朱美利 張劍青 趙芝煥

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)二科（昆明650032）

感染性疾病是由細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原體及其產(chǎn)物導(dǎo)致人體局部或全身性炎癥，臨床表現(xiàn)多樣，病情復(fù)雜，病死率較高，及時(shí)明確病因，采取針對(duì)性治療措施，能較好控制疾病的進(jìn)展。傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法，由于操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)效率低等特點(diǎn)，不能滿足感染性疾病及時(shí)診治的需要。臨床上急需一種高效、準(zhǔn)確、全面的病原體檢測(cè)方法，指導(dǎo)感染性疾病及時(shí)診斷及治療。

高通量測(cè)序技術(shù)，又稱下一代測(cè)序技術(shù)，是相對(duì)于Sanger測(cè)序法為代表的傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)而言的新型測(cè)序手段[1]。高通量測(cè)序采用的是并行測(cè)序技術(shù)，單次運(yùn)行可以完成上百萬(wàn)甚至千萬(wàn)次測(cè)序?qū)嶒?yàn)，產(chǎn)出的序列數(shù)據(jù)量大，運(yùn)用該技術(shù)能夠一次性檢測(cè)獲得樣品中可能感染的多種病原體基因組序列，對(duì)混合侵入性感染樣品中多種病原菌檢測(cè)鑒定具有很好的應(yīng)用[2]。

宏基因組測(cè)序是高通量測(cè)序在微生物研究中的一個(gè)重要應(yīng)用，是對(duì)環(huán)境樣品中的微生物遺傳物質(zhì)進(jìn)行高通量測(cè)序，該方法能夠快速、準(zhǔn)確、高效獲得整個(gè)微生物群的基因組信息，不依賴于微生物的分離培養(yǎng)，直接從環(huán)境中提取微生物的遺傳物質(zhì)，通過(guò)基因分析鑒定微生物類型。本文主要介紹宏基因組測(cè)序在感染性疾病病原菌鑒定中的應(yīng)用，旨在為臨床醫(yī)生在感染性疾病的診治中提供一個(gè)更實(shí)用、可靠的檢測(cè)手段。

1 感染性疾病的診治現(xiàn)狀

感染性疾病是造成全球患者發(fā)病及死亡的主要原因，造成較重的疾病負(fù)擔(dān)[3]。病原體的早期識(shí)別和準(zhǔn)確診斷對(duì)及時(shí)、特異、有效的治療感染性疾病至關(guān)重要[4]。由于抗生素、激素、免疫抑制劑的大量使用，惡性腫瘤、免疫缺陷患者增多，臨床病原體呈現(xiàn)復(fù)雜化、多樣化的趨勢(shì)，致病菌難以準(zhǔn)確鑒定，感染性疾病診治困難。傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法很多，其中標(biāo)本培養(yǎng)是病原體診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，需預(yù)估病原體類型，提供適宜的培養(yǎng)條件，耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜，易受臨床抗生素的使用、機(jī)體免疫狀態(tài)的影響，檢出率低[5]；血清學(xué)法目前研發(fā)的抗原、抗體數(shù)量有限，難以滿足多樣化病原體檢測(cè)需求；PCR 法需預(yù)估可能的病原體，無(wú)法完成高通量檢測(cè)，檢測(cè)效率低；基因芯片只能對(duì)已知病原體進(jìn)行篩查，無(wú)法檢測(cè)新的病原體。傳統(tǒng)病原體檢測(cè)法的局限性阻礙了感染性疾病病原體的快速檢測(cè)和鑒定，延誤理想的治療時(shí)間。各種新發(fā)和再發(fā)的感染性疾病、不易發(fā)現(xiàn)的多重感染以及不明病因的發(fā)熱等，都給人類健康帶來(lái)了巨大的威脅，臨床上對(duì)感染性疾病診斷的準(zhǔn)確性和時(shí)效性提出了更高的要求。宏基因組測(cè)序以其快速、高效、準(zhǔn)確的微生物檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)運(yùn)用于感染性疾病的診治[6]。

2 宏基因組測(cè)序在感染性疾病診治中的應(yīng)用

隨著環(huán)境的變化，全球人口老齡化加劇，感染性疾病患病率及病死率增加。傳統(tǒng)病原體檢測(cè)方法難以滿足臨床感染性疾病高效診治的需求。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和測(cè)序成本的大幅降低，宏基因組測(cè)序已成為一種有希望用于感染性疾病準(zhǔn)確診斷的通用病原體檢測(cè)方法[7]。宏基因組測(cè)序可以對(duì)任何類型的病原體進(jìn)行鑒定，甚至可以用于識(shí)別新的病原體，這可能會(huì)替代許多目標(biāo)病原體檢測(cè)[8]，現(xiàn)從以下四個(gè)方面介紹宏基因組測(cè)序指導(dǎo)臨床感染性疾病的診治。

2.1 宏基因組測(cè)序在呼吸系統(tǒng)感染中的應(yīng)用呼吸系統(tǒng)感染是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，是造成嬰幼兒、兒童、老人及免疫低下患者發(fā)病及致死的重要因素。有研究[9-10]顯示，在成人社區(qū)獲得性肺炎中，由于病原菌培養(yǎng)的靈敏度低、時(shí)間要求長(zhǎng)，血清學(xué)和PCR 試驗(yàn)檢測(cè)的微生物數(shù)量有限等原因，僅有38%的病原菌能夠被檢測(cè)出來(lái)。已有報(bào)道宏基因組測(cè)序運(yùn)用于呼吸系統(tǒng)感染診治中，ZOU 等[11]利用宏基因組測(cè)序在不明原因肺炎患者中檢測(cè)出麻疹病毒，表明宏基因組測(cè)序在挑剔病原菌鑒定中具有一定優(yōu)勢(shì)。LI 等[12]對(duì)20例可疑肺部感染患者的肺組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，宏基因組測(cè)序與培養(yǎng)法相比，細(xì)菌鑒定的敏感性和特異性分別為100%、76.5%，陰性預(yù)測(cè)值為100%，該研究中宏基因組測(cè)序比其他檢測(cè)法能鑒定出更多的病原菌，涵蓋難以檢測(cè)的厭氧菌和挑剔菌，具有潛在的速度及敏感性優(yōu)勢(shì)。XIE 等[13]對(duì)ICU 病房重癥肺炎患者進(jìn)行研究，130例行常規(guī)臨床檢測(cè)為對(duì)照組，48例行宏基因組測(cè)序?yàn)橛^察組，兩組根據(jù)檢測(cè)結(jié)果調(diào)整抗生素方案，結(jié)果顯示，觀察組28 d 病死率明顯低于對(duì)照組（16.7%vs.37.7%），90 d 病死率也明顯低于對(duì)照組（16.7%vs.42.3%），宏基因組測(cè)序檢出致病菌陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組（68.7%vs.45.4%），表明宏基因組測(cè)序比常規(guī)檢測(cè)能夠更快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)病原體，及時(shí)調(diào)整抗生素，顯著降低重癥肺炎的病死率。宏基因組測(cè)序在呼吸道感染性疾病病原體檢測(cè)中具有較高的檢測(cè)效率，能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)病原菌，提高呼吸系統(tǒng)感染性疾病的精準(zhǔn)診治能力。

2.2 宏基因組測(cè)序在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的應(yīng)用全球中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染具有較高的發(fā)病率及病死率，造成嚴(yán)重的國(guó)際負(fù)擔(dān)，全球?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)感染的高質(zhì)量診治能力具有較大的需求[14]。由于傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法的局限性，半數(shù)以上的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病例不能明確診斷[15-17]。宏基因組測(cè)序法克服傳統(tǒng)檢測(cè)法的局限性，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷中地位越來(lái)越高。BROWN等[18]對(duì)44例運(yùn)用宏基因組測(cè)序確診腦炎的患者病例進(jìn)行回顧性分析后，認(rèn)為宏基因組測(cè)序應(yīng)被視為慢性和復(fù)發(fā)性腦炎的一線診斷實(shí)驗(yàn)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染由多種微生物引起，已確定有100多種不同的病原體可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染[19]。病毒是引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的主要原因[20]，延誤及時(shí)有效的治療將導(dǎo)致病毒性腦炎更高的病死率和嚴(yán)重的神經(jīng)后遺癥[21-22]。已有較多研究報(bào)道宏基因組測(cè)序成功鑒定出導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病毒類型[23-24]。MAI 等[25]利用宏基因組測(cè)序在1例可疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者尿液中檢測(cè)出日本腦炎病毒，經(jīng)PCR和血清學(xué)證實(shí)該結(jié)果，這是第一次在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)該病毒的存在。中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌感染也較常見(jiàn)，GUO 等[26]研究中腦脊液宏基因組測(cè)序與臨床檢測(cè)法相比，細(xì)菌檢測(cè)敏感性從55.6%提高到68.7%，表明宏基因組測(cè)序能提高細(xì)菌性腦膜炎患者病原菌檢測(cè)的總體陽(yáng)性率。FAN等[27]對(duì)4例可疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的腦脊液進(jìn)行宏基因組測(cè)序，48 h內(nèi)均檢出布魯氏菌，利用PCR和Sanger測(cè)序?qū)ι鲜鼋Y(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，而培養(yǎng)法僅有其中1例患者腦脊液培養(yǎng)7 d后發(fā)現(xiàn)布魯氏菌為陽(yáng)性，表明宏基因組測(cè)序檢測(cè)病原菌比培養(yǎng)法更迅速、高效、準(zhǔn)確。YAO 等[28]報(bào)道了3例腦脊液培養(yǎng)陰性，經(jīng)腦脊液宏基因組測(cè)序確診單核細(xì)胞增多性李斯特菌感染病例，第一次成功將宏基因組測(cè)序技術(shù)運(yùn)用于單核細(xì)胞增多性李斯特菌感染的確診。真菌導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染并不少見(jiàn)，尤其在免疫缺陷患者中，真菌感染是毀滅性的，病死率高，存活個(gè)體遺留持久的神經(jīng)后遺癥[29-32]。WILSON 等[33]對(duì)7例腦膜炎患者的腦脊液行宏基因組測(cè)序，4例患者中檢測(cè)出真菌感染，病例1為免疫缺陷患者，檢出新型隱球菌，血清學(xué)檢測(cè)驗(yàn)證該結(jié)果；病例2為可疑神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者，覆蓋細(xì)菌、真菌、皰疹病毒、結(jié)核的治療，效果不佳，宏基因組測(cè)序腦脊液發(fā)現(xiàn)組織胞漿菌莢膜，與真菌培養(yǎng)及PCR 結(jié)果一致；病例3是診斷困難患者，常規(guī)臨床檢測(cè)陰性，腦脊液宏基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)米曲霉菌，腦脊液PCR檢測(cè)驗(yàn)證該結(jié)果；病例4 臨床常規(guī)微生物檢測(cè)陰性，甚至腦組織活檢未能明確診斷，腦脊液宏基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)杜氏假絲酵母菌。該研究表明宏基因組測(cè)序在中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌感染診斷方面比傳統(tǒng)檢測(cè)法更敏感、準(zhǔn)確，在真菌感染診治中具有較高的運(yùn)用價(jià)值。已有文獻(xiàn)報(bào)道宏基因組測(cè)序運(yùn)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)寄生蟲感染鑒定[34-36]。LIU 等[37]報(bào)道1例診斷困難的可疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病例，腦脊液宏基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)豬帶絳蟲DNA，確診腦囊蟲病，抗寄生蟲治療后，病情緩解，復(fù)查腦脊液豬帶絳蟲DNA 量大幅下降，該研究第一次將宏基因組測(cè)序技術(shù)運(yùn)用于腦囊蟲病的診斷，結(jié)合病情轉(zhuǎn)歸進(jìn)一步驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果。

宏基因組測(cè)序作為一種快速、低成本和高通量的病原體DNA測(cè)序技術(shù)，已用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)各類病原體感染檢測(cè)，對(duì)比傳統(tǒng)病原體檢測(cè)法，具有較高檢測(cè)效率及準(zhǔn)確性，指導(dǎo)臨床治療，提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的快速診治水平。

2.3 宏基因組測(cè)序在血液系統(tǒng)感染中應(yīng)用血液感染是臨床上重癥感染性疾病之一，易誘發(fā)膿毒血癥，導(dǎo)致較高的發(fā)病率及病死率[38-39]，早期快速識(shí)別致病微生物、及時(shí)抗生素治療，能降低病死率，減少住院時(shí)間、相關(guān)費(fèi)用和抗生素使用[4，40-42]。由于培養(yǎng)法及分子檢測(cè)技術(shù)的局限性，血流感染病原體診斷困難。宏基因組測(cè)序運(yùn)用于血液感染病原體識(shí)別已有報(bào)道[43-44]。GRUMAZ 等[45]對(duì)48例膿毒血癥的研究顯示，膿毒血癥發(fā)病時(shí)：血培養(yǎng)、宏基因組測(cè)序病原菌檢測(cè)陽(yáng)性率分別為33%、72%，從整個(gè)研究期間來(lái)看，病原菌陽(yáng)性率分別為11%、71%，該研究表明宏基因組測(cè)序在血液感染病原體檢測(cè)中具有更高檢測(cè)效率。同樣的LONG 等[46]對(duì)78例可疑膿毒血癥患者的血漿行宏基因組測(cè)序及培養(yǎng)，結(jié)果顯示，血培養(yǎng)病原菌檢出率為12.82%，宏基因組測(cè)序檢出率為30.77%，將兩種方法檢測(cè)結(jié)果分別與Sanger測(cè)序法相比，病原菌檢測(cè)一致性為81.82%、100%，宏基因組測(cè)序法還檢出15 種病毒，該研究表明宏基因組測(cè)序在血液感染病原體檢測(cè)中具有較高的敏感性、準(zhǔn)確性及全面檢測(cè)的能力。宏基因組測(cè)序作為一種綜合性、定量、敏感性高的檢測(cè)方法，在運(yùn)行過(guò)程中能鑒定出耐藥基因，是重癥感染、特殊感染、難以明確診斷的血流感染的理想診斷工具。

2.4 宏基因組測(cè)序的其他部位感染中的應(yīng)用宏基因組測(cè)序除了在前述系統(tǒng)中運(yùn)用較多，在其他部位感染性疾病中的運(yùn)用也有報(bào)道。RUPPE 等[47]對(duì)24例骨關(guān)節(jié)感染患者的樣本行培養(yǎng)、宏基因組測(cè)序，結(jié)果顯示，8例培養(yǎng)為單菌標(biāo)本中，宏基因組測(cè)序病原菌檢出率為100%，抗菌藥物敏感性預(yù)測(cè)為94.1%。16例多微生物樣本中，物種水平上，宏基因組測(cè)序的靈敏度為58.2%；屬水平上，靈敏度提高到74.5%。宏基因組測(cè)序檢測(cè)出培養(yǎng)法未發(fā)現(xiàn)的273 種細(xì)菌。該研究表明宏基因組測(cè)序在骨關(guān)節(jié)感染病原菌檢測(cè)中具有較好的運(yùn)用優(yōu)勢(shì)，能在物種水平上鑒定細(xì)菌，能同時(shí)檢測(cè)出多種細(xì)菌，檢測(cè)敏感性及效率較高，能為治療骨關(guān)節(jié)感染定制抗生素方案。DOAN 等[48]對(duì)6例患者眼內(nèi)標(biāo)本進(jìn)行宏基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，3例分別檢測(cè)出單純皰疹病毒1型、新生隱球菌、弓形蟲，該結(jié)果被免疫法證實(shí)，通過(guò)針對(duì)病原體的治療，病情均改善；病例4和5 樣本未發(fā)現(xiàn)病原菌，與臨床實(shí)際相符合；病例6為16年雙眼慢性葡萄膜炎，PCR 技術(shù)病毒檢測(cè)陰性，眼內(nèi)液宏基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)風(fēng)疹病毒，該結(jié)果被Sanger測(cè)序證實(shí)。該研究表明宏基因組測(cè)序可以利用較少的眼內(nèi)液鑒定葡萄膜炎感染病原體，以其獨(dú)特的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)成功運(yùn)用于眼內(nèi)感染病原體檢測(cè)，為眼睛感染診治提供一種新的檢測(cè)工具。

宏基因組測(cè)序已在多個(gè)系統(tǒng)感染性疾病病原體檢測(cè)中成功運(yùn)用，可同時(shí)檢測(cè)感染樣本中的細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等多種病原菌，可高效、準(zhǔn)確、全面識(shí)別病原菌，提高臨床對(duì)感染性疾病的早期診斷及治療水平，改善臨床預(yù)后。

3 宏基因組測(cè)序在感染性疾病病原體檢測(cè)中存在的不足與展望

宏基因組測(cè)序技術(shù)越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注，多篇文獻(xiàn)報(bào)道了其在感染性疾病病原體檢測(cè)中成功運(yùn)用，但其運(yùn)用仍存在一些不足：（1）來(lái)自人類宿主細(xì)胞，正常微生物菌群和其他來(lái)源的富含核酸的樣本存在核酸污染，影響檢測(cè)結(jié)果，限制病原體檢測(cè)的總體敏感性；（2）臨床樣本中多樣性微生物的存在，使得結(jié)果解釋更加復(fù)雜，目前缺乏統(tǒng)一病原體相對(duì)豐度、序列讀數(shù)的界值，難以準(zhǔn)確區(qū)分感染、定植及污染；（3）參考數(shù)據(jù)庫(kù)不夠完整，甚至包含錯(cuò)誤信息，可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，甚至導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果無(wú)法分析；（4）測(cè)序成本仍較高，檢測(cè)費(fèi)用比許多其他臨床試驗(yàn)高，限制其廣泛運(yùn)用；（5）測(cè)序生成的大量數(shù)據(jù)在存儲(chǔ)和分析方面存在挑戰(zhàn)，需要大量技術(shù)及專業(yè)知識(shí)支持；（6）測(cè)序結(jié)果復(fù)雜多樣，缺乏統(tǒng)一的結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)報(bào)告解釋的通用指南。所以，宏基因組測(cè)序尚不能取代傳統(tǒng)的診斷方法，但可以作為一種補(bǔ)充測(cè)試，在常規(guī)檢測(cè)法無(wú)法揭示診斷、重癥感染或免疫功能嚴(yán)重受損的患者，可作為最后的手段來(lái)嘗試識(shí)別感染過(guò)程。

宏基因組測(cè)序彌補(bǔ)傳統(tǒng)病原體檢測(cè)法的局限性，以無(wú)偏移采樣，識(shí)別已知的和罕見(jiàn)的病原體，甚至發(fā)現(xiàn)新的病原體，允許對(duì)這些病原體進(jìn)行物種級(jí)別的鑒定，通過(guò)測(cè)序讀數(shù)的計(jì)數(shù)，提供各種病原菌濃度的定量或半定量數(shù)據(jù)，有利于在多微生物樣品中精確鑒定病原菌，對(duì)各個(gè)系統(tǒng)感染鑒定均有較好的運(yùn)用價(jià)值，在以后的研究中，需進(jìn)一步確定標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范的操作流程，制定結(jié)果分析指南，通過(guò)技術(shù)升級(jí)及改進(jìn)降低檢測(cè)成本，完善參考數(shù)據(jù)庫(kù)信息，期待宏基因組測(cè)序技術(shù)在感染性疾病診治中更深入、廣泛的使用，在耐藥基因及藥敏檢測(cè)中有所突破，進(jìn)一步提高感染性疾病的精準(zhǔn)診治能力。