賀鴻桂，徐祖敏

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東湛江524000

DNA是生物遺傳信息的主要載體，因此保持DNA的完整性和穩(wěn)定性對(duì)細(xì)胞的延續(xù)及發(fā)揮正常生理功能具有非常重要的意義?；蚪MDNA面臨各種各樣的損傷，這些損傷如不能及時(shí)、正確修復(fù)，可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定甚至腫瘤的發(fā)生。為了維持基因組的穩(wěn)定性，生物在進(jìn)化過程中逐步建立起完整而精密的損傷應(yīng)答系統(tǒng)。結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶在DNA復(fù)制、修復(fù)、重組中發(fā)揮了重要的作用，MUS81-EME1是結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶之一[1]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MUS81與EME1形成異源二聚體MUS81-EME1。MUS81和EME1屬于XPF內(nèi)切酶家族，包含ERCC4核酸酶結(jié)構(gòu)域和串聯(lián)螺旋-發(fā)夾-螺旋(HhH)2結(jié)構(gòu)域。MUS81中的ERCC4核酸酶結(jié)構(gòu)域具有催化活性，EME1缺少發(fā)揮催化活性的關(guān)鍵氨基酸，因此被認(rèn)為是一個(gè)調(diào)節(jié)亞基[2,3]。MUS81-EME1復(fù)合物被證明可以裂解多個(gè)支鏈DNA底物，如DNA 3′游離末端、復(fù)制叉和帶切口的霍利迪連接(HJ)。相關(guān)研究表明，MUS81-EME1與其他核酸內(nèi)切酶(如SLX1-SLX4和XPF-ERCC1)形成多聚體從而增強(qiáng)其作為分解酶的活性[4]。MUS81-EME1的活性以細(xì)胞周期依賴的方式受到嚴(yán)格的調(diào)控。人類MUS81-EME1中EME1可被細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK1)和PLK1磷酸化修飾，這種修飾能增強(qiáng)其拆解HJ的能力[5]?；贛US81-EME1上述生物學(xué)功能特點(diǎn)，其在同源重組修復(fù)、鏈間交聯(lián)(ICL)修復(fù)、促進(jìn)染色體脆弱位點(diǎn)(CFS)表達(dá)中發(fā)揮了重要的作用，還能作用于癌基因激活后復(fù)制應(yīng)激中出現(xiàn)的反向復(fù)制叉，起到了潛在致癌作用。現(xiàn)就MUS81-EME1維持基因穩(wěn)定性作用的研究進(jìn)展綜述如下。

1 MUS81-EME1在同源重組修復(fù)中的作用

DNA復(fù)制需要親本DNA雙鏈被解螺旋酶解旋，形成了稱為復(fù)制叉的分支DNA結(jié)構(gòu)，再以每條親代DNA單鏈為模板進(jìn)行DNA的復(fù)制。DNA在復(fù)制過程中遇到許多障礙，阻礙復(fù)制叉進(jìn)程。復(fù)制叉的恢復(fù)高度依賴于同源重組，并且常涉及姐妹染色單體之間的相互作用，形成分支DNA中間體，特別是HJ[6]。HJ是姐妹染色單體之間形成共價(jià)連接的四鏈DNA連接，既往研究表明其主要來源于雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)[7]。因此，盡管HJ的產(chǎn)生有助于DNA高效修復(fù)，但它會(huì)干擾正常的染色體分離，此類重組中間體必須在有絲分裂前被清除，以使DNA在子細(xì)胞中均勻分布。一個(gè)未經(jīng)處理的HJ可能導(dǎo)致染色體不分離和非整倍體，這與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)了兩種不同的HJ處理機(jī)制，即溶解和分解。溶解拓?fù)洚悩?gòu)酶，產(chǎn)生非交叉產(chǎn)物產(chǎn)品；分解反應(yīng)由高度特化的核酸酶催化，分解HJ產(chǎn)生交叉和非交叉產(chǎn)物[8～11]。

人體細(xì)胞中涉及HJ分解的核酸酶為MUS81-EME1、SLX1-SLX4、GEN1，這些酶是保證染色體分離、維持基因組穩(wěn)定性及細(xì)胞活力所必需的。在這些核酸酶中，MUS81-EME1是切割HJ的主要核酸酶[4, 12]。研究顯示，MUS81-EME1在體外不能有效地裂解完整的HJ，但MUS81-EME1可與另一種結(jié)構(gòu)選擇性內(nèi)切酶SLX1-SLX4在細(xì)胞G2/M期相互作用形成SLX-MUS全酶，增強(qiáng)了其對(duì)HJ的裂解能力[8,11]。最新研究發(fā)現(xiàn)，MUS81-EME1、SLX1-SLX4和XPF-ERCC1形成全酶復(fù)合體(SMX)，比三種核酸酶單體能更有效地解決復(fù)制和重組中間產(chǎn)物。在SMX中，在XPF-ERCC1刺激下，SLX4-SLX1和MUS81-EME1配合，用于HJ裂解；SMX通過松弛底物特異性激活MUS81-EME1，使復(fù)制叉和皮瓣結(jié)構(gòu)發(fā)生裂解；激活涉及MUS81的保守的N端HhH區(qū)，介導(dǎo)切口位置選擇和SLX4結(jié)合。XPF-ERCC1對(duì)HJ的分解不是必需的，其可能促進(jìn)了SMX內(nèi)部的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)了催化的最佳底物結(jié)合，但它在復(fù)合物中的確切作用需要進(jìn)一步研究[4]。

MUS81-EME1對(duì)HJ的作用受細(xì)胞檢查點(diǎn)的調(diào)控。MUS81-EME1中EME1在G2/M期同時(shí)被CDKs和PLK1修飾，EME1被磷酸化，這種修飾能增強(qiáng)其處理HJ的能力[5]。CDK1的活性在有絲分裂開始時(shí)達(dá)到峰值，它觸發(fā)了MUS81-EME1與二級(jí)結(jié)構(gòu)選擇性內(nèi)切酶SLX1-SLX4的細(xì)胞周期特異性結(jié)合，形成SLX-MUS全酶[8,10,11]。最新研究發(fā)現(xiàn)，人類細(xì)胞中MUS81-EME1復(fù)合物的生物學(xué)功能受到CK2的正向調(diào)節(jié)，CK2可磷酸化MUS81亞基中的絲氨酸87(S87)；該研究證實(shí)，人類的MUS81-EME1復(fù)合物在G2期末和有絲分裂早期變得活躍，在S期表達(dá)非常低或檢測(cè)不到，MUS81復(fù)合體需要在正常復(fù)制期間失活，說明MUS81-EME1的活性受細(xì)胞周期蛋白和復(fù)制檢查點(diǎn)的調(diào)控[13]。

上述研究表明，未被處理而積蓄的HJ會(huì)阻礙染色體分離并危及細(xì)胞的生存能力，MUS81-EME1可分解同源重組產(chǎn)生的中間產(chǎn)物HJ，促進(jìn)DNA的修復(fù)及染色體的正確分離，進(jìn)而維持基因組的穩(wěn)定性。

2 MUS81-EME1對(duì)CFS的作用

基因組的特定區(qū)域如普通型CFS在S期難以復(fù)制，這些位點(diǎn)招募DNA損傷反應(yīng)蛋白形成核灶，在中期染色體中形成可見縫隙或斷裂的傾向。在大多數(shù)個(gè)體中，常見的CFS形成斷裂或缺口(通常稱為CFS表達(dá))，這些位點(diǎn)中有200多個(gè)已在人類基因組中被識(shí)別[14]。雖然CFS表達(dá)并不是由任何單一原因引起的，但它們的不穩(wěn)定性可能是由于復(fù)制叉停止、晚期DNA復(fù)制中間體的積累、重復(fù)的DNA序列、缺乏復(fù)制起點(diǎn)或復(fù)制與轉(zhuǎn)錄機(jī)制之間的沖突等原因造成的。CFS在細(xì)胞周期的S期后期復(fù)制，在輕度復(fù)制應(yīng)激條件下甚至可能更晚。CFS的不穩(wěn)定性在某些惡性腫瘤的發(fā)病中起著重要作用，因?yàn)樵谀[瘤發(fā)生過程中發(fā)生的許多染色體易位和重排都起源于CFS[15,16]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個(gè)抑癌基因位于CFS區(qū)域，在惡性腫瘤中經(jīng)常被刪除，提示CFS表達(dá)(即其在中期的明顯斷裂)可能是腫瘤發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素[17]。許多CFS可能在細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂前不能完全復(fù)制，這將阻礙姐妹染色單體在有絲分裂中的忠實(shí)分離，并對(duì)基因組的穩(wěn)定性構(gòu)成重大威脅。MUS81-EME1和XPF-ERCC1等結(jié)構(gòu)特異性核酸酶在復(fù)制后期中間產(chǎn)物上的核溶解切口被認(rèn)為用于姐妹染色單體分離[18,19]。MUS81-EME1在有絲分裂早期定位于CFS，切割DNA鏈，解決復(fù)制中間產(chǎn)物及防止后期橋的形成；當(dāng)MUS81-EME1缺失時(shí)，染色體-大橋、微核、超細(xì)后期DNA橋的數(shù)量都會(huì)增加，提示CFS位點(diǎn)的分裂失敗將導(dǎo)致姐妹染色單體分離的失敗。雖然在不完全復(fù)制的CFS區(qū)域的復(fù)制中間產(chǎn)物裂解足以使染色單體分離，但這些染色單體仍處于不完全復(fù)制狀態(tài)。MUS81-EME1在有絲分裂早期對(duì)CFS的裂解促進(jìn)了CFS區(qū)域的有絲分裂DNA合成(MiDAS)，這是表達(dá)CFS所必需的[20]。CFS的表達(dá)來自于MiDAS位點(diǎn)染色質(zhì)的去中心化，而不是DNA斷裂。目前認(rèn)為，以依賴于MUS81-EME1的方式發(fā)生的CFS斷裂或縫隙有助于促進(jìn)該區(qū)域的穩(wěn)定性。

3 MUS81-EME1對(duì)ICL修復(fù)的作用

ICL是一種高毒性的DNA損傷，為共價(jià)連接DNA雙鏈[21]。ICL誘導(dǎo)劑是腫瘤治療中常用的藥物，包括絲裂霉素C、氮芥、順鉑等。然而，這些藥物的療效被腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的耐藥性所限制。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞對(duì)不同ICL誘導(dǎo)劑的交叉抗性可能在接觸一種誘導(dǎo)劑后產(chǎn)生，這表明腫瘤細(xì)胞具有ICL修復(fù)機(jī)制，并提示該機(jī)制在耐藥細(xì)胞中增強(qiáng)。早期的哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，哺乳動(dòng)物對(duì)順鉑、絲鏈霉素等鏈間交聯(lián)劑很敏感，而產(chǎn)生ICL誘導(dǎo)的雙鏈斷裂(DSB)需要MUS81-EME1，提示MUS81-EME1在ICL修復(fù)起到了切開切口的作用[21]。隨后有研究表明，MUS81-EME1突變細(xì)胞對(duì)ICL敏感，但不及XPF-ERCC1突變敏感[22,23]，這說明MUS81-EME1在ICL修復(fù)中起次要作用。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)SLX4與XPF-ERCC1和SLX1的結(jié)合形成的XPF-ERCC1-SLX4-SLX1復(fù)合體在ICL修復(fù)中的作用至關(guān)重要，這可能是通過將XPF-ERCC1-SLX4-SLX1復(fù)合體引入損傷位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)的[8]。而MUS81與SLX4的相互作用對(duì)于ICL的修復(fù)并不是必需的，即MUS81只用于特殊情況，也就是當(dāng)ICL的3′端包含一個(gè)真正的3′ flap結(jié)構(gòu)時(shí)。目前認(rèn)為MUS81-EME1對(duì)ICL的修復(fù)確實(shí)起到了作用，但其作用只是眾多機(jī)制的一部分。

4 MUS81-EME1對(duì)DNA復(fù)制中間體的作用

復(fù)制叉在復(fù)制過程遇到DNA損傷時(shí)會(huì)引起復(fù)制叉的停滯或阻滯，復(fù)制叉的停滯和阻滯可導(dǎo)致不積極參與DNA合成的復(fù)制中間體(RIs)的積累。早期有學(xué)者用復(fù)制抑制劑HU和APT處理小鼠，發(fā)現(xiàn)MUS81響應(yīng)了復(fù)制抑制劑誘導(dǎo)的復(fù)制叉停滯，參與了雙鏈DNA斷裂的形成，并且可重新啟動(dòng)復(fù)制叉；在低劑量暴露于這些復(fù)制抑制劑的情況下，缺乏MUS81的細(xì)胞活力降低[24]。該研究表明MUS81-EME1可以處理這些停滯的復(fù)制叉，并可促進(jìn)隨后的DNA復(fù)制，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活。在乳腺癌相關(guān)蛋白2(BRCA2)缺陷型細(xì)胞中，復(fù)制叉重新啟動(dòng)需要部分切除，退化的復(fù)制叉要依賴于MUS81的切割[25]。該觀點(diǎn)與后來的斷裂誘導(dǎo)復(fù)制有著一致性，即在斷裂誘導(dǎo)復(fù)制修復(fù)途徑中，將阻滯的復(fù)制叉轉(zhuǎn)化為短暫的DNA雙鏈斷裂，后者隨后作為依賴于同源重組的復(fù)制沿?cái)嗔颜T導(dǎo)復(fù)制途徑重新啟動(dòng)的底物[26]。在遭受各種內(nèi)源性和外源性復(fù)制應(yīng)激的人類細(xì)胞中，MUS81-EME1始終可以促進(jìn)染色體斷裂、復(fù)制重新啟動(dòng)及提高細(xì)胞生存能力[27,28]。

5 MUS81-EME1在癌基因誘導(dǎo)的復(fù)制應(yīng)激中的作用

DNA復(fù)制應(yīng)激被用于廣泛定義DNA復(fù)制障礙，包括DNA復(fù)制叉的停滯和崩潰。癌基因激活可引起復(fù)制應(yīng)激，這是腫瘤細(xì)胞的共同特征。復(fù)制叉反轉(zhuǎn)是對(duì)復(fù)制停滯的一種響應(yīng)，最初被認(rèn)為是病理性的，其實(shí)對(duì)停滯的復(fù)制叉可起到保護(hù)作用。一項(xiàng)研究顯示，在癌基因激活后引起的復(fù)制應(yīng)激中，反向復(fù)制叉是最常見的非典型復(fù)制中間體[29]。反向復(fù)制叉的定義是將一個(gè)典型的復(fù)制叉(三向連接)通過兩個(gè)新合成鏈的協(xié)調(diào)退火和模板鏈的再退火轉(zhuǎn)變?yōu)樯深愃艸J的四鏈DNA復(fù)制中間體。該研究采用電子顯微鏡觀察致癌基因細(xì)胞周期蛋白E(CycE)和CDC25A過表達(dá)后誘導(dǎo)的反向叉，發(fā)現(xiàn)在敲除MUS81后反向叉水平升高更明顯，提示反向復(fù)制叉可能被MUS81-EME1轉(zhuǎn)化成為DSB，作為復(fù)制染色體斷裂的前體。而MUS81在CycE過表達(dá)時(shí)引起的斷裂能增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力；CDC25A過表達(dá)時(shí)，細(xì)胞則大量死亡。CycE過表達(dá)與CDC25A過表達(dá)不同之處在于細(xì)胞周期檢查點(diǎn)是正常的，這表明，在細(xì)胞周期檢查點(diǎn)正常的情況下，刻意的復(fù)制叉切割可以幫助細(xì)胞克服內(nèi)源性復(fù)制應(yīng)激。由此推測(cè)，癌前病變的細(xì)胞對(duì)結(jié)構(gòu)特異性核酸酶如MUS81-EME1具有更高的依賴性，這為以MUS81-EME1為靶點(diǎn)的腫瘤治療提供了可能。有學(xué)者就WAN蛋白對(duì)復(fù)制應(yīng)激的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)歷了癌基因誘導(dǎo)的復(fù)制應(yīng)激細(xì)胞中形成的DSB也是依賴于MUS81。實(shí)驗(yàn)中顯示，無論是野生型細(xì)胞還是WRN敲除的細(xì)胞，在CycE過表達(dá)后，MUS81下調(diào)會(huì)抑制染色單體破壞，這一發(fā)現(xiàn)可能表明，由癌基因?qū)е碌膹?fù)制應(yīng)激引起的染色體損傷來自于MUS81對(duì)受干擾復(fù)制叉的不定期處理[30]。另有研究顯示，F(xiàn)BH1和MUS81-EME1介導(dǎo)的DNA DSB在長時(shí)間的復(fù)制應(yīng)激后會(huì)觸發(fā)檢查點(diǎn)信號(hào)高表達(dá)和p53信號(hào)通路激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，雖不能促進(jìn)細(xì)胞的恢復(fù)，但可能幫助清除高水平復(fù)制應(yīng)激的細(xì)胞，抑制病理遺傳變化的產(chǎn)物[31]。有研究報(bào)告，RAD51過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中有頻繁的復(fù)制叉停滯或反轉(zhuǎn)。上調(diào)的RAD51 RNA與編碼兩個(gè)已知HJ去除蛋白(EME1和GEN1)RNA表達(dá)之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。數(shù)據(jù)表明，表達(dá)增加的EME1可能有助于清除反向復(fù)制HJ，即EME1對(duì)腫瘤細(xì)胞中反轉(zhuǎn)復(fù)制叉的處理實(shí)際上促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制，起到了潛在致癌作用[7]。上述這些關(guān)于癌基因誘導(dǎo)的復(fù)制應(yīng)激的研究表明，MUS81-EME1能作用于癌基因激活后復(fù)制應(yīng)激下的反向復(fù)制叉，或是腫瘤細(xì)胞中的反向復(fù)制叉，并且促進(jìn)反向復(fù)制叉的斷裂，形成DSB。MUS81-EME1對(duì)反向復(fù)制叉作用的程度與細(xì)胞復(fù)制檢查點(diǎn)和周期蛋白的調(diào)控密切相關(guān)。

綜上所述，MUS81-EME1能有效去除復(fù)制和重組中間產(chǎn)物，其高效分解對(duì)染色體分離至關(guān)重要。依賴于MUS81-EME1發(fā)生的CFS斷裂或縫隙可以很好地促進(jìn)這些區(qū)域的穩(wěn)定性，在ICL修復(fù)中也有一定的作用。因此，MUS81-EME1是維持基因組穩(wěn)定性所必需的。MUS81-EME1功能的缺失或突變會(huì)引起相關(guān)疾病，且與腫瘤易感性密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)中國南方女性EME1 Thr變異可增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)和促進(jìn)乳腺癌早發(fā)[32]。此外，MUS81-EME1還參與了DNA損傷修復(fù)過程，其功能的變化可能影響腫瘤細(xì)胞的放化療敏感性。有學(xué)者在人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中發(fā)現(xiàn)，人類細(xì)胞中EME1對(duì)DNA交聯(lián)劑引起的損傷有抵抗作用，原因可能是DNA交聯(lián)劑可造成復(fù)制叉停滯，而MUS81-EME1能修復(fù)和重新啟動(dòng)停滯的復(fù)制叉從而出現(xiàn)對(duì)DNA交聯(lián)劑的耐受[33]。近些年癌基因誘導(dǎo)的復(fù)制應(yīng)激相關(guān)研究提示，在癌前病變的細(xì)胞中，MUS81-EME1能修復(fù)損傷的DNA、促進(jìn)細(xì)胞存活，或幫助清除高水平復(fù)制應(yīng)激的細(xì)胞、抑制病理遺傳變化，在長遠(yuǎn)上促進(jìn)了基因組的穩(wěn)定及抑制細(xì)胞癌變[29，31]?？傊?，大量研究證實(shí)了MUS81-EME1在同源重組修復(fù)、ICL修復(fù)、促進(jìn)CFS區(qū)域穩(wěn)定性方面的生物學(xué)功能，未來還需進(jìn)一步探討和研究MUS81-EME1在惡性腫瘤中的具體作用機(jī)制、對(duì)腫瘤發(fā)展及預(yù)后的影響，MUS81-EME1在腫瘤治療中的探索也有望進(jìn)一步展開。