魏玉華（綜述），施寶民（審校）

同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院普外科，上海200065

肝病早期往往發(fā)生纖維化，如果不及時治療或控制，隨著肝纖維化程度的進(jìn)一步加重，最終可能發(fā)展為肝硬化，甚至轉(zhuǎn)化為肝癌［1］。我國的肝細(xì)胞癌發(fā)病率位列所有腫瘤的第2位，且發(fā)病率仍呈現(xiàn)上升趨勢［2］。肝病肝纖維化形成的主要包括肝炎病毒、酒精、自身免疫等，這些病因都會引起正常肝細(xì)胞的凋亡和肝星狀細(xì)胞（HSCs）的激活，造成肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過度積累和肝結(jié)構(gòu)的破壞［3］。近些年，對于肝病肝纖維化的治療，仍沒有特別有效的方法，對于已發(fā)展為終末期肝病的患者，目前最有效的治療手段是肝移植，但是供體器官短缺，免疫排斥以及費用較高等問題，限制了肝移植治療［4］。因此，進(jìn)一步研究治療肝病的有效方法，意義重大。

目前，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）治療肝病被認(rèn)為是一種很有效的治療策略，其優(yōu)點是具有持續(xù)的自我更新、增殖、多能分化和免疫調(diào)節(jié)活性，而且其抗原性低，可以進(jìn)行同種異體MSCs移植［5-7］。許多研究已經(jīng)開始闡明可能的機制，包括向肝細(xì)胞樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)免疫功能以及分泌外泌體等。

1 MSCs的來源及特性

MSCs最初由骨髓中鑒定和分離出來的，在體內(nèi)和體外都可以分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等。MSCs廣泛分布于體內(nèi)組織，具有持續(xù)的自我更新和多向分化的能力［8］?，F(xiàn)在，研究發(fā)現(xiàn)多種組織中都可以分離出MSCs，包括滑膜、脂肪組織、臍帶血、羊水和胎盤等都可以作為MSCs的提取來源［8］。國際細(xì)胞治療學(xué)會提出了一套界定MSCs的最低標(biāo)準(zhǔn)［9］：（1）可塑性黏附；（2）一套特定的細(xì)胞表面標(biāo)記物（CD73，CD90，CD105），同時缺乏CD14、CD34、CD45和人白細(xì)胞抗原DR；（3）體外分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的能力。

有研究提出，MSCs傳統(tǒng)黏附單層培養(yǎng)系統(tǒng)具有許多限制，為了提高M(jìn)SCs培養(yǎng)的質(zhì)量和效率［10］。利用傳統(tǒng)的二維（2D）單層培養(yǎng)方案進(jìn)行MSCs的培養(yǎng)，不能模擬體內(nèi)原生的細(xì)胞微環(huán)境，這可能導(dǎo)致MSCs表型的改變、歸巢和遷移能力的損傷。所以，他們在探索3D培養(yǎng)體系，將人臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs），置于豬來源的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，觀察到hUC-MSCs在3D系統(tǒng)培養(yǎng)時，其表達(dá)的Toll樣受體（Toll-like receptor，TLRs）和 趨 化 因 子 受 體4型（CXCR 4）等因子發(fā)生變化。而且與2D培養(yǎng)相比，在3D培養(yǎng)中CD105陽性細(xì)胞百分比顯著降低，CD34-和CD271陽性細(xì)胞顯著增加。TLR2、TLR3、TLR4、TLR6和CXCR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加。近年來，有研究［11］發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境培養(yǎng)出的MSCs（hypo-MSCs）比在正常氧環(huán)境下培養(yǎng)出的MSCs（nor-MSCs）具有更強的治療作用，主要體現(xiàn)在以下幾個方面。（1）hypo MSCs產(chǎn)生更多的前列腺E合酶（PTGES）；（2）產(chǎn)生較多miR-210，減少肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞的凋亡；（3）能產(chǎn)生前列腺素E2，激活抗炎巨噬細(xì)胞；（4）具有降低氧化應(yīng)激的作用。

MSCs具有很強的自我更新能力，是較為理想的細(xì)胞移植來源，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)方面的治療具有巨大潛能。MSCs可以分化成內(nèi)胚層細(xì)胞以及大多數(shù)中胚層和外胚層細(xì)胞［12］。MSCs還表現(xiàn)出抗炎、抗氧化、血管生成和抗纖維化作用，然而MSCs的功能分化由許多因子決定，包括趨化因子、細(xì)胞因子、生長因子和外泌體等。有研究證明，由成年小鼠的不同器官和組織中產(chǎn)生的MSCs都具有類似于骨髓來源MSCs的形態(tài)、生長特性及免疫表型［13］。但在眾多的MSCs的來源中，人臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSC）是最理想的來源［14］。因為hUCMSCs不僅具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的共同屬性，而且具有更穩(wěn)定的生物學(xué)特性、相對容易獲得、來源豐富以及無倫理問題等優(yōu)點，hUC-MSCs成為了目前研究的焦點。

2 MSCs治療肝病的效果

近年來，有很多研究者將MSCs用于肝病的治療，包括基礎(chǔ)實驗和臨床研究，其治療的有效性及安全性逐漸被證明［5，15-20］。Sang等［5］對包括717名肝硬化患者的14項試驗，進(jìn)行了meta分析，其中研究證明了MSCs聯(lián)合傳統(tǒng)藥物治療組與單用傳統(tǒng)藥物治療組相比，MSCs聯(lián)合傳統(tǒng)藥物有更好的治療效果，肝功能明顯改善，體現(xiàn)在總膽紅素、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、凝血酶原時間等指標(biāo)明顯降低，而血清白蛋白、膽堿酯酶、凝血酶原活性等明顯升高。Liang等［7］進(jìn)行臨床試驗，包括肝硬化患者26例。通過外周靜脈移植同種異體MSCs，其中移植臍帶MSCs 23例，臍血MSCs 2例，骨髓MSCs 1例。隨訪6個月后，總膽紅素和凝血酶原時間均值下降；血清白蛋白水平有所升高；在6個月后，進(jìn)行終末期肝病（MELD）評分也有所改善。Fang等［19］進(jìn)行的臨床試驗表明，對失代償期肝硬化患者，經(jīng)靜脈移植注射骨髓MSCs后，患者的血清白蛋白，總膽紅素以及凝血酶原時間都得到了明顯改善。MSCs組患者治療后的Child-Pugh評分也明顯優(yōu)于對照組，而且MSCs組的死亡率要低于對照組。有臨床試驗對MSCs治療乙肝相關(guān)肝病的效果進(jìn)行研究，110名乙肝相關(guān)ACLF患者被納入這項開放標(biāo)簽、非盲隨機對照研究［20］。對照組（n=554）僅采用標(biāo)準(zhǔn)藥物治療（SMT）；實驗組（n=556）輸注異基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞4周，觀察24周。MSCs組的累積生存率為73.2%；SMT組為55.6%。在隨訪的第5～24周，輸注MSCs患者沒有與輸液相關(guān)的副作用，但與SMT患者相比，發(fā)熱更為頻繁。兩組試驗患者均未發(fā)生腫瘤。與對照組相比，異基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療顯著改善了血清總膽紅素和終末期肝病評分模型等臨床實驗室指標(biāo)。而且MSCs組多器官衰竭和嚴(yán)重感染的死亡率低于SMT組（17.9%對37.0%）。這些研究都證明了外周靜脈行同種異體MSCs移植治療肝病的有效性。

3 MSCs治療肝病的作用機制

3.1 MSCs誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞

MSCs移植注射到體內(nèi)后，分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞（HLCs），可能是MSCs移植治療肝病的機制之一［21］。有研究發(fā)現(xiàn)，使用CCl4建立大鼠肝纖維化和肝硬化模型，然后輸注人源性hUC-MSCs后，觀察小鼠肝纖維化的相關(guān)指標(biāo)，檢測產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)出現(xiàn)人源性ALB、AFP、CK18和CK19，但未檢測到鼠源性ALB、AFP、CK18和CK19［22］。說明hUC-MSCs可以在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化為具有肝細(xì)胞功能的細(xì)胞，MSCs可被誘導(dǎo)分化為HLCs。而且，MSCs可以在體外被誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生iPSCs，iPSCs再被誘導(dǎo)分化產(chǎn)生HLCs，且由MSCs誘導(dǎo)分化的iPSCs端粒酶活性較高、有更強的免疫調(diào)節(jié)能力及對炎癥細(xì)胞因子敏感性更低［21］。由iPSCs分化產(chǎn)生的肝細(xì)胞與人體肝組織細(xì)胞相似性極高，體外培養(yǎng)的MSCs可以被誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生多能干細(xì)胞（iPSCs），然后，iPSCs再分化為HLCs。所以，MSCs可作為HLCs理想的細(xì)胞來源［23］。雖然，通過MSCs誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的HLCs，具有一定的肝細(xì)胞相關(guān)功能和生物活性，但有研究認(rèn)為其表達(dá)水平要低于原肝細(xì)胞的表達(dá)水平。所以，在考慮用HLCs替代全肝細(xì)胞功能時應(yīng)慎重［23］。

3.2 MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用

MSCs具有免疫調(diào)節(jié)特性，通過多種途徑調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)［25］。Yousefifard等［26］認(rèn)為，MSCs是通過充當(dāng)“轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞”來影響各種“效應(yīng)細(xì)胞”，例如T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。MSCs可以分泌多種生物活性分子，包括多種細(xì)胞因子、HGF和IL-10。IL-10是免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，具有抑制血清中炎癥細(xì)胞因子的功能，包括IL-6、TNF-1、干擾素-γ等，可以改善肝硬化大鼠的肝組織中淋巴細(xì)胞增殖，可促進(jìn)肝臟修復(fù)，抑制肝硬化的發(fā)生。在注射MSCs后，失代償期肝硬化患者的外周血中Treg細(xì)胞、TGFβ和IL-10水平明顯升高，而血清IL-6、TNF-α和CD8-T細(xì)胞水平顯著下降［19］。MSCs可以通過上調(diào)TGF-1和Treg細(xì)胞，顯著降低小鼠外周血中的CD4+T和CD8+T細(xì) 胞。Luo等［27］研 究 采 用 靜 脈 移 植 骨 髓MSCs，發(fā)現(xiàn)移植后，肝組織中F4/80+、CD206+活化的M2巨噬細(xì)胞和基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP 13）表達(dá)明顯增加，而F4/80+、iNOS+活化的M1巨噬細(xì)胞表達(dá)明顯受到抑制。IL-10基因表達(dá)升高，IL-12b、IFN-γ、TNF-α和IL-6基因表達(dá)降低。BM-MSC條件培養(yǎng)基處理的JS1細(xì)胞（肝星狀細(xì)胞株的TGF-β1）和膠原-1分泌減少，caspase-3分泌增加。而且，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能有效抑制肝內(nèi)與肝纖維化呈正相關(guān)的α-SMA、天狼星紅和膠原-1的表達(dá)。這說明骨髓MSCs移植可促進(jìn)表達(dá)MMP13的M2巨噬細(xì)胞活化，抑制M1巨噬細(xì)胞進(jìn)一步抑制肝星狀細(xì)胞（HSCs），有效減輕肝纖維化。

最近，Wang等［28］研究認(rèn)為TSG-6是MSCs的主要抗纖維化細(xì)胞因子。MSCs表達(dá)產(chǎn)生的腫瘤壞死因子（TNF）刺激基因6（TSG-6）。在動物實驗中，外源性單用TSG-6就可減輕肝纖維化，而TSG-6被敲除的MSCs（Lv-TSG-6mscs）則無抗纖維化作用。而且實驗進(jìn)一步的研究證實了TSG-6可以通過調(diào)節(jié)M2巨噬細(xì)胞和增加基質(zhì)金屬蛋白酶12（MMP12）的表達(dá)來抗纖維化。他們發(fā)現(xiàn)TSG-6、MMP12和促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）之間存在一個反饋環(huán)，可能有助于進(jìn)一步了解肝硬化的加重過程，以及TSG-6和MSCs的抗纖維化機制。

3.3 MSCs衍生的外泌體

MSCs衍生的外泌體也被認(rèn)為是促進(jìn)肝細(xì)胞增殖、維持肝細(xì)胞功能的主要作用機制之一［29］。最近，MSCs的外泌體對肝纖維化的治療作用引起人們的重視［30］。MSCs外泌體還有一定的優(yōu)勢，外泌體比其母細(xì)胞小，易于生產(chǎn)和儲存，膜表面蛋白含量較低，其免疫原性也低于其母細(xì)胞，特別是，不存在腫瘤形成的風(fēng)險［31］。因此，MSCs產(chǎn)生的外泌體，有希望成為替代MSCs細(xì)胞移植的治療方法，作為一種新型的無細(xì)胞治療手段［32］。

MSCs的旁分泌功能是通過分泌可溶性因子和釋放細(xì)胞外小泡（EVs）來發(fā)揮的，主要含外泌體（Exosome）。外泌體主要由miRNA、mRNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等構(gòu)成，可以從分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞發(fā)揮作用［33-34］。miRNA是構(gòu)成外泌體含量的重要部分，也是外泌體發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵。外泌體的主要功能是作為載體將miRNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞。外泌體作為載體，通過轉(zhuǎn)移生物活性分子來介導(dǎo)細(xì)胞間的溝通，其含有的miRNA具有特定的基因序列，可以調(diào)控靶細(xì)胞的表達(dá)［35］。所以，外泌體對于細(xì)胞與細(xì)胞間的通訊至關(guān)重要。YIN等［14］研究證明了通過MSCs衍生的外泌體，治療不同疾病的有效性，包括缺血性心臟病，肝纖維化和腦血管疾病。有研究［31］認(rèn)為，輸注MSCs產(chǎn)生的外泌體有利于促進(jìn)肝損傷修復(fù)，改善肝功能。所以，他們認(rèn)為MSCs分泌的具有生物活性的細(xì)胞因子才是促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)的主要原因。

4 問題與展望

MSCs體外培養(yǎng)分化誘導(dǎo)后再移植到體內(nèi)對治療肝病的有效性已得到證實，但仍存在一些問題，如MSCs直接注射或在肝臟中植入的長期有效性、干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的潛在風(fēng)險［36］以及體內(nèi)治療的效率和能力等。以前，大部分研究都集中在體外培養(yǎng)MSCs，再將MSCs移植到動物模型或者肝病患者體內(nèi)，隨后評估肝功能指標(biāo)的變化用于證明MSCs治療肝病作用。但近來，有研究［33，37］證明，損傷部位的功能改善與MSCs細(xì)胞植入或分化之間缺乏相關(guān)性。MSCs主要作用機制不是細(xì)胞本身到達(dá)受損肝臟組織，而是通過其分泌的外泌體，轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，增強組織修復(fù)功能［38］。

綜上，MSCs是一種非常有前景的治療肝病的方法，而且其有效性已經(jīng)得到證實。但其安全性、具體作用機制還不明確，以及如何提高其治療效果和治療效率等問題還有待解決。