損傷的NF-κB信號通路抑制劑，故本研究暫未設置陽性對照組。同時，由于研究時間及資金有限，本研究未能考察姜黃素對H9c2心肌細胞NF-κB信號通路上下游其他相關蛋白及基因表達水平的影響，故在未來的研究中將對姜黃素靶向調(diào)節(jié)NF-κB通路相關蛋白表達的作用進行深入研究。

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（收稿日期：2020-05-21 修回日期：2020-09-28）

（編輯：張元媛）